再構成された基底膜を越えた異なる細胞種間の間接的相互作用を研究するための三次元共培養法

Summary

本記事では、再構成された基底膜によって分離された2つの細胞タイプの三次元共培養を簡易に説明し、専門的な機器をほとんど必要とせず、さまざまな実験技術で容易に解析できる方法を詳述します。

Abstract

三次元(3D)共培養は、in vitro 実験を用いて細胞間相互作用を正確に研究しようとする研究者向けの急速に進化している技術です。細胞外環境間の相互作用が限られ、細胞形態が乱れるなど単層細胞培養の限界は、 生体内 の細胞環境をシミュレートすることで解決されます。構造的支持を提供する足場を用い、生物学的に活性化された細胞外マトリックス成分を含めることで、3D培養は組織により一致した挙動や形態を示します。このような3D環境に複数の細胞タイプを組み込むことで、バイオミメティックモデルシステム内で細胞間相互作用を研究することが可能になります。さまざまな3D共文化技術が登場し、それぞれに利点と課題があります。これらの技術は、しばしば専門的な機器、複雑なセットアップ、または特定の技術的知識を必要とします。また、再構成された基底膜によって分離された2つの細胞型間の間接的な細胞間相互作用を研究するための標準化された手法もいくつか存在します。ここでは、基礎的な技術スキルのみを必要とし、より広く適用可能な材料を用いて基底膜を越えた間接的な細胞間相互作用を成功裏に再現する3D共培養法を説明します。細胞の単層はマトリゲルという細胞外マトリックスの層で覆われ、その上に第二の細胞タイプがシードされます。結果として得られた共培養は5日間維持され、その後免疫蛍光による形態変化の分析、またはより詳細なゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオーム解析のために共培養から抽出されます。このプロトコルは、基底膜によって物理的接触が禁止されている場合に細胞間コミュニケーションが細胞行動に与える影響を研究するのに理想的です。研究者がより in vivoに関連する 細胞培養方法を選び続ける中で、高い参入障壁を避けるためには効率的なアプローチが必要です。

Introduction

in vitro細胞培養は堅牢で迅速、かつ広く使われている研究技術です。従来の細胞培養法は強力ですが、生体内環境とは大きく異なります。単層細胞培養の空間的に制限された性質は、遺伝子発現、形態、生化学に変化をもたらします^1,2,3。三次元(3D)培養技術はこの差異に対応し、細胞を臓器や組織に存在する細胞外マトリックス(ECM)を模した足場で培養します。3D培養では、細胞は生体内で見られる形態や挙動に近い形を示します(^4,5)。しかし、3D培養だけでは生体内微小環境の多くの構成要素を完全に再現することはできません。なぜなら、他の細胞タイプからの寄与が不足しているからです^。6。

直接的(細胞間の接触)および間接的な細胞間相互作用は、生体内での細胞の挙動に大きな役割を果たします ^7,8。これらの相互作用を再現するには、3D共培養モデルが必要であり、複数の細胞タイプを3D環境で同時に培養します。これらの技術を用いることで、in vivoに似た成長環境をvitroで確立でき^、結果の生物学的関連性が向上します^9,10。しかし、特定の実験に必要な環境がより具体的であればあるほど、その方法論はより複雑になります。基底膜マトリックスによって分離された細胞間の細胞間相互作用を研究するための標準化されたモデルシステムが存在しません。そのため、このプロトコルは基底膜マトリックス上で起こる細胞間相互作用を堅牢かつ再現性の高い方法でシミュレートするよう設計されました。この技術は、既に確立された3D培養モデル¹¹を基に、マトリゲル層(以下ECMゲルと呼ばれる)を用いて、培養中の異なる2種類の細胞を物理的に分離しつつ、分泌因子が通過できるようにします。もともとは脂肪細胞が間葉質乳がん細胞に与える間接的な影響を研究するために設計されましたが、さまざまな細胞タイプに対応するために容易に改変可能です。この方法が特定の実験デザインに適切かどうかは慎重に検討されるべきです。この方法は細胞間直接的な相互作用を許さないため、基底膜マトリックスを介した細胞間の間接的なコミュニケーションを含むin vivoシナリオのモデル化に限定すべきです。例えば、このシステムは細胞傷害性T細胞と腫瘍細胞の相互作用をモデル化するには理想的ではありません。なぜなら、両者は一般的に直接的に相互作用するからです。代わりに、基底膜が自然に関心のある2つの細胞タイプを分離する生物学的シナリオを考えてみましょう。例えば、この方法は浸潤前の腫瘍細胞と血管内皮細胞の相互作用の研究に応用可能です。

一般的な代替的な3D共培養手法としては、特殊なマイクロ流体チップ、すなわち「オルガンオンアチップ(OoC)」の使用があります。OoCシステムは強力で個別の実験に合わせてカスタマイズ可能ですが、チップ設計、材料選定、周辺機器、最適化、^{データ収集に}多大な時間とリソースを投入^{する必要があります。}さらに、現在、基底膜マトリックスの生物学的および物理的手がかりを提供しつつ、マイクロ^{流体流動を}妨げない標準的な材料や方法は存在しません。したがって、基底膜を越えた細胞間相互作用の研究にOoC技術を適用することはさらなる課題を生み出します。このプロトコルで示された方法は、生物学的関連性とアクセス性を維持しつつ標準化された代替案を提供することを目指しています。

Protocol

このプロトコル(図1A)は、基底膜マトリックス上で細胞間相互作用を再確認するための3D共培養システムを概説しています。下流解析は、共焦点顕微鏡(図1B)や共培養内の細胞採取(図1C)を用いて可能です。ECMゲルの層を2つの細胞集団の間に挟む「サンドイッチ」構造を使用することで、専門的な装置を必要とせず、現代の細胞培養技術の基礎知識をもとに実施可能です。

1. 3D 共培養調製

注:本プロトコルは、3T3-L1脂肪細胞およびMDA-MB-231乳がん細胞を用いた3D共培養法の代表的な応用を意図しています。異なる細胞タイプの使用には、細胞シーディング密度の最適化とECMゲルロットの事前試験が有効性を確保する必要があります。このプロトコルは、無脂肪細胞コントロールおよびコンディショニングメディアコントロールの使用に対応しています。実験目的によっては、より多くのコントロールが必要になる場合があります。

1. 細胞培養および溶液調製
   1. 3T3-L1前脂肪細胞およびMDA-MB-231乳がん細胞株の培養を取得し、確立します。クラスIIの生物学的安全キャビネットおよび標準的な接着細胞培養法を用いて、無菌技術を用いてすべての細胞を独立して培養・維持する¹⁵。ダルベッコ改良イーグルメディア(DMEM)に3T3-L1細胞を維持し、10%(v/v)新生児子牛血清(NBCS)および1%ペニシリン・ストレプトマイシン(10,000 U/mL)を補足します。RPMI 1640にMDA-MB-231細胞を10%胎児用牛血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)を補足して維持します。
      注意:維持中は3T3-L1細胞が80%のコンフルエンスを超えないようにし、20^番目の 通過番号以降の培養は使用しないでください。
   2. 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、pH 7.4 のリン酸緩衝塩水(PBS)1xのストック溶液を取得または調製します。
   3. PBS-グリシン洗浄液50 mLを、0.375 gのグリシンを50 mLのPBSに加え、最終グリシン濃度100 mMを製造します。溶液は4°Cで最大12ヶ月間保存します。
   4. 50μLのトリトンX-100を9.5mLのPBSに加え、10mLの透過バッファーを準備します。最終濃度0.5%(v/v)トリトンX-100を10mLまで充填します。4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用してください。
   5. 50 μgの免疫蛍光バッファーを、50 μgの牛血清アルブミン(BSA)、100 μLのトリトンX-100、25 μLのTween-20から45 mLのPBSを加えて調製します。最終濃度は50mLまで充填し、最終濃度は0.1%(w/v)BSA、0.2%(v/v)Triton X-100、0.05%(v/v)Tween-20です。4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用してください。
   6. 動物血清1mLをIFバッファー9mLに加え、最終濃度10%血清を10mLのブロッキングバッファーで準備します。4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用してください。
      注:血清の種同定は、使用された二次蛍光抗体の宿主種に依存します(2.2.4参照)。
   7. ECMゲル(総タンパク質濃度~9-9.5 mg/mL)を4°Cで一晩解凍します。500μLのアリコートを1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに準備し、-20°Cで保存します。
      注意:ECMゲルは非常に変動が大きいため、各細胞タイプで期待される挙動を誘導するために検証が必要です。細胞タイプによってはタンパク質濃度やマトリックス剛性が異なる場合があります。
      注意:室温での重合を防ぐため、ECMゲルを扱う際は必ず予備冷却済みのピペットチップと容器を使用してください。取り扱い中は必ずECMジェルを氷の上に保管してください。
2. 脂肪細胞分化
   1. 50,000から80,000個の3T3-L1前脂肪細胞を0.5mLの標準培養培地に、4ウェルのチャンバースライドの2ウェルにシード。空の井戸は脂肪細胞ゼロおよび条件付きメディア制御に使用されます。
      注:チャンバースライド細胞培養は機械的破壊を受けやすいです。媒体の真空吸引を避け、手動ピペットで優しいピペッティング技術を用いてください。
   2. 標準培地0.5mLに50,000から80,000個の3T3-L1前脂肪細胞を24ウェル組織培養プレートの1ウェルにシードします。これは条件付きメディア制御のために利用されます。
   3. 両文化が24時間で100%合流に達することを許してください。
   4. 脂肪生成を開始する培地を、DMEMに10%FBS、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、1μMデキサメタゾンを補足した脂肪生成開始培地に置き換えることで開始します。細胞は5%_CO2 インキュベーターで37°Cで48時間培養します。
   5. 48時間後、使用済み培地を新しい脂肪生成進行培地に置き換えます。これはDMEMに10% FBSおよび10 μg/mLインスリンを含みます。細胞を5%_CO2 インキュベーターで37°Cでさらに48時間培養します。
   6. 3D共培養を続ける前に、>60%の細胞に脂質滴が存在するかどうかを目視で確認してください。脂質滴の蓄積が遅い場合は、進行媒体をDMEMに置き換え、10%のFBSを補足し、脂質含有量を24時間ごとに監視してください。
3. 3D共文化のオーバーレイと維持
   1. ECMゲルを4°Cで一晩溶かし、その後オーバーレイを続けます。
      注:ロットごとの変動性の影響を避けるため、単一の研究内のすべての実験で同じロットのECMゲルを使用することが推奨されます。
   2. 3T3-L1の分化に成功した後、使用済みの培養培地を取り出し、約50μLの小さなバッファーを残します。
   3. チャンバースライドの各脂肪細胞含有ウェルに110μLのECMゲルを慎重に添加し、脂肪細胞単分子層を乱さないよう注意してください。
      注意:ECMゲルは室温で急速に固化します。マトリックスの早期重合を防ぐため、ECMゲルは常に氷に保管し、-20°Cで予備冷却した先端を使用してください。
   4. 空の無脂肪細胞コントロールウェルに110μLのECMゲルを加えます。マトリジェルを均一に広げるには、井戸の隅と中央に滴り下がって加えます。ピペットの先端を使って、マトリジェルをそっと培養面に広げ、こそげずに塗ります。
   5. スライドを37°Cで1時間インキュベートし、ECMゲルの重合を待つ。
   6. このインキュベーション段階でMDA-MB-231細胞を採取し、計数します
      オプション:これらの細胞の蛍光標識についてはステップ1.4を参照してください。
   7. 2%のECMゲル(v/v)を含む乳髄増殖培地に、30,000細胞/mLの薄めたMDA-MB-231細胞の懸液を製製します。
      注意:最適な細胞シーディング密度は細胞タイプによって異なり、実験前に最適化する必要があります。注:乳腺増殖培地は、乳腺上皮細胞に最適化された市販の細胞培養培地です。0.4%の牛下垂体抽出物、10 ng/mLの表皮成長因子(組換えヒト)、5 μg/mLのインスリン(組換えヒト)、および0.5 μg/mLのヒドロコルチゾンが含まれています。共培養培地は、両方の細胞タイプのニーズに合わせて慎重に選ばなければなりません。
   8. ECMゲルが重合したら、各ウェルにMDA-MB-231懸濁液450μLを優しく加えます。これにより、1ウェルあたり13,500セルの総セル数が得られます。
      注:この段階で細胞懸濁液がゲルの上に不均一に重なっている可能性があります。チャンバーの側面を目視で確認し、チャンバーの全面を優しく叩いて均等に分散させます。
   9. 24ウェルプレート上の脂肪細胞培養に、2%ECMゲル(v/v)を含む乳巣増殖培地450μLを加えます。48時間ごとに収穫・メディア交換。
   10. 共培養は最大5日間維持し、培地は48時間ごとに交換してください。
       注意:真空吸引は控え、優しいピペッティングを使用してください。ECMゲルの剥離は共培養メンテナンス中に発生する可能性のある問題です。
   11. 条件付き培地コントロールの良好な方法としては、希釈採取された脂肪細胞(ステップ1.3.9以降)と、新鮮な培地と1:1の調理を行い、2日目と4日目に使用済みの共培養培地を置き換えました。
       注:この時点で共培養期間は終了し、培養物を固定・染色して形態やマーカー発現を明らかにする( 第2節参照)か、共培養環境から細胞を抽出し、下流解析のために細胞を準備する( 第3節参照)で解析を行う必要があります。
4. 蛍光細胞標識(オプション)
   注:重ねられた細胞の標識は、免疫蛍光画像撮影時に重ねた細胞の同定を助けるために、ステップ1.3.7の前に行うことができます。
   1. カルボキシフルオレセインジアセテートスキニミジルエステル(CFSE)の5 mMストック溶液を、10 mgのCFSEを4.22 mLのDMSOに溶かして調製します。光から保護され、500μLのアリコートで-20°Cで保存します。
   2. ステップ1.3.6の細胞数の後、PBS5mLで細胞を一度洗浄します。得られたペレットを1x PBSで再懸浮させ、最終濃度1,000,000 cells/mLにします。
   3. 細胞懸濁液1mLあたり5 mM CFSEを1 μL加え、最終作業濃度5 μMにします。細胞懸濁液を室温で光から保護して20分間培養します。
   4. CFSE染色を5巻の培養培地を加えて消し去ります。室温でさらに5分間孵化します。
   5. 残留CFSEを除去するためにペレット細胞を2回PBSで洗浄します。細胞を予温化された乳腺成長培地に再懸浮させます。染色料が残っていないことを確認するために、室温でさらに10分間培養します。
   6. ステップ1.3.7で説明された蛍光標識細胞の種子。プロトコルの残りの部分は説明通りに実行可能です。

2. 免疫蛍光

1. 固定
   注意:ECMゲルの脱重合や洗浄中の試料損失を防ぐため、使用前にすべての試薬を室温に平衡させてから~30分ほど待ってください。
   1. 共培養5日後、培地を500μLのPBSに置き換えます。
      注意:ステップ2.1.2から2.3.7は、無菌でない環境で実施可能です。
   2. PBSを除去し、室温で10分間新鮮に調製したPBSに2%パラホルマルデヒド(PFA)を置き換えます。
      注意:ECMゲルはPFAに敏感で、ゲル層の剥離を引き起こす可能性があります。
      注意:PFAは時間とともにホルムアルデヒドに分解されます。PFAを扱う際は、排気ガスの吸入を避け、十分な換気を確保し、必ず適切な個人用防護具(手袋、白衣、眼を保護する)を着用してください。
   3. PFAを除去し、500μLのPBS-グリシン洗浄液で15分間室温で優しく攪拌しながらウェルを洗浄します。
      注:PBS-グリシンウォッシュの使用は、遊離アルデヒドが背景蛍光を発生させるのを防ぐために非常に重要です。グリシンなしのPBSで洗わないでください。
   4. ステップ2.1.3を2回繰り返し、合計3回洗います。保管条件については2.1.5を参照し、不要ならステップ2.2.2に飛ばしてください。
   5. この時点でプロトコルは最大1週間停止でき、スライドは4°Cで保存可能です。 スライドを保存するには、すべてのウェルに1mLのPBSを充填し、チャンバースライドのカバーを薄いパラフィルムのリボンで密封します。スライドを光に遮る容器に平らに置き、湿らせた繊細な組織の上に置いて培養液が乾燥しないようにします。
2. 抗体染色
   1. 以前に保存していたスライドを室温に移し、PBSを取り除き、500μLの新鮮PBSでウェルを15分間優しく攪拌しながら洗浄します。ステップ2.1.4から直接進む場合はこのステップを飛ばしてください。
   2. 500μLの透過バッファーを室温で15分間攪拌せずに細胞を浸透させます。
   3. 500μLのPBSでウェルを洗浄し、15分間優しく攪拌します。これを2回繰り返し、合計3回洗います。
   4. 各ウェルに500μLのブロッキングバッファーを加え、室温で1時間優しく攪拌しながら培養します。
      注意:ブロッキングバッファー内の血清のソース種が二次抗体の宿主種と一致していることを確認してください。このプロトコルでは、ドンキー血清とドンキー二次抗体を使用します。
   5. 製造者の推奨に従い、IFバッファー内の関心のある一次抗体を希釈してください。ブロッキングバッファーを取り除き、各ウェルに希釈抗体溶液300μLを加えます。
   6. チャンバースライドのカバーをパラフィルムで密封し、スライドを遮光容器に入れます。4°Cで一晩、優しく攪拌して培養します。
   7. 500μLのIFバッファーでウェルを洗浄し、15分間の優しく攪拌します。これを2回繰り返し、合計3回洗います。
   8. メーカーの推奨に従い、IFバッファー内で適切な蛍光標識セカンダリー抗体を希釈してください。各ウェルに300μLの二次抗体希釈液を加え、室温で穏やかに攪拌しながら1時間インキュベークします。
      注意:この工程以降は長時間の光曝露を避け、光漂白を抑えてください。
   9. ステップ2.2.7を繰り返します。
   10. PBSで4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)1:800の300μMストック溶液を希釈します。各ウェルに300μLを加え、室温で20分間優しく攪拌しながら培養します。
   11. 細胞を500μLのPBSで5分間、優しく攪拌しながら洗浄します。一度繰り返します。
3. スライドマウント
   1. 培養を乱さずにできるだけ残留PBSを除去してください。蓋を交換し、チャンバースライドメーカーが提供した工具を使ってチャンバーとガラススライドを分離してください。
   2. 繊細なタスクティッシュを使い、ECMゲルを乱さずに残留PBSを除去するためにスライドの縁を拭き取ります。
   3. シリンジと18Gの針を使って、スライドの縁にシリコーンシーラントをゆっくりと塗りつけます。シリコンが固まるまで3分ほど置いてください。
   4. シリコーンが固まる間、各ウェルにアンチフェードマウンティングメディアを1〜2滴加えます。泡は避けましょう。気泡ができた場合は、培養物を傷つけないようにピペットで慎重に除去してください。
   5. シリコーンが固まったら、ガラスカバースリップを浅い角度で優しく下ろします。カバースリップを下げる際には、ピンセットやピペットチップを使って気泡を排出します。カバースリップが割れないように優しく圧力をかけてください。
   6. スライドを室温の耐光容器に入れて一晩固めます。スライドは4°Cで保存でき、プロトコルは最大1週間停止されます。
      注意(オプション):スライドをより密閉するには、カバースリップの縁にクリアネイルポリッシュを塗布してください。
   7. 共焦点蛍光顕微鏡を用いた画像スライドを10〜20倍倍の倍率で撮影します。オペレーターバイアスを最小限に抑えるために、5つのランダムな視野をキャプチャします。

3. 下流解析のための共培養の収穫

注意:細胞や生体分子の採取は免疫蛍光と両立しません。他の下流解析用の共培養は、セクション1および2で述べた同じ細胞濃度と体積を用いて、標準的な24ウェル培養皿で培養することが推奨されます。

1. 細胞抽出
   1. 使用済みの培地を取り除き、氷のように冷たいPBSで優しくウェルを洗います。これを1回繰り返し、合計2回洗います。
   2. ワイドボアピペットの先端を使い、氷冷セル回収液1mL(以下回収液と呼びます)を加えます。優しく上下にピペットを動かしてECMゲル層を乱します。液体を1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
      注:細胞回収液は、ECMゲルに埋め込まれた細胞を優しく解放するために設計された市販の非酵素溶液です。これは独自の組成であり、特定のセルタイプとは互換性がない場合があります。代替案として、DispaseやAccutaseのような穏やかなプロテイナーゼを用いたECMゲルの酵素的脱重合が検討されることがあります。これには37°Cの孵化と培養時間の最適化が必要です。
   3. 各ウェルに250μLの氷冷回収液を加え、残った細胞を回収します。対応するマイクロ遠心分離機チューブに移します。
   4. チューブを4〜5回インバートして混ぜます。
   5. チューブを氷に移し、60分間優しく攪拌しながら孵化させます。10分ごとに2〜3回チューブを倒さし、チューブの内容物の沈降を防ぎます。
   6. 遠心分離機チューブは300 x g で4°Cで5分間
   7. 目に見える細胞ペレットの存在を確認しましょう。上澄液を慎重に取り除き、氷で冷めた1xPBSを1mL加えます。遠心分離機で300 x g で4°Cで5分間加熱します。 これを1回繰り返し、合計2回洗います。ペレットには最初にシードされた細胞の80〜90%が含まれ、各細胞タイプの割合は一定のままです。
      注意:この時点で細胞ペレットを溶解してタンパク質や核酸を採取できます。溶解ペレットは-80°Cで保存でき、プロトコルは3ヶ月間一時停止可能です。Lysisは3.2と互換性がありません。
2. 単一セル懸濁液の準備
   1. 0.25%トリプシン-EDTAを含んだ200μLのペレットを再懸浮します。その後、37°Cで3〜4分間培養します。
   2. トリプシン消化を抑制するために600μLの完全成長培地を加えます。
   3. 室温で300 x g の遠心分離機で5分間加熱します。上澄液を取り除き、室温のPBSを500μL加えます。
   4. 室温で300 x g の遠心分離機で5分間加熱します。これを1回繰り返し、合計2回洗います。
   5. 80μLのPBSに0.04%BSAを含み、40μmのセルストレーナーでろ過を懸浮させます。
   6. 5 μLの懸濁液を5 μLのトリパンブルーに希釈します。細胞数を数え、血球細胞計で生存可能性を評価します。セルは現在、下流解析の準備が整っています。

Results

細胞間相互作用の効果を基底膜を越えた研究におけるこのプロトコルの有効性を示すため、 図2 および 図3 は以前の論文(Pallegarら¹⁶)から代表的なアウトカムとして再利用されています。 図4 と 図5 は新規データであり、このプロトコルが非乳がん細胞に適応し、共培養環境から細胞を採取して下流で使用することを示すために生成されました。

この方法を用いた共培養に成功すると、関心のある細胞タイプの明確な形態的特徴を測定・解析できる鮮明な画像が得られます(図2)。共培養に選ばれる細胞の同一性や細胞間相互作用の程度によって、形態学的変化は異なる場合があります。形態の変化は、形態...

Discussion

従来の細胞培養における複雑な細胞間相互作用の欠如は、薬物反応や疾患進行をより正確に体内で研究するために、臓器や組織モデルの改善の必要性を浮き彫りにしています。3D共培養システムの発展により、細胞間相互作用の結果を生体内研究なしで研究できるようになり、このギャップを埋めるのに貢献しました(^9,12)。しかし、これらの方法の多くは機械的に複雑であり、^10,12を設置するには多大な資源、時間、技術的経験が必要です。対照的に、私たちのプロトコルは標準化された実験技術を用いており、具体的な技術的経験は最小限で済みます。また、このプロトコルに必要な資料はより一般的に適用可能であり、この方法外でも有用である可能性が高いです。

このプロトコルの鍵となるのは、物理的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24ウェル組織培養プレート	コーニング	3524
24×60mmカバーガラス	アルティデント・サイエンティフィック	170-C2460
PBS中の4%パラホルムアルデヒド	インビトロジェン	J61899。AK	1xPBSで2%まで希釈した
4井戸チャンバー培養スライド	ファルコン	354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab フラグメント Donkey Anti-Goat IgG(H+L)	ジャクソン免疫研究所	705-607-003
ブライトライン血球計	ハウサー・サイエンティフィック	3120
CellTrace CFSE増殖キット	インビトロジェン	C34570
セルリカバリーソリューション	コーニング	354253
ダピ	シグマ・オルドリッチ・カナダ社	D9542
ドンキー抗マウスIgG(H+L)交差吸着二次抗体、DyLight 594	インビトロジェン	SA5-10168
ロバウサギ抗IgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa fluor 647	インビトロジェン	A31573
DMEM/F-12、フェノールレッドなし	ギブコ	21041025
ダルベッコ修飾イーグル培地、高グルコース、ピルビン酸	ギブコ	11995-065
胎児用牛血清、カナダ起源	ギブコ	12483-020
フローミセルストレーナー、40 & micro;M	ベルアート	136800040
GEアドバンストシリコーン窓とドア、クリア	ヘンケル・インターナショナル	2811093
ヤギ多クローナル抗ZO-1	サンタクルーズ・バイオテクノロジー	SC8146	一次抗体は中止中止
ラットモノクローナルアンチZO-1	サンタクルーズ・バイオテクノロジー	SC33725	廃止されたSC8416抗ZO-1薬の代替一次抗体
乳腺上皮細胞基底培地	プロモセル	C-21210
マトリゲル、フェノールレッドフリー、成長因子低減、LDEVフリー	コーニング	356231	タンパク質濃度:9〜9.6 mg/mL
マウスモノクローナル抗ビメンチン	シグマ・オルドリッチ・カナダ社	V2258	一次抗体
新生児の子牛血清、ニュージーランド起源	ギブコ	16010159
ペニシリン・ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122
リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4	ギブコ	10010023
プロロング ゴールド アンチフェイド マウント	インビトロジェン	P36934
精製マウスアンチE-カデリン	BDバイオサイエンス	610181	一次抗体
ラビット多クローナル抗クラウディン7	アブカム	AB27487	一次抗体
RPMI 1640、グルタミン	ギブコ	11875-093
サプリミックス	プロモセル	C-39115
トリパンブルーステイン(0.4%)	ギブコ	15250-061
トリプシン 0.25%-EDTA	ギブコ	25200056