柑橘類皮エキス中の総フェノールおよびフラボノールの決定およびプロファイリングのための統合マイクロプレートおよびHPTLC戦略

サマリー

本研究は、柑橘類ピーリング中のフラボノール/5-ヒドロキシフラボンおよびフェノール化合物のHPTLCプロファイリングと定量のためのAlCl₃/Folin–Ciocalteu結合アプローチを提示し、マイクロプレート解析を補完します。

要約

フェノール化合物やフラボノイドは、柑橘類副産物の抗酸化活性および機能的価値に大きく寄与しています。しかし、従来の比色測定法は広く使われているものの、クロマトグラフィー分離が不足し、化学的干渉の影響を受けることがあります。このプロトコルは、マイクロプレート分光光度測定法と高性能薄層クロマトグラフィー(HPTLC)を組み合わせた統合分析ワークフローを提示し、柑橘類皮エキス中の総フェノール含有量(TPC)、総フラボノールおよび5-ヒドロキシフラボン含有量(TFHC)の決定とプロファイリングを行います。石灰(Citrus aurantifolia)およびマンダリン(Citrus reticulata)皮のエタノリック抽出物は、Folin–Ciocalteu(FC)および塩化アルミニウム(AlCl₃)アッセイを用いて96ウェルマイクロプレート形式で評価され、その後、2つの連続移動相と二重クロマトグラフィー後誘導を用いたHPTLC分析が行われました。マイクロプレート測定では、石灰のTPC値は74.2 mmol/g、マンダリンは72.8 mmol/g、TFHCはそれぞれ15.5 mmol/g、6.0 mmol/gでした。HPTLC分離により、石灰中に4つのフェノール帯、マンダリン中に6つのフェノール帯が分離されました。AlCl₃誘導化後に選択的に2つの石灰帯が確認され、これはフラボノールまたは5-ヒドロキシフラボンと一致しています。HPTLCが推定したフェノール劣化物の合計は、石灰で22.0mmol/g、マンダリンで20.8 mmol/gであり、TFHCは石灰で13.4 mmol/gに達し、マンダリンでは検出されませんでした。これらの発見は、マイクロプレートアッセイが総成分の迅速かつ高感度な推定を提供する一方で、HPTLCは化合物分離や機能群特異的誘導化を通じて選択性を高めることを示しています。この複合戦略により、高スループットスクリーニングとクロマトグラフィー確認が可能となり、複雑な植物行列の植物化学的特性評価のための実用的かつ再現性の高いプラットフォームを提供します。

概要

柑橘類の皮はジュース業界の副産物であり、抗^{酸化物質などの}機能性化合物の存在が実証されています。神経保護食品として使われ^{てきました。2}、抗炎症、抗ニキビの化粧品³、食品添加物として。これらのバイオ活性のいくつかはフラボノイド⁵およびフェノール化合物⁶に起因しています。文献では、フラボノイドおよびフェノールの総量を推定する一般的な方法が確立^{されており、最も一般的な}のは総フェノール含有量(TPC)⁸のフォリン・チョカルテウ法と、分光光度法による全フラボノイド化合物(TFC)⁹の塩化アルミニウムです。フォラン・シオカルトー法は1927年に初めて発表されました^{。これは、}リントングスティック-リンホモリブディック化合物の酸化還元反応に基づくフォラン-ドニ反応¹¹の改良に基づいています。フォリン・シオカルトー法はフェノール化合物の還元能力を測定^します。塩化アルミニウムとフラボノイド試験は1960年に初めて提案され、金属配位子とフラボノイド配位子間の錯体に基づいて¹³。

両分光光度測定法は、植物材料中に一般的に見られる植物化合物の全体含有量を推定・比較する際に有用なツールです。しかし、さまざまな制限があります。例えば、外部標準¹⁴の使用にはいくつかの制限が生じます。標準の化学的性質が信号応答に有意な影響を与えないと一般的に想定されています。実際には、モル吸着率は共役やその他の構造的特徴などの要因に依存し、天然物で標準化が難しいため、この仮定の検証は困難です。例えば、Appelらは11種のオークからTPC^を評価 し、いわゆる「自己標準化」アプローチを開発し、キャリブレーション曲線の傾きで50%以上の差を報告しました。自己標準利用は、サンプル中に存在する化合物の組成を再現し、実際の総フェノール含有量(TPC)に近いものを提供するために設計された戦略^です。自己標準化は反応基と平均分子量の比率についても提供します。しかし、標準化は手間がかかり、困難です。

塩化アルミニウム複合体に基づく全フラボノイド化合物アッセイは、最近の研究^17,18で批判的に評価されており、AlCl₃はフラボノイドの2サブグループであるフラボノールと5-ヒドロキシフラボンと特異的に複合体を形成することが結論づけられました。一般的に、フラボノールは約440 nmで最大吸収を示しますが、5-ヒドロキシフラボンは約415 nmで吸収します。さらに、特定のフラボノイドは誘導化がなくても415〜440 nmの範囲で内在吸収を示すことがあり、複合体による吸収率の増加は化合物ごとに異なります。さらに、両方の比色測定法は分離を欠いているため、異なるフェノール成分を区別できません。この機能は総内容数の推定には有利かもしれませんが、特異性は限定的です。これらの考慮事項は、比色検出前に個々の成分を分解し、真のアッセイ応答とスペクトルや化学的干渉を区別する分析戦略の必要性を強調しています。

これらの制限があるにもかかわらず、このようなアッセイは植物および果実抽出物中のバイオアクティブフェノール化合物の一般的なスクリーニングにおいて依然として貴重なツールであり続けています¹⁹。潜在的な干渉を評価するために、Folin–Ciocalteu試薬およびAlCl₃試薬の両方で明らかになった高性能薄層クロマトグラフィー(HPTLC)法が効果的なアプローチを示しています。クロマトグラフィー分離により、複合体化前に既存の吸収帯を持つ干渉物質の検出が可能となり、写真記録により複数の吸収最大値を同時に解析できます。さらに、HPTLC分析はHPLC–MS/MSのようなより包括的なクロマトグラフィー技術に比べて、溶媒消費量の低減、複数の試料(1プレート最大18個)を同時処理するため分析時間の^{短縮、クロ}マトグラフィー後の^{誘導化の選択}性による複雑な混合物の解釈の促進など、いくつかの利点があります。

本研究では、高性能薄層クロマトグラフィー(HPTLC)分離を用いて、柑橘類皮エキス中の総ポリフェノール含有量(TPC)および総フラボノール、さらに5-ヒドロキシフラボン(TFHC)を含む特定の化合物を決定する統合プロトコルを提示し、マイクロプレート比色測定に基づく一般的な含有量推定も行います。フェノール化合物の平面クロマトグラフィー定量はFolin–Ciocalteu試薬を用い、塩化アルミニウム誘導はフラボノールおよび5-ヒドロキシフラボンに対応するバンドのクロマトグラフィー同定に専念されます。このアプローチでは、TFHCの決定はアルミニウム塩化物錯体による定量ではなく、クロマトグラフィーで分解され化学的に同定された化合物のフォリン–シオカルテウ応答に依存しています。HPTLC解析により化合物特異的な分離と可視化が可能となり、個々のフェノール成分の同定や潜在的なスペクトル干渉の検出が可能になります。さらに、マイクロプレートベースの分光光度法を提案し、総TPCおよびTFHCの迅速な推定を行い、複雑な植物行列に対する補完的な高スループットスクリーニングツールを提供します。

プロトコル

1. 果物の皮の準備

1. 果物から約50gの皮を取り、食用部分から分けてください。代表的な結果として、地元の店で(チリから輸入されたイサベリン品種)を買い、コスタリカのサンホセ近郊の木からライムを採取しました(バウチャー標本JVR-16434)。
2. 皮をプラスチックのジップロック袋に入れ、-20°Cで少なくとも2時間冷凍します。
3. 冷凍した皮を予冷の冷凍乾燥機に移し、袋を開けたまま、完全に乾くまで一晩真空(0.1 mbar)をかけます。
4. ブレードミルを使って乾燥した材料を約0.1mmまで粉砕します。

2. 抽出

1. 乾燥した挽いた柑橘類の皮(ライムまたはマンダリン)を約100mg重さで15mLのガラス管に入れます。
2. チューブに60%エタノールを3mL加えます。
3. 混合物を超音波浴槽で40°Cで10分間超音波処理し、植物細胞を破壊し、植物化学物質の放出を促進します。
4. サンプルを850× gで10分間遠心分離します。
5. エタノリック上清液をパスツールピペットで10mLのボリュームフラスコに慎重に移し、沈殿物の攪乱を避けます。
6. 湿った固体残渣を含むチューブに60%エタノールをさらに3mL加えます。
7. 上記の超音波処理および遠心分離のステップをステップ2.3および2.4で繰り返します。
8. 上澄液を同じボリュームフラスコに移し、前の抽出物と混ぜます。
9. 前述の手順(2.6–2.8)を繰り返して、3回目の抽出を行います。
10. 結合抽出物(≈9 mL)を0.1 mol/L HClの2滴で酸性化し(アントシアニンや他のフェノール化合物の安定性を高めるため)、メタノールで10 mLまで体積を上げます。
11. この手順は各サンプルごとに三重に行います。

3. マイクロプレート分光光度法による総フラボノールおよび5-ヒドロキシフラボン含有量(TFHC)

1. ケルセチンのストック溶液(100 μg/mL)または同等のフラボノイド標準液を準備します。
   1. ケルセチン10mgを0.1mgの精度で秤で計ります。
   2. ケルセチンを約5 mLの95%エタノールに溶かし、ストック溶液とラベル付けされた10 mLのボリュームフラスコに移します。
   3. ビーカーを95%エタノール2mLで2回洗い、洗い流しをフラスコに加えます。
   4. 60%エタノールで量を標的にします。
   5. 表1に従って1.5 mLのマイクロ遠心分離機管で標準溶液(10–100 μg/mL)とブランクを準備します。
   6. すべての試料と標準物質が0.2〜0.8の吸収範囲内に収まるようにし、必要に応じて濃度を調整してください。
   7. 図1に従って各ウェルに60μLのブランク、サンプル、または標準液を投入してマイクロプレートレイアウトを準備します。サンプルまたは標準サンプルごとに3回のレプリケートを行います。
   8. 塩化アルミニウム2%、酢酸ナトリウム5%、メタノール80%の水溶液を別々の試薬貯留槽に注入します。
      注意:塩化アルミニウムおよびメタノール溶液は注意して取り扱ってください。塩化アルミニウム溶液は刺激的であり、メタノールは摂取、吸入、皮膚吸収によって有毒です。肌や目を合わせないようにし、適切なPPEを着用してください
   9. 8チャンネルマルチチャネルピペットを用いて、各ウェルに10μLのAlCl₃溶液、10μLの酢酸ナトリウム溶液、200μLの80%メタノールを加えます。
   10. 中間強度で10秒振ってから暗闇で30分間孵化します。
   11. 415nmで吸収を測定してください。振る動作ができない場合は、培養前にマイクロピペットで手動で混合してください(図2)。
   12. 校正曲線から試料吸光度値を補間し、希釈、体積、質量補正を必要に応じて適用します。

表1:総フラボノールおよび5-ヒドロキシフラボン含有量(TFHC)の比較曲線に対するケルセチン標準量。この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

図1:全フラボノールおよび5-ヒドロキシフラボン含有量(TFHC)マイクロプレート解析のマイクロプレートレイアウト。(A) マイクロプレートのスキーム。(B) ソフトウェアGen5レイアウトプログラム。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:総フラボノールおよび5-ヒドロキシフラボン含有量解析のためのマイクロプレートソフトウェアセットアップ。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

4. マイクロプレート分光光度法による総ポリフェノール含有量(TPC)

1. ガリック酸標準曲線(0.000–0.120 mg/mL)を準備します。
   1. 分析天秤を使って約0.0123gのガリ酸(純度98%)を計量し、蒸留水に溶かします。
   2. 溶液を10 mLの容積フラスコに移し、2回すすぎて蒸留水でマークまで注ぎ、ストック溶液を得ます。
   3. ストック溶液1mLを蒸留水で10mLに希釈して作動溶液を準備します。
   4. 表2に従って作業液をさらに希釈して校正標準を準備します。
   5. 吸収度値が0.2〜0.8の範囲を超えた場合は濃度を調整してください。
   6. 市販試薬1:14を蒸留水で希釈して、フォリン–チョカルテウ作動試薬を準備します。
      注意:フォリン–シオカルテ試薬および塩酸溶液は腐食性があります。水しぶきや直接接触は避けてください。フムフード内で試薬取り扱いを行います。
   7. 各サンプル、標準サンプル、またはブランクを図 3Aのレイアウトに従い、3回のレプリケートを用いて96ウェルマイクロプレートにピペットします。
   8. 各ウェルにマルチチャネルピペットを用いて215μLのフォリン・シオカルテ作動試薬を加えます。
   9. 各ウェルに20%炭酸ナトリウム溶液50μLを加え、マイクロピペットで十分に混合します。
   10. プレートを40°Cで20分間攪拌しながらキュベートします(図3B)。
   11. 吸収を755nmで測定してください。

表2:総フェノール含有量(TPC)校正曲線に対するガリック酸標準物質の量。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

図3:全フェノール含有量(TPC)マイクロプレート解析のためのマイクロプレートレイアウトおよびソフトウェアセットアップ。(A) レイアウト。(B) ソフトウェアプログラム。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

5. 高性能薄層クロマトグラフィー分析に用いられる一般的な条件

1. 標準曲線
   1. 上記のセクション3およびセクション4で説明したように、ケルセチンとガリック酸(それぞれ100 μg/mL)のストック溶液を準備します。
   2. 2、4、6、8、10、12 μLの6レーンにガリック酸を塗布します。
   3. 同定のためにガリック酸とケルセチンをそれぞれ別のレーンに5μLずつ散布します。
2. プレートの配置:
   1. 固定相として、10×20cmのシリカゲル60 F₂₅₄アルミニウム裏面のTLCプレートを使用します。
   2. 適用パラメータを以下のように設定します:Y位置7.0mm、バンド長6.0mm、最初のX位置14.0mm、トラック間の距離9.4mm。
   3. 各バンドごとに各抽出物を10μLずつ、窒素を噴霧ガスとして散布します。
   4. 溶剤の前面距離を70mmに設定します。
3. プレートの発達:
   1. 移動相40mLを積んだ手動チャンバーでプレートを現像し、移動相とチャンバー壁に接触させて10分間チャンバー飽和を行い、移動相の蒸気がチャンバー大気を飽和させるのを助けます。
   2. MP1またはMP2のいずれかで現像し、指示があればダブル現像を行います。移動フェーズ1(MP1)は、酢酸エチル:蟻酸:酢酸:水(100:11:11:26)で構成されています。そしてトルエン製のMP2:酢酸エチル:蟻酸(5:4:1)です。
      注意:ヘムフード内でHPTLCプレートを現像してください。移動相成分(酢酸エチル、トルエン、蟻酸、酢酸)は揮発性であり、トルエンや酢酸エチルは非常に可燃性が高いです。蒸気の吸入を避け、点火源を排除しましょう。
   3. 皿は室温で乾かします。
4. 派生化
   1. フォリン・キオカルテ試薬(試薬300μL+50%エタノール600μL)を塗布し、ヒートガンで短時間乾燥させ、50%エタノールに10%炭酸ナトリウム1mLを噴霧します。
   2. 別途、他のプレートにも50%エタノールに1%塩化アルミニウムをスプレーしてください。
5. 色が安定しプレートが完全に乾くまで、ヒートガンで均一に加熱します。

6. 高性能薄層クロマトグラフィーによる全フラボノールおよび5-ヒドロキシフラボン含有量(TFHC)および総フェノール含有量(TPC)分析の開発

1. サンプルを三重レーンに適用し、ガリック酸およびケルセチン参照レーン(同定用として、ステップ5.1.4で説明)を行います。
2. MP1を使ってプレートを現像します。
3. MP2を使って再度プレートを現像します。
4. 前述のFC試薬を用いてプレートを誘導化します。
5. 白光照射と254nmおよび366nmの紫外線照射を用いてプレートを写真記録します。
6. 図4に示すように、_AlCl3の導出化の最終段階を置き換えて同じ手順を繰り返します。

図4:HPTLCによるTPCおよびTFHC解析のためのVisionCatsステップ。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

抽出条件
ここで説明する一般的な抽出プロトコルは、以前に報告された²²%のエタノールを60%使用します。他の植物源に外挿すると、溶媒の極性やサイクル数の観点から抽出条件を最適化できます。溶媒とサイクル数の両方を選択する包括的な理由は、^{他の場所で}詳述されています。溶媒の選択は先行文献や極性指数に基づいて判断されることがあります。一般的には、エタノールやメタノールのハイドロアルコール混合物、そしてアセトンが推奨されます。最適な抽出サイクル数(n)は、固定された総体積10 mLを1〜5サイクル(10/n mL)に分割し、液体抽出物をプールすることで評価できます。異なる抽出サイクル数の効率を統計的に比較し、TPCアッセイで最大吸収が得られる条件を特定します。

マイクロプレートとHPTLC定量化
マイクロプレートアッセイおよびHPTLC分析の標準校正曲線は 図5に示されています。Folin–Ciocalteuマイクロプレート法による総フェノール含有量(TPC)測定および同じ試薬で誘導体化されたHPTLCプレートについては、参照化合物としてガリ酸を用いた校正曲線が確立されました。伽酸が選ばれたのは、TPC定量において最も一般的に使われる標準の一つであるだけでなく、石灰やマンダリン試料に適用したのと同じ移動相条件下で溶出可能だからです。ケルセチンはHPTLCアッセイの標準化の可能性も評価されました。しかし、溶媒前線と共溶出するため、このクロマトグラフィー系には適さず、信頼性を得て定量化できませんでした。それにもかかわらず、TFHCはケルセチンを基準標準として決定されました。なぜなら、ガリック酸はフラボノールでも5-ヒドロキシフラボンでもないため、塩化アルミニウムと着色した複合体を形成しないからです。

図5:石灰、マンダリン、ガリ酸、ケルセチンのHPTLCプレートをMP1、続いてMP2で順次現像し、塩化アルミニウム(AlCl₃)およびフォリン・チョカルテ(FC)試薬で個別に誘導化。AlCl₃誘導後のクロマトグラフィープロファイルが示されています。略称:FC、フォリン–チョカルテウ派生;AlCl₃(塩化アルミニウムの誘導化);Wは白色光照明;366、366nmの紫外線照射。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

総フェノール含有量(TPC)および総フラボノイドおよびヒドロキシシンナミン酸含有量(TFHC)の結果は 表3に示されています。予想通り、TFHC値はTPC値よりも有意に低く、石灰サンプルでは約5倍、マンダリンサンプルでは約12倍低かった。

表3:マイクロプレート法によるマンダリンおよび石灰総フェノール含有量の結果。 略語:Abs:吸収力、CV:変動係数、DF:希釈係数、GAE:ガリック酸当量、IR:独立複製、QE:ケルセチン当量、Rep:重複、SD:標準偏差、TFHC:総フラボノールおよび5-ヒドロキシフラボン化合物、TPC:総フェノール含有量、および平均 。*乾物質に基づいて計算。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

同様に、HPTLC解析の結果は 表4にまとめられています。クロマトグラフィー分離により、異なる化合物に対応する個々のバンドを可視化できます。石灰サンプルからは4つのフェノール成分、マンダリンサンプルからは6つの成分が検出されました。これらのバンドはいずれも、使用された基準(ガリクト酸とケルセチン)の保持率に合致せず、これは予想と一致しています。

表4:_AlCl3に対応する全フェノール含有量およびバンドの結果により、_AlCl3を基に誘導したHPTLCによる化合物が明らかになりました。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表4 はまた、HPTLC分析から推定された総フェノール含有量も報告しており、これはクロマトグラフィーで検出された個々の化合物の合計として計算されています(TPCに類似)。さらに、表にはフラボノールまたは5-ヒドロキシフラバンに割り当てられるバンドの累積含有量も含まれています(石灰ではRf = 0.46および0.62;柑橘では検出されませんでした)。これらの帯はAlCl₃による誘導化後に黄色に見え、366nmの紫外線照射下で黄色みがかった蛍光を示しました。しかし、 図5に示すように、誘導化前には目に見える着色は観察されていません。

HPTLC解析においては、フォリン・シオカルテウ(FC)誘導化によりフェノール化合物の包括的検出が可能ですが、軽微な干渉が生じることもあります。また、塩化アルミニウム(AlCl₃)誘導化はフラボノイドの一部を選択的に染色します。両試薬の併用により、方法の標準化が向上し、どちらの方法にも固有の限界が軽減されます。特筆すべきは、非フラボノイド化合物がFCの下で特徴的な青色とAlCl₃の下で黄色赤色の吸収の両方を示すことは稀である点です。さらに、既存のクロモフォアは誘導化前に同じ強度で観測されていれば干渉として除外できます。

図5に示すように、石灰抽出物はRf 0.62と0.46の2つの帯を示し、未現像プレートでは検出できませんでしたが、Folin–Ciocalteu(FC)およびAlCl₃誘導化の後に明確に確認されました。この挙動は、ネオエリオシトリンやヘスペリジン²³に対応する可能性のあるフラボノイド性質を支持しています。石灰ではRf 0.21および0.37、マンダリンではRf 0.36、0.39、0.42、0.46、0.54、0.89で追加のフェノール成分が観察されました。これらのバンドはFC誘導化後に検出されましたが、AlCl₃処理後には検出されず、非フラボノイドフェノール化合物に対応している可能性を示唆しています。文献によると、マンダリンに含まれる主要な非フラボノイドフェノール酸にはクロロゲン酸とトランスフェルリン酸^{が含まれます。}石灰には、以前に記載された他の化合物としてクマーリン酸やジヒドロキシフェルリン酸²³があります。しかしながら、これらの課題の確認には追加の参照基準を用いた分析が必要です。

HPTLC移動相比較
両移動相は、以前に報告されたシステム^26、27、28の改良形として開発されました。より極性の移動相(MP1、 図6A)はMP2に比べてフェノール成分の分離が優れていました。対照的に、極性の低い移動相(MP2)(図6B)は、同じクロマトグラフィーラン内で試料成分と基準標準を同時に保持することを可能にしました。しかし、MP2条件下では、サンプル成分のRf値は比較的低く、一部の化合物は 図6に示すように原点近くに残っています。この制約に対処するため、MP1の後にMP2を行く二重現像手順が実装されました。この戦略により、試料成分の移動と解像度が向上し、同一のプレート上のガリック酸標準と比較して同一クロマトグラフィー条件下で定量化が可能となりました。ケルセチンはAlCl₃処理前は淡い黄色を呈していましたが、誘導化後にその色が強まりました。石灰抽出物とマンダリン抽出物の両方で、起源に残る帯に加えて、2つの明確な帯が観察されました。さらに、AlCl₃導出後にRf値0.14の黄色い帯がはっきりと見えました。

図6:移動相1(A)および移動相2(B)で現像された石灰、マンダリン、ガリ酸、ケルセチンのHPTLCプレート。各プレートの左から右へのトラックは、現像(非導出)、フォリン–キオカルテオ導出、AlCl₃導出試料に対応します。可視化は白光照射下で実施されました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

サンプルの採取と保管は、植物化学分析の完全性を確保するための重要なステップです。採取後は、サンプルを冷蔵下で輸送し、分解を最小限に抑えるためにできるだけ早く冷凍乾燥させるべきです。乾燥した生物材料は一般的に安定していますが、溶液中の抽出物は冷蔵保存中でもかなり不安定です。したがって、分析判断はできれば新鮮に抽出された抽出物に対して行うことが望ましいです。長時間の保管、例えば数日間の寒さや光の遮蔽条件下での保管、または数時間室温で保管すると、クロマトグラフィープロファイルの観察可能な変化が生じ、バンド強度の変化や沈殿物の形成が起こり得ます。これらの変化は通常、酸化、加水分解、または複合反応などの化学的変換に関連しています。したがって、すべての試薬や抽出物は、化学的安定性を保つために、冷たく暗い環境で保管・取り扱うべきです。

両手法(表3 および 表4)を比較すると、体系的な定量的な違いが明らかです。石灰および柑橘の両方において、マイクロプレートアッセイで得られたTPC値はHPTLCで推定される値の約3倍でした。石灰では、TPCはマイクロプレートで74.2 mmol/g、HPTLCでは22.0 mmol/g DMで、TFHC値はそれぞれ15.5 mmol/gと13.4 mmol/gでした。中国語では、TPCはマイクロプレートで72.8 mmol/gに達し、HPTLCでは20.8 mmol/gを上回りました。TFHCではマイクロプレート法で6.0 mmol/gが得られましたが、HPTLCでは対応するバンドは検出されませんでした。

これらの不一致は、各方法の本質的な制限や応答メカニズムによって説明できます。フォリン–シオカルテウ(FC)アッセイはフェノール化合物だけでなく、アスコルビン酸、チロシン、蟻酸、酢酸²⁹などの非フェノール還元物質や、その他の低分子量還元剤とも反応することが知られています。これらの化合物は分光光度信号全体に寄与し、TPCの過大評価につながる可能性があります。さらに、微量フェノール成分は、HPTLCで明確で定量化可能なバンドを形成するには濃度が低すぎても、マイクロプレートアッセイ内で総吸収を集団的に増加させることがあります。また、クロマトグラフィー条件下では保持、解離、または可視化されない小規模または極性の代謝物も存在します。

図7:フラボノールおよび5-ヒドロキシフラボンと形成されたAlCl₃錯体の概略的表現。 (A) フラボノールと(B)5-ヒドロキシフラボン。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

検出化学の方法論的な違いも観察されるばらつきに寄与しています。FC反応は試薬の還元により吸収が大幅に増加し、高い分析感度をもたらします。対照的に、AlCl₃法は比較的非特異的で、特定のフラボノイドによる複雑な形成に依存しています。フラボノールは通常、最大吸収率が410 nm付近で示されるのに対し、5-ヒドロキシフラボンは約440 nmで吸収^し、図7に示されるAl³⁺との錯体が示されています。しかし、複合処理後の吸収増加は比較的控えめであり、AlCl₃アッセイはフラボノイドを含む色付きマトリックス成分からの干渉に対してより感受性が高いです。

これらの制約にもかかわらず、HPTLCにおけるFCおよびAlCl₃誘導化の組み合わせは、フェノール分析における強力な補完戦略を示しています。このアプローチは、FC反応の高い感度と、AlCl₃複合体およびクロマトグラフィー分離による構造的識別を組み合わせています。さらに、いくつかのフラボノールは紫外線照射下で特徴的な黄色がかった帯を示すことが^{知られており、}これが化合物の分類と確認をさらに支持しています。

マイクロプレート法は特に高スループットスクリーニングに有利です。試料準備が最小限で、試薬消費も少なく、数十個の試料を同時に分析することが可能です。一般的な実験室条件下では、広く利用可能な機器を用いて約4時間で完全なマイクロプレートアッセイを行うことができます。これらの特性により、マイクロプレートアッセイは迅速な比較研究、日常的な品質管理、大規模なサンプルセットの予備評価に非常に適しています。対照的に、HPTLCはより時間と労力がかかり、完全な分析ワークフローには通常7〜8時間かかります。また、すべての研究所で利用可能なとは限らない特殊な機器に依存し、専用のプレートや誘導試薬の使用は分析あたりのコストを増加させます。もう一つの制約は、非常に低濃度の代謝物が標準的な可視化条件下で検出されない場合があることです。しかし、これらの実用的かつ感度に関する制限は、クロマトグラフィー分離^30,31という大きな利点によって相殺されています。HPTLCは複雑な植物行列内の個々の成分の解像、真のアッセイ応答の確認、潜在的な干渉化合物の検出を可能にします。さらに、選択的ポストクロマトグラフィー誘導化により、化合物を官能基(例:フラボノールや5-ヒドロキシフラボン)に分類することが容易になり、総成分推定を超えた化学的解釈を強化します。

したがって、大規模な研究では、分析ワークフローはマイクロプレートアッセイから始まり、標的化合物濃度が高いサンプルを迅速に特定することもあります。選ばれたサンプルはHPTLC解析を受け、個々の成分の可視化、選択性の評価、二重誘導による干渉の可能性の評価を行います。この統合戦略( 図8参照)は、速度とスループット、化学特異性および構造的洞察を組み合わせています。

図8:サンプルスクリーニングおよび分析のための提案ワークフロー。(A) 大量サンプルの高スループットマイクロプレートスクリーニング。(B) 選択サンプルのHPTLC解析で、Folin–Ciocalteu法を用いた定量およびAlCl₃誘導によるフラボノールおよび5-ヒドロキシフラボンの同定。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

HPTLCと比較して、HPLCと高分解能質量分析(HPLC–HRMS)の組み合わせは、文献で報告されている最も一般的な代替手段であり、比類なき感度と個々の化合物の構造的識別を明確に^します。それにもかかわらず、HPLC–HRMS分析は本質的に遅く、各クロマトグラフィーの実行は連続的に行う必要があり、計測機器、溶媒純度要件、溶媒消費量など大幅に高いコストがかかります。さらに、機能クラススクリーニングは複雑なデータ処理や化合物特有の解釈を必要とすることが多いのに対し、HPTLCは派生後の化合物の直接的な視覚的グループ化を可能にします。したがって、HPTLCは迅速なマイクロプレートスクリーニングと包括的なHPLC–MS分析の中間プラットフォームとして機能し、スループット、コスト、化学的選択性のバランスを取っています。

フラボノイドおよびフェノール分析は、食品科学、ニュートラシューティカル、製薬、農業、材料研究など、幅広い分野に応用されています。食品科学では、抗酸化能力、真正性、賞味期限、品質管理の評価に用いられます。例えば、ジュース、ワイン、お茶などの製品の製品に対しても、フェノール成熟度に基づく最適な収穫時期の決定を含む農学的研究の支援にも用^{いられます。}ニュートラシューティカル分野では、フェノールプロファイリングは緑茶エキスカプセル、ブドウ種子エキスサプリメント、ケルセチン錠、柑橘類バイオフラボノイド製剤などの植物抽出物や商業製品の標準化と品質保証に不可欠です。製薬および生物医学研究において、これらの解析は抗酸化、抗炎症、^{抗菌性を持つ}生物活性化合物のスクリーニングを支持します。農業および植物生理学において、フェノールの決定は植物のストレス反応を評価し、作物改良戦略の指針となります。さらに、材料科学、特に植物由来の腐食抑制剤の研究(^34,35)において、フェノール特性評価は化学組成と吸着挙動および保護効率の相関を助けます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL エッペンドルフ管	エッペンドルフ
10 mL ボリュームフラスコ	アイスコ研究所	CH0451B	10/19 ポリプロピレンストッパー、ホウケイ酸ガラス、琥珀 - 白色グラデュエーションマーク、許容範囲およびプラスムン;0.025 ml
100 & マイクロ;Lおよび1000およびマイクロ;Lマイクロピペットチップ	ジェネリック
100–1000 & micro;Lマイクロピペット	エッペンドルフ	リサーチプラス
10–100 & マイクロ;Lマイクロピペット	エッペンドルフ	リサーチプラス
15 mLのキャップ付きガラス管	ジェネリック
50 mL ビーカー	ジェネリック
8チャンネルマルチチャンネル・マイクロピペット	サーモサイエンティフィック
96ウェルマイクロプレート	グライナー	655891	ポリシクロオレフィン、ガラス底、黒色
分析的バランス			±0.0001 g
自動TLCサンプラー	カマグ	ATS4
遠心分離機	サーモサイエンティフィック	ソーヴァル ST8R	≥850回以上;g
フィルターペーパー	ワットマン		チャンバー飽和について
フリーズドライヤー	ラブコンコ	モデル10
プラスチック試薬リザーバー	エッペンドルフ
フラットエンドとスプーンエンドのヘラ	メルク・ケミカルズ	HS15906
Synergy HTマルチ検出マイクロプレートリーダー	バイオテック・インスツルメンツ	シナジーHT
TLCシリカゲル60 F254アルミ裏板(10 & 20 cm)	メルク
TLCスプレーヤー	シグマ・オルドリッチ		20 mL
TLCビジュアライザー	カマグ	2
超音波浴槽/クリーナー	クレワークス	ZX-040	温度制御は40度と4度、C
UVラム	UPV	UVGL-58
VisionCATSソフトウェア	カマグ
ジップロックバッグ	ジェネリック		1/4ガロンの4分の1