行動実験に基づくゼブラフィッシュ幼虫におけるMPTP誘導パーキンソン様行動表現型の表現型プロファイリング

サマリー

本プロトコルは、MPTP処理済みゼブラフィッシュ幼虫における行動表現型パラダイムを確立し、パーキンソン病様の運動障害および非運動障害を評価することを目的としています。

要約

本稿では、幼生ゼブラフィッシュにおけるMPTP誘発性パーキンソン病(PD)に対する独自の多パラメータ行動表現型プロトコルを紹介します。ゼブラフィッシュにおけるPD様病理の化学的誘導は、高スループットで遺伝的に扱いやすいシステムを提供しますが、ほとんどの研究は基本的な運動解析や単純な明暗遷移に限定しています。このような限られたアプローチでは、徐動障害や感覚運動障害から不安様行動、睡眠障害に至るまで、パーキンソン病に関連する機能障害の広範なスペクトラムを捉えきれていません。このギャップを埋めるために、本研究は6つの補完的なアッセイの統合セットを開発しました。すなわち、一般的な運動および探索的駆動を評価するための運動テスト、不安に関連するエッジ嗜好行動を検出するためのThigmotaxis評価; 徐動および運動反応障害の記録のための驚愕反応検査; リスクテイクとストレス応答性を評価するためのライト・ダークチャレンジアッセイ;感覚運動および反射運動を定量化するための光モーター反応パラダイム(ストロボライト刺激を含む)、睡眠覚醒調整モニタリングによる睡眠覚醒行動の測定。幼生ゼブラフィッシュは受精後1日(dpf)から5dpfまでの亜致死濃度MPTPにさらされ、行動評価は4から6dpfの間で開始されます。高解像度自動追跡により、アッセイごとに複数の行動エンドポイントが生成されます。このアプローチは、これまで検出されていなかったパーキンソン病様の変化、例えば障害的な睡眠構造、習慣化学習の障害、感覚運動および反射的運動などを明らかにし、初期の非運動症状を反映しています。これらのアッセイを組み合わせることで、研究者は人間のパーキンソン病の複雑さにより近い包括的な行動症状を得ることができます。このプロトコルは、PD病原の研究、候補治療薬のスクリーニング、環境調節因子の探求のパラダイムを拡張します。これは、強固で多面的な表現型解析を通じて翻訳的関連性を高める革新的な動物モデルを提示するというコレクションの目標を体現しています。

概要

パーキンソン病(PD)は、アルツハイ^マー病に次いで2番目に多い神経変性疾患です。近年、その有病率と影響を受ける人々の数は着実に増加しており、世界的に重大な公衆衛生上の課題となっています².パーキンソン病の発症率は^3歳、4歳で特に増加します。臨床的には、パーキンソン病は運動障害、徐行運動、静止時振戦、姿勢不安定性などの運動症状と、認知障害、不安、睡眠障害など様々な非運動症状の両方で現れ^ます。現在、パーキンソン病の診断は主に^{運動症状の}有無に依存しています。しかし、これらの症状が明らかになる頃には、黒質のドーパミンニューロンの60%以上^{がすでに失われ}ています。非運動症状はしばしば早期に現れますが、具体的かつ客観的な評価基準が欠如しているため、早期診断や介入が複雑^{になります。}現在、パーキンソン病の主な治療法はレボドパ⁹の投与で、脳内でドーパミンに変換され、線条体のドーパミンレベルを補充します。この治療は一時的に症状を緩和できますが^、病気の進行を止めることはできません。したがって、パーキンソン病の病因と薬物スクリーニングに関するさらなる研究が不可欠です。

適切な動物モデルの構築は、パーキンソン病および抗パーキンソン病用薬物スクリーニングの病因研究において極めて重要です。現在、PD研究には主に3つのモデルがあります:化学的誘導モデル¹¹、遺伝子編集モデル¹²、ヒト異種移植モデル¹³です。よく使われるモデル動物には、マウスのような齧歯^類やサルのような非ヒト霊長類^{が含まれます。}近年、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、小型化、急速な成長、人間との高い遺伝的相同性、透明胚などの利点からPD研究で注目を集め^{ています。}神経毒MPTP(1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン)を用いてドーパミンニュー^{ロン損傷を}誘導することは、PDモデルを構築する古典的な方法です。致死性未満のMPTP濃度にさらされたゼブラフィッシュは、さまざまなPD様行動表現型を示します¹⁹。

しかし、現在のほとんどのゼブラフィッシュPD研究は基本的な運動行動や単純な明暗転移に焦点を当て^{ており、一次}元的な行動アッセイではPDの複雑な行動特性、特に非運動機能の行動変化を完全に反映するのは困難です。パーキンソン病は^{運動制御を超え}た複数の神経行動システムに関与する疾患であることを^{考えると、}多系統表現型を捉えるためのマルチパラメトリック行動表現型評価法が緊急に必要とされています^。

したがって、本研究はMPTP処理ゼブラフィッシュ幼虫におけるPD様行動表現型をより包括的に記述するため、複数でパラメトリックかつ迅速な行動表現型アッセイプロトコルを構築します。受精後1日から5日の間に、致死量のMPTP(50μM)²⁵を幼虫に投与した(dpf)16,20,26。4から6 dpf^16、20、24の間に、睡眠覚醒調節モニタリング、光運動反応パラダイム、走行性評価、運動運動評価、驚き反応テスト、光暗チャレンジアッセイの6つの行動テストを実施しました。これらの行動評価は、運動障害、感覚運動、習慣化学習、リスクテイク、ストレス反応性、睡眠覚醒リズムなど、運動的側面と非運動的側面の両方をカバーします。

Zebraboxのハイスループットビデオトラッキングシステムと定量解析手法を用いて、さまざまな行動パラメータを抽出・定量化し、MPTP処理群と野生型(WT)群の挙動差異を統計的に比較しました。既存のゼブラフィッシュPDアッセイと比較して、このマルチパラメトリック行動バッテリーは標準化された枠組みの中で運動表現型および非運動表現型を捉えます。自動追跡システムは客観的な行動データの取得と高い再現性を保証します。さらに、幼虫の体サイズが小さいため、個体を多孔プレートに配置でき、高スループット評価が可能です。これらの利点は、PDの病理学的メカニズムを深く分析し、候補薬剤や化合物をスクリーニングし、環境要因がPDの発生や発症に与える影響を探る上で有益です。

プロトコル

本研究はゼブラフィッシュを対象とし、動物の管理および使用に関する機関ガイドラインに準拠して実施され、山東大学薬学部倫理委員会(No.YXDW2025-0056)により承認されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. MPTP準備

1. 1× E3培地を超純水で1:100で希釈して×100 mLのE3を製製します(例:100 mL 5 mL×超純水495 mLを混ぜて1× E3培地500 mLを得ます)。
   注意:使用当日に新たにE3ミディウムを準備してください。
2. 5.0 mgのMPTP粉末を50 mLの遠心分離機チューブに加え、E3培地を最終体積25 mLに加えて1 mM MPTPストック溶液を準備します(遠心分離チューブを混合容器として使用しますが、遠心分離は不要です)。溶液を1 mM MPTPの純正溶液としてラベル付けしてください。ストック溶液は暗闇に置きましょう。
3. 50 μM MPTP溶液の調製:1 mM MPTPストック溶液2.5 mLをクリーン容器に移し、47.5 mLのE3培地で希釈して、最終体積50 mL、最終濃度50 μM MPTPを得ます。残りのストック溶液は暗闇の中に保管され続けました。
   注意:MPTPは強力な神経毒であり、極めて慎重に取り扱う必要があります。必ず適切な個人用防護具(PPE)を着用してください。手袋、実験用コート、防護用アイウェアなどです。MPTP廃棄物の処分は、機関のバイオセーフティガイドラインに従ったものです。

2. ゼブラフィッシュ胚の準備とグルーピング

1. 成熟したオスとメスの成体ゼブラフィッシュを選び、取り外し可能な仕切り付きの繁殖タンクを用いて管理繁殖を行います。午後8時に、繁殖用水槽にオスとメスのゼブラフィッシュを2:3の比率で分け、仕切りで分けます。
2. 翌日、午前8時に間隔を外して交尾を許可し、産卵を開始します。1時間後に胚を採取し、清潔なシステム用水で3回洗います。
3. 胚は新鮮なE3培地とともに100mmペトリ皿に入れ、28°Cで14時間の明暗/10時間の暗闇サイクル(午前8時から午後10時まで照明点灯)で孵化させます。
   注意:正常な発育を確保するために、20mL培地で1皿あたり50個を超えないようにしてください。
4. 1 dpfで、受精していない、奇形、異常な胚をパスツールピペットで慎重に取り出し、ゼブラフィッシュ胚を含む溶液を交換します。WT群の場合は、既存の培地を新鮮なE3胚培地に置き換えます。MPTP処理されたグループについては、培地を50 μM MPTP溶液に置き換え(図1A)、両基をインキュベーターに戻します。
5. どちらのグループも溶液を交換し、死んだ胚や不健康な胚は24時間ごとに取り出します。MPTP処理群では、1 dpfの朝から4 dpfの朝まで毎日MPTP溶液を交換します(図1A)。その後、MPTP処理群を5 dpfの朝から実験終了までE3培地に移行させます。
   注意:溶液はパスツールピペットで優しく交換してください。培地をゆっくりとペトリ皿の縁から吸引し、胚への影響を最小限に抑えるために培地の壁に沿って新しい溶液を加えます。

3. 睡眠・覚醒調整モニタリング

1. 4 dpfで、各グループからゼブラフィッシュ幼虫を午後6時に選択し、改良した3 mLパスツールピペット(先端を切り落として)で96ウェルプレートに移し、1ウェルに1隻の幼虫を移します(図1B)。最初の4行はWTグループを表し、最後の4行はMPTPグループ(各グループに48匹のゼブラフィッシュ)を表しています。
   注意:ゼブラフィッシュの刺激や損傷を避けるため、パスツールピペットの先端を10mmに切り、4dpfのゼブラフィッシュ幼虫より広いボア(体長3.7mmを超えた)にしてください(^27,28)。
2. 各ウェルを立体顕微鏡で観察し、各ゼブラフィッシュの幼虫の見た目が健康で、ヒレが開いて定期的に振り回され、体が直立し、浮き袋が²⁹度膨らんでいるかを確認しましょう。各井戸のゼブラフィッシュが健康な状態であることを確認した後、各井戸にE3メディウムを満たします。
   注意:各井戸にはE3中程度からほぼ膨らんでいるもので満たし、表面張力が維持されるようにしてください。液体は気泡や井戸のあふれを防ぐために慎重に加えてください。
3. 魚と液体を96ウェルプレートに移した後、睡眠覚醒行動テストの前にゼブラボックスチャンバーに30分間慣れさせます。
   注意:96ウェルプレートをゼブラボックスチャンバーに設置する前に、ビデオトラッキング結果に影響を与える汚れを防ぐためにプレートの底を慎重に清掃してください。
4. Zebralabのビデオトラッキングソフトを開き、 量子化 モードを選択し、96ウェルプレートがZebraboxチャンバーの底部中央に配置されていることを確認してください。
5. 照明調整を午後10時に消し、午前8時に照明を点けるように設定してください。これはゼブラフィッシュが育てられている時の光の状態と一致しています。昼間は白色光が一般的に約1000ルクスです。ソフトウェアパラメータは以下の通りに設定されます:²⁹:検出閾値40;バースト、25(移動時の閾値);フリーズ(移動時の閾値)、4;ビンサイズ:60シリング;総モニタリング時間は52時間(初日は午後8時から3日目は午後0時まで)。午後8時に睡眠覚醒手順を開始します。
   注意:手順開始後は、ゼブラフィッシュの通常の睡眠・覚醒リズムに影響を与えないよう、実験中は外部からの騒音や振動を一切禁止してください。長期監視中の水蒸発を防ぐために、96ウェルプレートを透明なラップで覆います。
6. 52時間後にスリープ・ウェイク実験を停止し、データファイルを保存します。ZebraBoxから96ウェルプレートを取り外してください。
   注意:MATLABとExcelを用いて、必要なパラメータとしては、睡眠回数(睡眠回数は少なくとも1分間続く非活動期間と定義されます)²⁹、平均睡眠帯長(睡眠帯の平均時間)、総睡眠時間(モニタリング期間中の全睡眠帯)、睡眠潜伏期(軽い移行から最初の睡眠帯の開始までの時間)、 平均活動(監視期間中の運動活動と定義)および覚醒活動(睡眠発作を除く覚醒期間のみの運動活動と定義)がデータファイルから抽出・解析されました。
   1. 学生のt検定を用いて、WT群とMPTP処理群の違いを比較します。さらに、MATLABソフトウェアを使って52時間にわたるゼブラフィッシュの睡眠曲線、覚醒活動曲線、平均活動曲線をプロットします。

4. 光モーター応答パラダイム

注:光動反応パラダイム(ストロボライトを含む)は、5個のdpf幼虫を用いた高スループット行動テストであり、光の急激な変化に対する感覚運動および反射的運動変化を定量化します。このテストは96ウェルプレートを用いて行われ、2つのパラダイムが含まれていました。(1)1分間の暗闇から1分間の一定光(1000 lx)への光の遷移、(2)1分間の暗闇から1分間のストロボ光への遷移を伴うストロボ信号(10 Hz)。

1. 5 dpfの幼虫を96ウェルのプレート(1ウェルあたり1匹)(図1B)に入れ、各ウェルにE3培地を充填します。平均して96匹の幼虫をWTグループとMPTPグループに分けます。
2. ダークコンスタントライトのパラダイム:
   1. 96ウェルのプレートに5個のdpf幼虫を入れてゼブラボックスに入れ、アッセイ前に暗闇で5分間幼虫が順応します。
   2. トラッキングオンライン分析モードを開いてください。
   3. 光のトランジションプログラムを次のように設定します:0-60秒:暗闇、60-120秒:一定光(1000 lx)。
   4. プロトコルを開始し、120秒のアッセイ中6秒ごとに関連する動作パラメータを収集します。
   5. プロトコルを120^秒 で停止し、データファイルをエクスポートします。幼虫を完全な暗闇に5分間置いて環境に慣れさせ、次の暗いストロボ光検査に備えさせます。
3. ダークストロボライトのパラダイム:
   1. 光のトランジションプログラムを次のように設定します:0-60秒:暗、60-120秒:ストロボライト(1000 lx)で10Hz。
      注:10 Hzのストロボは1秒あたり10回の光パルスに対応します。ZebraLabでは、光の強度を0から1000 lxまで1000 lxに1000 msごとに交互に変換して実装します。
   2. 5分間の暗い適応が完了したら、暗光からストロボ光へのアッセイを開始します。120秒のアッセイ中、6秒ごとにモーションパラメータを収集します。
4. データ解析:アッセイ終了後、データファイルをエクスポートします。MATLABソフトウェアを使って6秒ごとに泳ぐ距離を抽出します。両方のアッセイの2分間に泳いだ総距離(平均値/6秒)をプロットします。暗闇で1分間移動した総距離を光の中で移動した総距離を³⁰から差し引いて凍結指数を計算します。
   注意:フリーズインデックス<0は凍結挙動を示します。フリーズインデックス>0は脱出を示します。凍結指数=0なら反応なしを意味します。学生のt検定と双方向ANOVAを用いて、WT群とMPTP処理群の違いを比較します。各グループで合計48匹のゼブラフィッシュ幼虫(n = 48)が使用されました。

5. タキスの評価

1. 6ウェルプレートを2枚選び、それぞれ4mLのE3培地を充填します。
2. 5dpfで、WTグループおよびMPTP処理グループのゼブラフィッシュ幼虫を採取し、2枚の6ウェルプレートに入れました(1つはWTグループ、もう1つはMPTP処理グループで、1ウェルあたり1匹の幼虫が入ります)(図1C)。
   注意:幼虫の初期位置が井戸の中央であることを必ず確認してください。
3. Thigmotaxis評価の前に、ウェルプレートはZebraboxの適切な位置に15分前に配置して対応してください。
4. データ収集と解析: ドローエリア 関数を用いて、各井戸の観測領域に同心円を2つ描きます(中心円の半径は穴の半径の1/2)(図1C)、残りのパラメータは運動評価と同じように設定します。5分間の走位性評価のプロトコルを開始し、並行して実験を行います。
   注:プログラム終了後、Zebralabソフトウェアは5分以内にゼブラフィッシュ幼虫の軌跡と関連する様々な動きパラメータを生成します。データファイルでは、an1は各井戸の全面積を表し、an2は各井戸の内側ゾーンを表します。したがって、total dis(an1)とtotal dur(an1)は井戸内での総泳距離と総時間を表し、total dis(an2)とtotal dur(an2)はそれぞれ内側ゾーンでの距離と時間を表します。
   1. 以下の式で三位性を計算します。
      外側ゾーンで泳いだ距離の割合を計算してください:
      
      外側ゾーンで過ごす時間の割合を計算してください:
      
   2. 学生のt検定を用いて、WT群とMPTP処理群のThigmotaxisの違いを比較します。各グループに合計24匹のゼブラフィッシュ幼虫(n = 24)が使用されました。

6. 運動評価

1. 5 dpfで、WTグループとMPTP処理グループから選択されたゼブラフィッシュ幼虫をそれぞれ2つの12ウェルプレートに移管します(1つはWTグループ、もう1つはMPTP処理グループで、1ウェルあたり1匹の幼虫、2 mL E3培地で使用)(図1D)。
   注意:ゼブラフィッシュの幼虫のサイズが似ていることを確認し、選ばれた幼虫はヒレが開いており、直立した姿勢で、浮き袋の良好な膨張があり、規則的な動きができるものが望ましいです。
2. ロコモーター評価の前に、15分前にウェルプレートをゼブラボックスのテスト位置に置いて適応させてください。
   注意:適応中の光条件が試験中の光条件と一致していることを確認してください。
3. 15分の順応期間の後、トラッキングモードオンライン解析を選択し、自動コンピュータ化ビデオトラッキングシステムを使って各幼虫の運動活動を5分間記録します。Zebralabソフトウェアを用いて60秒ごとに移動経路や関連する運動パラメータを収集し、完全なデータファイルをエクスポートしてMATLABを使って各幼虫の総距離と平均速度を5分で解析します。
   1. 学生のt検定と双方向ANOVAを用いて、WT群とMPTP処理群の違いを比較します。各グループに合計24匹のゼブラフィッシュ幼虫(n = 24)が使用されました。

7. 驚き反応テスト

注:この検査は、暗闇への突然の移行によって引き起こされる視覚的驚き反応(VSR)を測定します。この驚愕反応テストは、突然のミリ秒スケールの暗い閃光によって引き起こされる光源による視覚的驚きを評価するものです。持続的な行動反応を評価するために繰り返し光パルスを照射するダークストロボライトのパラダイムとは異なり、このアッセイは急性の視覚刺激に対する迅速で反射的な運動反応に焦点を当てています。

1. 調製方法:5 dpfで、WT群とMPTP処理群からゼブラフィッシュ幼虫を選択し、それぞれ2枚の12ウェルプレート(1つはWTグループ、もう1つはMPTP処理グループ、1ウェルあたり1匹の幼虫、2 mL E3培地)に移します(図1D)。
2. 驚き反応テストの前に、5分前にウェルプレートをゼブラボックスのテスト位置に置いて適応させます。
3. 刺激パラメータを設定してください: Zebralab ソフトウェアを開き、 トラッキングオンライン 解析モードを実行し、 Lightトリガー インターフェースを開き、 以下の3つのトリガー方法のいずれかを選択し、 Enhanced 刺激を有効にし、「 セッション開始時」に設定します。トランジションスケジュールでは、ダークフラッシュのリズムは次のように定義されています(プログラムは21秒後にトリガー開始):トランジション1:5ms、100%光強度;トランジション2:2890ミリ秒、100%光強度;トランジション3:5 ms、光強度0%;トランジション4:100ms、光強度0%;周期的な点滅を保証するために 遷移リストを繰り返し ます。
4. プロトコル開始:Numeriscopeビデオ録画機能が有効であることを確認し、高スループットの自動トラッキングにより、この90秒テストで30の行動エンドポイントを含む多次元データセットが生成されます。
5. データ解析:驚愕反応アッセイが完了した後、生データファイルをエクスポートし、MATLABソフトウェアに取り込み解析を行います。各幼虫の3秒間隔で泳ぐ距離と平均泳速を計算します。
   1. 各グループごとにフラッシュ刺激後のピーク移動距離、ピーク速度、または応答遅延を特定します。学生のt検定と双方向ANOVAを用いて、WT群とMPTP処理群の違いを比較します。各グループに合計24匹のゼブラフィッシュ幼虫(n = 24)が使用されました。

8. 光-暗のチャレンジアッセイ

1. 5 dpfで、ゼブラフィッシュ幼虫を2つの24ウェルプレートに個別に移し(図1E)、各ウェルに1隻の幼虫と1 mLのE3培地を投与します。各プレートには24匹の幼虫が含まれ、2枚の24ウェルプレートはWTグループとMPTP処理グループに均等に分けられていました(n=24個ずつ)。
2. 試験前に、24ウェルプレートをゼブラボックス内の指定された試験エリアに置き、5分間の光の順応期間を設けて試験環境に適応させます。トラッキングオンライン分析モードを起動してください。照明プログラムの設定は次の通りです:6分間の一定光の後、4分間の完全な暗闇(図1E)。テストの総時間は10分で、データポイントの収集間隔は60秒です。
   注:世界的な6分間の光は順応と慣れのためのもので、安定したベースラインの運動能力と特別な明暗反応を保証します^31,32。
3. 10^分目 に行動記録を止めてデータを保存してください。慎重にゼブラボックスからプレートを取り出してください。
4. 各幼虫ごとに60秒間隔で泳ぐ距離を抽出します。光のフェーズ(^0th-6分)、暗いフェーズ(7th-10th⁾の間に移動した距離、そして合計10分の期間を計算します。ダークフェーズにおけるThigmotaxisの行動と慣れ学習のパフォーマンスを定量化します。
   注:慣れ学習とは、動物が連続した刺激や環境にさらされたときの行動反応の減少(^33,34)と定義されており、明暗から暗への移行後の1^分と^{4分の間に}移動した平均総移動距離(mm)を統計的に比較して評価されました。学生のt検定と双方向ANOVAを用いて、WT群とMPTP処理群の違いを比較します。各グループに合計24匹のゼブラフィッシュ幼虫(n = 24)が使用されました。

9. MPTP廃棄物の処分

注意:各行動実験の後、MPTP接触面(例:実験台やZebraBox)に新たに調製した次亜塩素酸ナトリウム(漂白剤;≥10% v/v)で拭き取ってください。

1. MPTPの液体廃棄物(残留した曝露液や洗浄液を含む)および固形廃棄物(例:パスツールピペット、手袋、ペトリ皿、多孔プレート)を収集します。それらを有害な神経毒性廃棄物として明確にラベル付けしてください。
2. 汚染された液体廃棄物および固形物は、新たに調製された次亜塩素酸ナトリウム(漂白剤;≥10% v/v)で少なくとも24時間処理し、除去を確実にし、その後機関の規則に従って処分してください。
3. MPTP処理済みゼブラフィッシュ幼虫は、希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液(例:漂白剤6%の1:5比率)に5分³⁵分浸して安楽死させます。動けないと心拍が止まったため死亡が確認された。除染された幼虫および培地は、機関で承認されたプロトコルに従い、有害な生物廃棄物として機関で処分されます。

結果

睡眠覚醒調節モニタリング
52時間の睡眠覚醒調節モニタリングは4 dpfから始まり、96ウェルプレートを用いて実施されました。MPTP処理のゼブラフィッシュは、WT群と比較して睡眠構造に有意な障害を示しました。代表的な睡眠曲線、覚醒活動プロット、平均活動痕跡は 図2に示されています。ゼブラフィッシュ幼虫の睡眠覚醒調節解析のパラメータは 図3に示されています。MPTP群の総睡眠時間はWTと比較して有意に増加しました(p<0.01、学生のt検定)。MPTP群は睡眠発作回数がWTに比べて減少し(p < 0.001)、平均睡眠発作時間は増加しました(p < 0.0001)。睡眠潜伏間はグループ間で有意な差は見られませんでした。MPTP群では覚醒活動も障害され(p < 0.01)、平均活動は減少しました(p < 0.01)。

光モーター応答パラダイム<...

ディスカッション

本研究は、MPTP誘発性パーキンキン病様行動表現型を評価・解析するための包括的なプロトコルを開発・検証しました。このプロトコルは、6つの異なる検査、運動評価、タクモタキシスアッセイ、驚き反応テスト、光運動反応パラダイム(ストロボ光刺激を含む)、光暗チャレンジアッセイ、睡眠覚醒調節モニタリングを統合し、PDの運動および非運動的欠損を評価・記述しました。結果は、WT群と比較して、MPTP処理されたゼブラフィッシュ幼生は運動および非運動行動の変化を示し、運動の減少、感覚運動反応の障害、睡眠覚醒リズム障害など、PD様症状に類似していることを示しました。これらの発見は、ゼブラフィッシュモデルの堅牢性と、パーキンソン病様症状を捉えるためのこの多重行動テスト法の実現可能性と利用可能性を示しました。

実験は1dpfでゼブラフィッシュ胚の準備から始まりました。幼虫は50 μM MPTP(MPTP処理群)またはE3胚培地(WT群)に曝露され、その後4〜6 dpfの行動評価が行われました。以下は各検査の具体的な結果と解釈です。

...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100回以上;E3ストック解	上海飛溪バイオテクノロジー	該当なし	NaCl 34.8 g、KCl 1.6 g、CaCl2· 5.8 g を含みます。2H2O、および9.78g MgCl2middot;6H2O 1リットルあたり
12ウェル細胞培養プレート	NESTバイオテクノロジー	712011	未処理、非発熱性、無菌、発泡スチレン。ゼブラフィッシュ幼虫の行動分析に使用
24ウェル細胞培養プレート	NESTバイオテクノロジー	702011	未処理、非発熱性、無菌、発泡スチレン。ゼブラフィッシュ幼虫の行動分析に使用
3 mL パスツールピペット	ビオロジクス	30-0238A1
6ウェル細胞培養プレート	NESTバイオテクノロジー	703011	未処理、非発熱性、無菌、発泡スチレン。ゼブラフィッシュ幼虫の行動分析に使用
96ウェル細胞培養プレート	NESTバイオテクノロジー	701011	未処理、非発熱性、無菌、発泡スチレン。ゼブラフィッシュ幼虫の行動分析に使用
MATLAB R2020a	MathWorks、アメリカ	該当なし	MATLAB R2020a、山東大学ソフトウェアポータル(softms.sdu.edu.cn)から取得したキャンパス全体のライセンス。ゼブラフィッシュ幼生の行動データの統計解析に使用されます。
Microsoft Excel	マイクロソフト	該当なし	Microsoft Excel(Microsoft Officeの一部)、山東大学ライセンスソフトウェアポータル(softms.sdu.edu.cn)を通じてインストールされました。
MPTP(1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン)およびnbsp;	ビヨタイム	41125281	5mg
ペトリ皿	NESTバイオテクノロジー	704202	100mm、無菌、グリップしやすいハンドル、TC処理済み
次亜塩素酸ナトリウム溶液	マックリン	S817439	家庭用漂白剤溶液(6〜14%の活性塩素ベース)を希釈して&GEに変えた。表面および廃棄物の除染には10% v/v;また、MPTP処理済みゼブラフィッシュ幼虫の安楽死用に1:5(漂白剤:水6%)を希釈しました。
立体顕微鏡	オリンポス	SZX2シリーズ
Zebrabox高解像度ビデオトラッキングシステム	Viewpoint、フランス	該当なし
Zebralab Software	Viewpoint、フランス	該当なし	バージョン(3,52,3,87)