マウスにおける社会行動ネットワークの二色多ファイバー光度測定記録

サマリー

ファイバーフォトメトリーは、深部脳神経集団からカルシウム活動を記録するために最も一般的に用いられる技術の一つです。ここでは、マウスの深部脳神経集団からのカルシウム活動およびその他の動的蛍光信号を、カスタマイズ可能な多部位二色画像診断のプロトコルを説明します。

要約

ファイバーフォトメトリーは、光ファイバーケーブルを通じて信号を一括記録するもので、自由に動く齧歯類のニューロン群からカルシウム活動を記録する有効な方法です。特に、この方法は、より腹側でアクセスしにくい脳領域にある遺伝的に特定されたニューロンの小集団を標的化するのが容易な問題となります。なぜなら、細胞分解能での記録が依然として困難だからです。この技術はバンドルされたマルチファイバー方式を用いて複数の部位から同時に記録できるようにスケール可能であり、各記録部位で遺伝的戦略を用いて複数の細胞タイプを標的にすることができます。ここでは、マウスの社会的行動ネットワーク(最大12サイト)をターゲットにするためのカスタマイズされたマルチファイバーアレイの構築と挿入方法のプロトコルを提供します。このプロトコルは、カスタマイズされたマルチファイバーアレイを用いた複数の部位の成功した標的化に必要な外科的操作手順と、各部位で2つの遺伝子識別された神経集団を同時に撮影するための緑偏移・赤偏偏蛍光指標のウイルスアプローチを詳細に示しています。私たちは、市販の相補金属酸化半導体(CMOS)カメラシステムを用いて、社会的行動中にこれらの領域から記録する方法を実演します。さらに、このプロトコルは品質管理の手法を示し、ノイズ補正と標準化のための前処理パイプラインについても詳述しています。最後に、大規模な脳ネットワークに関する新しい発見を明らかにするためのツールの潜在的な応用例について議論します。

概要

光ファイバー光度法は、光ファイバーケーブルを通じて蛍光信号を大量に記録する技術であり、深部脳領域における神経集団活動を測定する強力な技術として浮上しています。これらの領域は、顕微内視鏡や従来の電気生理学的アプローチでは容易にアクセスできないことが多いです。^1,2,3。現代のシステム神経科学における主要な目標の一つは、行動生成に関与する大規模な細胞型特異的な脳ネットワークが用いる計算を特定し解明することです。ニューロピクセルプローブや市販の多繊維フェルールは、線形に整列した神経集団^4,5,6,7の記録に優れており、広視野皮質イメージングは表層皮質の動態^8,9の優れたカバレッジを提供します。しかし、空間的に分散しつつ機能的に接続された皮質下神経集団からの同時記録は技術的に依然として困難であり続け^{ています。}さらに、複数の単線維フェルールを用いて複数の深部脳構造を標的にすることも可能ですが、この方法は複数のフェルールを埋め込むことができるほど十分に離れた神経集団に限定^{されます。}オーダーメイドのマルチファイバー光度アレイは、自由に行動する動物の多くの皮質下領域から最小限の制約で同時に記録できることで、複雑な行動中のネットワークレベルの調整を独自に観察できるというギャップを埋めます。

社会行動ネットワーク(SBN)は、大規模な脳ネットワークの動態を調査するのに理想的なシステムです。SBNは、社会的行動の生成に関与する密に相互接続され進化的に保存された皮質下構造の集合であり、すべての脊椎動物クラス^13、14、15で同定されています。これらの構造には伝統的に、外側中隔、視前領域、終末線条の床核、前内側および腹内側視床下核、内側扁桃体、側隔核、および水道管周囲の灰色^13,14,15が含まれますが、これらに限定されません。SBN内では、分子マーカーによって定義される特定の神経集団が社会的行動の調節において重要な役割を果たします。SBN ɣ-アミノ酪酸作動性(GABA作動性)ニューロン(小胞性GABAトランスポーター(VGAT)の発現で示される)およびグルタミン酸作動性ニューロン(小胞性グルタミン酸トランスポーター、VGlutの発現で示される)は、ネットワーク内の主要な興奮性および抑制性細胞タイプであり、社会的行動の調節において解離的な役割を果たす可能性が高いです 16,17,18,19.これらの古典的な神経伝達物質システムを超えて、性ホルモンシグナル伝達はネットワークの機能において重要な役割を果たします。例えば、多くの男女の社会的行動はエストロゲン受容体αの発現を必要とし、SBNニューロンのこれらの受容体を発現する活動がこれらの行動を因果的に駆動します。16,20,21,22,23,24,25,26.さらに、SBNの神経集団はドーパミン、アルギニン・バソプレシン、オキシトシン、オピオイド、タキキニン、ニューロペプチドY、プロラクチン、オレキシン、アグーチ関連ペプチド、メラノコルチン、キスペプチン、ゴナドトロピン放出ホルモン17,18,19,27,28,29,30など、多くの神経調節系のリガンドや受容体で豊かにされています。³¹、そして最近の遺伝子符号化センサーの進歩により、これら多様なシグナル伝達分子の多くを追跡できるようになりました。32,33,34,35,36,37,38。SBNの神経集団は皮質下構造全体に空間的に分散しているため、従来の実験的準備(例:細胞外電気生理学、皮質表面イメージング、以前の多繊維光度測定法)では、この大規模な脳ネットワーク全体の瞬間ごとの活動動態を捉えることはできません。それにもかかわらず、遺伝子的に定義された神経集団におけるカルシウム動態と神経調節因子の放出パターンを監視することで、特注のマルチサイトファイバーフォトメトリープラットフォームは、特定の細胞タイプやシグナル分子が社会行動の特定の特徴をコードしているかを明らかにし、新たなメカニズム的洞察を提供します。

ここでは、自由に行動するマウスの最大12の脳領域から同時に記録できる、複数サイト・2色ファイバーフォトメトリー用のカスタマイズ可能なプラットフォームを開発しました。この手法を用いて、11のSBN脳領域に分布する22の特定された神経集団からカルシウム活性の2色光度測定を記録し、同時にGPCR活性化ベースDAセンサー(GRAB-DA1m)³³を用いた側座核のドーパミン変動の測定も行いました(表1)。このプロトコル(図1)は、カスタマイズされたマルチファイバーアレイの構築、複数の深部脳部位を標的とする外科的手順、二重カルシウム指標(GCaMP³⁹およびRCaMP⁴⁰)を表現するためのウイルス送達戦略、市販のCMOSカメラベースのファイバーフォトメトリーシステムを用いたデータ収集、品質管理手法、ノイズ補正および信号標準化のための前処理パイプラインを詳述しています。特に、前処理パイプラインにはアイソスベスト制御波長記録が組み込まれており、これによりモーションアーティファクトの修正が可能です。回帰分析に基づくアプローチ⁴¹を用いて、移動アーティファクトを補正し、騎乗や戦闘などの激しい社会的行動中に信号の忠実度を確保します。我々の特注マルチファイバー光度法は、近位および遠位の深部脳構造に分散した活動を同時に監視しつつ、遺伝^{的ターゲット化}による細胞型特異性を維持^{できるため、深}部脳の大規模脳ネットワークにおける神経活動動態の記録において、他に比べて大きな利点を提供します。

このプロトコルは、空間的に分散した皮質下脳領域(≥4サイト)からの同時記録を必要とする自由行動動物の実験に最適です。特に遺伝的に定義された細胞型のネットワークレベルの動態を調査したり、神経活動と並行して神経調節因子の放出を追跡したりする際にです。このアプローチは、激しい動きを伴う自然主義的行動(例:社会的相互作用)の研究に特に有用であり、私たちのモーションアーティファクト訂正パイプラインによって信号の忠実度が保証されます。しかし、単一細胞分解能、体細胞信号と軸索信号の区別、表層皮質領域からの記録を求める研究者には、ミニチュア顕微鏡、ニューロピクセル、広視野イメージングなどの代替手法の方が適している場合があります。主な実務的考慮点には、手術の複雑さ、カスタムマルチファイバーアレイ製造の必要性、必要な材料インフラ(3Dプリンティング機能、光ファイバーツール)の確立が含まれます。

プロトコル

注:このプロトコルは8週から25週の成体マウスを用いて試験および検証されました。マウスは21〜26°C、湿度30%〜70%の環境で、12時間の逆暗光サイクル(オフ:午前10時;オン:午後10時)。実験は主観的な活動期(暗い)期間のみに行われました。食料と水は 自由に提供されました。すべての動物処置はプリンストン大学の施設動物ケア・使用委員会によって承認され、国立衛生研究所の基準に従っていました。

1. マルチファイバーアレイおよびパッチコードの製造(図1A)

1. パッチコードの製造(図2A).
   1. 12本のファイバー分岐パッチコードを入手し、付属のパッチコードコネクターおよび立体定位ドリリングアクセサリー(補足ファイル1、補足ファイル2、補足ファイル3)を樹脂(引張強度:8.7キロポンド/平方インチ[ksi]、eモジュール:377 ksi、熱たわみ:138°F、伸長:8%)を使って印刷します。
   2. 付属のポリッシングパック(補足ファイル4)を直径2インチのステンレス鋼棒で組み立て、パックの中央にマルチファイバーアレイサイズの切り抜きを入れます。
   3. マルチファイバーアレイのダウエルピン貫通穴から余分な樹脂を1.22mm x 11mmのドリルビットで手動で除去します。精密な3Dプリントでも、ダボのピン穴はダボが通るにはやや小さすぎます。
   4. ファイバースルーホールを掘りましょう。
      1. 立体定位ドリリングアクセサリーの4つのピン穴すべてに合金鋼のダウエルピン(1.19 mm x 12.7 mm)を挿入し、パッチコードコネクタを下向きにして立体定位ドリリングアクセサリーに差し込みます。ダボピンはマルチファイバーアレイのダボピン貫通穴を通して通します。
      2. ねじ穴にM4サイズのセットスクリューを締めてパッチコードコネクタを固定し、立体定位ドリリングアクセサリーを立体視固定フレームに固定します。
      3. 0.25 mm x 5.5 mmのドリルビットを立体定位ドリルに挿入し、ドリルを立体定位フレームに取り付けます。このドリルビットを使い、マルチファイバーアレイのヨー、ピッチ、ロールを最大偏差許容±0.03 mmで水平化します。
         注意:3Dプリントの最も前後の位置で水平ヨーとピッチを、マルチファイバーアレイの四隅で水平ロールを行ってください。
      4. 3Dプリントされたファイバー穴の上を中心にドリルし、立体定位フレームのX/Y座標を関連する脳領域のML(X)およびAP(Y)座標に設定します(表1)。ドリルを立体定位フレームの新しい(0, 0)座標に移動し、ドリルを前方のダボピン貫通孔の上に中心にします。
      5. 0.25 mm x 5.5 mmのドリルビットを使って、立体的に定義された座標で5.5 mmの深さまでファイバースルーホールを掘り出します(表1)。
         注意:多重ファイバーアレイを立体視定位フレームから外す前に、余分な長いファイバーを使ってすべての穴が完全にクリアされているか確認してください。これにより、通し穴を取り除くために多ファイバーアレイを水平に調整・穴開ける回数が減ります。
   5. パッチコードコネクターと分岐パッチコードを接続します
      1. パッチコードの繊維を>10cm露出させます。繊維を同じ長さにするためにファイバースクライブでトリミングします。次に、パッチコードの12本のファイバーの周りにそれぞれ3/16インチと5/16インチのヒートシュリンクチューブを1本ずつ置きます。
         注意:チューブはコネクターに接着された露出した繊維を保護します。
      2. パッチコードコネクターの通し穴の一つに各ファイバーを挿入し、底面に約0.3mmのファイバーが露出するようにします。すべての繊維を挿入した後、21〜27Gの針先でパッチコードコネクターの表面に瞬間接着剤を塗り、ファイバーを固定します。
      3. パッチコードコネクターの上面にエポキシを0.5〜1cmのピラミッド型に塗布します。繊維が挿入された表面以外の部分をエポキシで覆わないようにしてください。エポキシは室温で一晩硬化させます。
      4. ヒートガンを最低設定で使い、エポキシの上の露出した繊維の熱収縮チューブを縮めます(<3〜5cm)。
         注意:この作業中はヒートシュリンクチューブに触れないように、火傷を防ぐようにしてください。
      5. 内径3mmの軟質プラスチックチューブを、残りの露出した繊維の長さに合わせて切り、チューブの縁にスリットを開けて、残りの露出した繊維をチューブ内に包みます。
      6. 透明なチューブに不透明な黒マーカーで色を塗り、ファイバーが見えなくなり、画像実験中の露出したファイバーによる照明を最小限に抑えます。
   6. パッチコードを磨きましょう。
      1. パッチコードコネクターはカスタムポリッシングパックの底面を下に固定します。パッチコードコネクターを6μm、3μm、1μm、そして0.01μmの研磨シートで、無限記号/シートの形を10〜20回の動作で研磨します。1μmおよび0.01μmのグリットシートについては、研磨前に蒸留水を5滴置いてください。
      2. コネクターの表面を拭き取り、余分な蒸留水を取り除いてください。パッチコードコネクターの磨かれた面に繊維の傷やひび割れがないかブライトフィールド顕微鏡で確認し、もしあれば再度研磨してください。
   7. パッチコード出力を確認してください。
      1. パッチコードのサブミニチュアバージョンA(SMA)コネクタ端をCMOSカメラベースのファイバーフォトメトリーイメージングシステムに接続します。視覚符号化ソフトウェアを使い、光度イメージングシステムのマニュアルに従い、CMOSカメラをパッチコードのSMA側にピントを合わせます。
         注:マニュアルはソフトウェアのアップデートに合わせて定期的に更新されています。光度測定システムの視覚コードは新しいソフトウェアのリリースによって頻繁に変更されるため、このマニュアルには最新のソフトウェア情報が含まれています。
      2. 光パワーメーターで20%出力の470nmパッチコード出力を測定してください。パッチコード出力が2.5 mW<場合はステップ1.1.7を繰り返します。
2. マルチファイバーアレイを製造する。
   1. 提供されたマルチファイバーアレイ(補足ファイル5、補足ファイル6)を、ステップ1.1.1で説明した技術仕様で樹脂を使って印刷します。
   2. マルチファイバーアレイを準備。
      1. マルチファイバーアレイの側面の4つのスロットそれぞれにM0.6真鍮製のヘックスナットを差し込み、六角ナットの穴を開口部の中央に合わせます。
      2. 各六角ナットのスロットの側面から21〜27Gの針先で瞬間接着剤を1滴塗り、必要に応じて補強用の滴を加えます。接着剤は室温で5分間乾かしてから次のステップに進みます。
      3. マルチファイバーアレイの側面の接着剤はカミソリの刃で削り取り、研磨パックにぴったり合うようにしてください。
      4. マルチファイバーアレイの表面側に余分な瞬間接着剤が乾いている場合は、カスタムのポリッシングパックと30μmグリットの研磨シートを使って、接着剤が除去されてマルチファイバーアレイの表面が平らになるまで研磨します。
      5. 1.22mmのドリルビットで、マルチファイバーアレイのダウエルピン貫通穴から余分な樹脂を手動で除去します。
   3. ファイバースルー穴を掘り出します(図2B-C)。
      1. 立体定位ドリリングアクセサリーの4つのピン穴すべてに合金鋼ダウエルピン(1.19 mm x 12.7 mm)を挿入し、マルチファイバーアレイの表面側(平らな側面)を上向きに位置付け、ダボピンは多繊維アレイのダボピン貫通穴を通します。
      2. ステップ1.4.2を繰り返します。ステップ1.4.5。
   4. マルチファイバーアレイ用のファイバーを準備してください。
      1. ファイバーストリッパーを使って、200μm、0.39 NAの光ファイバーの部分をプラスチックケースから剥がします。繊維をエタノールで洗浄してください。
      2. 繊維を繊維用包丁で~3〜5cmの区画に分割します。さらにファイバースクライクを使ってこれらの断片を半分に切ります。ブライトフィールド顕微鏡を使って、切断された部分の少なくとも一端に欠けや傷がないことを確認してください。少なくとも片方は傷のない繊維だけを使いましょう。
      3. 少なくとも長さ15mmの精密定規を明視野顕微鏡の下にテープで貼ります。ファイバーの傷のない面を定規の0mm位置に置きます(図2D)。各ターゲット領域ごとに所定の長さに繊維を切断します(表1参照)。
         注意:ファイバー長は、最も深いファイバーの立体定位D/V座標に6 mmを加え、その値をすべてのファイバーで調整して、それぞれのD/V座標と最深ファイバーのD/V座標の差に合わせることで計算されます。
   5. マルチファイバーアレイにファイバーを挿入します。
      1. マルチファイバーアレイを製造ホルダーの表面を下にして設置します。ダウエルピンで部品を合わせて固定します。
      2. 光ファイバーの長さをサイトに合わせ(表1)、切断したファイバーを多ファイバーアレイの適切なスルーホールに挿入し、無傷の面を上に向けて配置します。次の工程に進む前に、すべての繊維がしっかりと挿入されていることを確認してください。
      3. 21〜27Gの針先で瞬間接着剤を塗り、すべての繊維を固定します。接着剤を室温で最低30分ほどドライブさせてから続けてください。
   6. マルチファイバーアレイを表面下にして繰り返してステップ1.1.6を磨き上げます(図2E)。
   7. マルチファイバーアレイの効率を確認してください。
      1. 多繊維アレイの磨かれた表面をエタノールで洗浄し、インデックスマッチングジェルを塗布します。パッチコードコネクタに4本のダウエルピンを差し込み、G5ドライブスクリューと関連するドライバーでマルチファイバーアレイを固定します(図2F)。
      2. パワーメーターを使って、マルチファイバーアレイからの470nmおよび560nmのLED放射を測定します。以下の値を用いて効率を計算します:
         
      3. 効率が<75%の場合は、ステップ1.2.7.1–1.2.7.2を繰り返します。
         注意:再研磨しても効率が改善せず、ファイバーに傷がない場合は、マルチファイバーアレイのファイバーがパッチコードコネクターとずれている可能性があります。
   8. マルチファイバーアレイの準備をしてください(図2G)。
      1. マルチファイバーアレイの貫通穴に4本のダウエルピンを挿入します。ダウエルピンがマルチファイバーアレイの脳側から1mm以上突き出ないようにしてください。
      2. 棒ピンに瞬間接着剤の脳みそを塗ります。マルチファイバーアレイを使う前に、接着剤は室温で少なくとも10分間乾かしてください。

2. 手術(図1B)

1. 手術スペースと器具を用意してください。
   1. 無菌作業空間を確保するために、視位固定のフレームを清潔に保ちます。
   2. 滅菌吸収性縫合糸を入手してください。
   3. 細い鉗子、細いハサミ、ブルドッグクランプ2つをオートクレーブしてください。
   4. ベイパライザーにイソフルランが入っていることを確認してください。アイソフルランス、真空、酸素ラインのチューブが、蒸気発生器、誘導チャンバー、そして立体定位フレームのノーズコーンにしっかりと接続されていることを確認してください。
2. jRCaMP1b、GCaMP6f、GRAB-DA1mのアデノ関連ウイルスを取得します。
   注意:ウイルスを扱う際は必ず個人用防護具を着用してください。
   1. 必要に応じて、ウイルスを1×10〜¹³ 〜4×^10¹³ parts/ミリリットルの有効濃度まで希釈します。
   2. jRCaMP1bとGCaMP6fのアデノ関連ウイルスを1:1で混合して準備します。
   3. 1:1のjRCaMP1b:GcaMP6fウイルス混合物とGRAB-DA1mウイルスのアリコートを氷に置き、温度を4°Cに保つ。
3. 麻酔を誘発しろ。
   1. マウスを誘導室に入れ、室の扉を閉めます。酸素を1L/分から蒸気発生器に流れ込み始めます。
   2. ガスの流れを誘導室に導き、真空管を作動させて余分なガスを排出します。蒸発器の濃度を3%から5%の間に設定してください。
4. マウスを立体定位フレームに転送します。
   1. マウスの呼吸が1呼吸/秒に落ち着いたら、マウスを立体定位フレームに移動させます。ネズミの前歯を鼻のコーンのマウスピースのスロットにフックし、鼻のコーンをマウスの鼻にきつく固定します。
   2. ガスの流れを立体視位に切り替え、イソフルラン濃度を1%〜2%に設定して麻酔を維持します。ノーズコーンからガスを抜くために真空ラインを切り替えてください。
      注意:手術中はマウスの呼吸を監視し、深麻酔を1呼吸/秒で維持するためにイソフルラン濃度を必要に応じて調整してください。深麻酔は手術中、マウスが足の指のつまみに反応しないことを確認することで定期的に確認してください。
   3. 暖房システムを体温35°Cに保ち、マウスの目に眼軟膏を塗って乾燥を防ぎます。
   4. 立体定位耳バーを挿入し、頭蓋骨の両側、耳道のやや背側かつ前方に押し込むようにします。イヤーバーを締め、マウスの頭頂部に優しく圧力をかけて頭蓋骨を固定します。
5. 頭皮を切開の準備をしてください。
   1. ネズミの頭の上の毛を短く刈り取りします。脱毛ジェルをマウスの頭頂部に塗り、約1分間置きます。きれいな綿棒で残ったジェルを拭き取ります。
   2. 必要に応じて2.5.1を繰り返し、頭頂部の毛がすべて取り除かれます。
   3. 頭頂部の皮膚は綿棒で消毒し、ベタジン(10%ポビドンヨウ素溶液)を塗布し、その後70%エタノール溶液を塗布します。
6. 頭蓋骨を露出させろ。
   1. 頭蓋骨の中央線に沿って切開をし、ラムダのやや後方から前端の鼻静脈のやや前方まで伸びます。
      注:ラストラル鼻静脈は、嗅球と前頭前野の間の脳背側表面に位置する血管です。
   2. この切開の側面の剥削された皮膚を切り取り、涙滴型の切り傷を形成します。これにより頭頂骨、頭頂内骨の前端、そして鼻骨の前方部分が露出します(図2H)。
   3. 0.9%の生理食塩水と清潔な綿棒で頭蓋骨表面を優しく洗浄します。
7. 頭蓋骨を平らにしろ。
   1. 前端の鼻静脈が矢状縫合線と接する場所を特定します。この点を無菌メスの刃でマークしてください。
   2. 立体定位ドリルに#92カーバイドのドリルビットを挿入し、そのドリルを立体定位フレームに取り付けます。立体定位マニピュレーターを使ってドリルの先端を頭蓋骨表面のマークされた点に位置づけ、ドリルのX、Y、Z座標をゼロにします。
   3. 頭蓋骨のピッチは、マークされた点と後方の-8.25mmでZ深さを測定して均一にします。マークされた点と位置-8.25後方の横方距離を測定して頭蓋骨の水平ヨーを測定します。標識点に対して、中央線から2.0〜2.5mmの位置±2.0〜2.5mm、−7.0mmの位置でZの深さを測定して水平ロールを行います。
8. 開頭術や硬膜手術を行う。
   1. ドリルビットを#76または#78カーバイドのドリルビットに交換してください。矢状縫合線、前端鼻静脈、頭蓋骨表面の接合点でドリルをゼロにします。
   2. ドリルを各脳領域のA/PおよびM/L座標に移動させます(表1)。各部位で開頭切開を行い、27G以下の空のシリンジ先端を使って硬膜を慎重に取り除きます。
9. ウイルスを注射しろ。
   1. ガラスマイクロピペットを引いて、先端が少なくとも7mm細くなり、先端口部は10〜30μmにします。
      注意:以下のステップのいずれかの後にマイクロピペットに気泡が含まれている場合は、ステップ2.9.2–2.9.12を再起動してください。
   2. 空のガラスマイクロピペットのチップにミネラルオイルを詰めます。マイクロピペットの先端をナノリットインジェクターに挿入し、固定します。ナノリットインジェクターのインターフェースを使って、マイクロピペットからできるだけ多くのミネラルオイルを排出してください。
   3. ナノリットルインジェクターを立体定位フレームに取り付けてください。パラフィンワックスシートを小さく切り取り、ネズミの頭に置きます。
   4. jRCaMP1b:GCaMP6fウイルス混合物のピペット1μLをパラフィンワックスに流します。ナノリットルインジェクターの先端を下げてガラスマイクロピペットの先端をウイルス混合物に含め、インジェクターのインターフェースを使ってウイルスを詰め直します。
   5. 使用するすべてのウイルスがナノリットルインジェクターに移されるまで、2.9.4を繰り返します(表1)。パラフィンワックスは除去し、バイオハザード廃棄物容器に処分してください。
   6. 矢状縫合、頭頂の鼻静脈、頭蓋骨表面の接合部でインジェクターのマイクロピペット先端をゼロにします。
   7. 最も腹側から最も背側側に向く注入部位(表1)から始め、マイクロピペットの先端を各部位に移動させ、脳表面に触れるように下げ、立体視位のZ位置をゼロにします。
   8. 各部位でマイクロピペットの先端を脳内に下げ、注射部位に対して腹側0.1mmまで下ろします。次に、マイクロピペットの先端を最終注入部位に0.1mm上げます。周囲の組織がマイクロピペットの先端の周りに30秒ほど沈着するのを待ちます。
   9. ナノリットルインジェクターインターフェースを用いて、1:1のjRCaMP1b:GcaMP6fウイルス混合物を1〜2 nL/sの速度で300 nL注入し、現在の注入部位に混合液を分散させます。
   10. 注入完了後、マイクロピペットの先端を注入部位に少なくとも5分間は留めてください。マイクロピペットの先端をゆっくりと脳から持ち上げて、注射経路に沿ってウイルスが背側に広がるリスクを減らします。
   11. 各部位に1:1のjRCaMP1b:GcaMP6fウイルス混合物を注入した後、ナノリットル注入インターフェースを使ってナノリットルインジェクターのプランジャーを元の位置に戻します。マイクロピペットを取り外し、バイオハザード用の鋭利廃棄物容器に処分してください。
   12. 必要に応じて、GRAB-DA1m発現を標的とした各脳領域についてステップ2.9.2–2.9.11を繰り返します。各標的部位には、ウイルス混合物で使われる300 nLの代わりに150 nLを注入します。
10. マルチファイバーアレイを埋め込みます。
    1. マルチファイバーアレイを、埋め込み時に安定させるために、ダウエルピンでマルチファイバーアレイを固定できるアタッチメントを用いて立体視位フレームに固定してください(図2I)。
    2. 多繊維アレイの位置を調整し、各繊維がそれぞれの開頭切開の中心に整列し、最も長い繊維が脳表面に位置するようにします。この位置で立体定位マニピュレーターをゼロにし、マルチファイバーアレイをゆっくりと下げて、最も深いウイルス注入のD/V位置より0.25mm上まで下ろします(表1、 図2J)。
    3. 冷たいミキシング皿を氷の上に置き、セメント粉1スクープ、液体ベース4滴、触媒1滴を加えます。20秒ほど混ぜてください。
       注意:液体セメントを使用する場合、さらに必要になる場合はこの工程を繰り返してください。
    4. 注射器と23〜31Gの針を使って、多繊維アレイと頭蓋骨の間の空間に液体セメントを移します。
    5. 薄いプラスチック製のアプリケーターやシリンジ針を使って液体セメントを塗布し、マルチファイバーアレイの四辺を完全に覆い、頭蓋骨からピラミッド状の形状を作り出します(図2K)。セメントを少なくとも15分間乾かします。
    6. 切開部に沿って皮膚を縫合し、頭蓋骨が露出しないようにしてください。
11. マウスの回復を待ちましょう。
    1. イソフルラン濃度を0に減らします。
    2. ネズミを立体定位フレームから温熱パッドに移し、マウスが意識を取り歩けるようになるまで待ってからケージに戻します。
    3. 実験を始める前に、少なくとも2週間はマウスの回復を待ちましょう。

3. 多部位、二色カルシウムイメージング(図1C)

1. データ取得装置(DAQ)の設定。
   1. GNDをCh7ポート上のAGNDポートに電気ワイヤーで接続します。
   2. DIO0を電気ワイヤーでCh0ポートに接続します。
2. 光度測定システムをDAQに接続してください。
   1. 分割型BNCケーブル(片端はBNCコネクタ、もう片端は赤と黒の電気線)のBaby Neill Constant(BNC)コネクタ端をフォトメトリーシステムの入力ポートに接続します。別の分割BNCケーブルのBNCコネクタ端をフォトメトリーシステムの出力ポートに接続します。
   2. フォトメトリーシステムの入力ポートに接続された分割BNCケーブルを、その赤い線の端をDAQのDIO1ポートに接続します。フォトメトリーシステムの出力ポートに接続された分割BNCケーブルを、その赤い線の端をDAQのCh1ポートに接続します。
   3. 両方のスプリットBNCケーブルの黒いアース線をDAQ GNDポートに接続します。
3. 挙動カメラと光度カメラを同期させてください。
   1. 複数の挙動カメラをデイジーチェーンで連結し、複数の角度から行動を同時に記録します。
      1. プライマリビュアカメラの光絶縁出力(ピン4、白線)をセカンダリカメラの非絶縁入力(ピン1、緑線)に3.3 KΩ抵抗で接続します。プライマリカメラの3.3V出力(ピン3、赤線)を同じ3.3KΩ抵抗とDAQのチャル2に接続します。
      2. 各セカンダリカメラの光絶縁出力を3.3 KΩ抵抗で3.3 V出力に接続します。
      3. プライマリカメラのグラウンド(ピン6、茶色線)を各セカンダリカメラのアースに接続します。すべてのカメラのグラウンド線を、Ch2ポートの上にあるDAQ AGNDポートと測光システムの出力グラウンドに接続してください。
4. 関連するイメージングソフトを使って、ビヘイビアカメラの設定をカスタマイズしてください。
   1. 「取得フレームレート」を45Hz、ゲインを1に設定します。
   2. 露光時間を2998μs、下限100μs、露出上限を150,000μsに設定します。
      注意:「取得フレームレート」は実際にキャプチャされるフレームレートとは限りません。露光時間や要求されるデータ帯域幅によっては、この値を最終イメージング周波数より高く設定する必要がある場合があります。必要に応じて、「取得フレームレート」を調整し、表示される「結果フレームレート」を40Hzにします。
5. DAQソフトウェアの設定(補足ファイル7)。
   1. DAQソフトウェアでDAQを「デバイス」として追加し、「構成パネル」に切り替えます。
   2. 「チャンネル」タブの「アナログ入力」でチャンネル0–2を有効にします。「デジタル」でチャンネル0を有効にしてください。
      注意:Ch0はトランジタ-トランジタロジック(TTL)信号、Ch1は光度測定システム、Ch2はデイジーチェーンカメラに対応します。
   3. 「アナログ入力」の項目で、チャンネル0を「TTL」、チャンネル1を「Photometry_system」、チャンネル2を「Behavior_cameras」と名付けます。これは「トランジスタ-トランジスタロジック」の略です。「デジタル」欄でチャンネル0を「TTL_trigger」と名付けてください。
   4. 「トリガー」タブでトリガーを手動に設定してください。「Sample Rates」タブで、サンプリングレートを350Hzに設定します。
   5. 「ディスプレイパネル」に切り替え、「ストリップ」、「スカラー」、「出力」のウィンドウをグラフィカルユーザーインターフェースに配置してください。
6. フォトメトリーシステムソフトウェアの設定(補足ファイル8)。
   1. 視覚符号化ソフトウェアで、5V TTLパルスを受信して録画をトリガーし、各フレームのタイムスタンプ、各ファイバーの赤・緑チャネルの蛍光放射、そして光度システムのマニュアルに記載された生映像を保存するワークフローを開発します。
   2. ワークフロー内のフォトメトリーシステムのノードを使い、システムが560、470、415 nmのLEDを交互に120Hzで記録し、機能的なフレームレート40Hzを達成できるように設定していることを確認してください。
      注:この時分割多重化(TDM)方式は、GCaMPとRCaMP間のスペクトル重なりを時間的に分離することで、各指標が連続したフレーム間で独立して励起されることを保証します。ここで用いられている記録システムは、最適化されたバンドパス発光フィルター(緑チャンネル:500–530 nm、赤チャンネル:>580 nmロングパス)を用い、検出される光子を各指示器が主に放出する波長に制限することでスペクトルクロストークをさらに最小化しています。415 nmの等体波長はGCaMPとRCaMPの両方を均等に励起しますが、カルシウム依存の蛍光変化は最小限に抑えられ、動きのアーティファクト制御信号を提供します。TDM励起とスペクトルフィルタリングを組み合わせることで、470 nmフレームは主にGCaMP活性を捉え(図3A)、560 nmフレームは主にRCaMP活性を捉え(図3B)、415 nmフレームはモーションコレクションのためのカルシウム非依存の参照信号を提供します。
7. 生 体内 光度測定の記録を行う。
   1. ステップ2で示されたウイルス注射と多繊維アレイ埋め込みを受けたマウスを入手してください。
   2. パッチコードと埋め込みされたマルチファイバーアレイの接続面をエタノールと綿棒で清掃してください。視覚符号化ワークフローのフォトメトリーシステムのノードとフォトメーターを使い、415、470、560のLEDのそれぞれの出力レベルをパッチコードから約1.2 mWの照明出力に設定しました。
   3. パッチコードの接続面にインデックスマッチングジェルを塗布します。パッチコードをマウスの埋め込み型マルチファイバーアレイに、アレイのダウエルピンで合わせ、パッチコードを埋め込み型の表面と面一になるまでスライドさせます。
   4. パッチコードのネジを締めてマルチファイバーアレイをパッチコードに固定してください。実験を始める前にネズミが慣れていくのを待ちます(図2L–M)。
   5. ファイル名を設定する。
      1. 各ビヘイビエーションカメラについて、赤い丸の「録画」ボタンを押して、ビハビエーションカメラ録画ソフトでそのカメラの録画ウィンドウを開き、ファイル名を指定します。
      2. DAQソフトウェアを開き、歯車ボタンをクリックして「ログオプション」に移動し、ファイル名を指定します。
      3. フォトメトリーシステムのビジュアルコーディングワークフローの「PhotometryWriter」ノードをクリックしてファイル名を指定します。
   6. ビヘイビアカメラソフトウェアの録画ウィンドウで、各カメラの「録画開始」をクリックします。次に、光度システムの視覚コーディングワークフローで再生ボタンを押し、DAQソフトウェアで録画ボタンを押します。
   7. TTLスイッチをクリックすると、すべてのカメラで同期録画を開始します。
   8. 録音終了。
      1. 同期カメラ録画を終了するにはTTLスイッチをクリックしてください
      2. フォトメトリーシステムのビジュアルコーディングワークフローで停止ボタンを押し、「ビハビエーションカメラ」ソフトウェアの録画ウィンドウで「録画を停止」してください。
   9. 実験終了までステップ3.7.5–3.7.8を繰り返し、マウスを切断します。
      注:以下の実験では、光度測定および挙動カメラのデータストリームをDAQソフトウェアの出力を用いてカスタムコードと整合させることができます。具体的には、(1) TTL電圧の変化はTTLの開始・オフセット時刻を示し、(2) 挙動カメラ電圧の変化はカメラシャッターが各フレームの動作映像を撮影するために開閉する時刻を示し、(3) DAQに記録された初期の光度システム電圧の変化をTTL開始時刻と比較し、視覚符号化ソフトウェアから出力されるフォトメトリーカメラのタイムスタンプを比較することでフォトメトリーカメラのタイムスタンプを決定できます。

4. データ処理(図1D、補足ファイル9)

1. カルシウムイメージングデータの前処理。
   1. カルシウムイメージングデータのデインターリーブフレームを分離し、415 nm、470 nm、560 nm LEDに応じて個別に記録された信号ストリームを作成します。
   2. ベースラインドリフトを補正するために、適応反復重みペナルティ最小二乗アルゴリズム(airPLS)⁴⁴ を用いてください。
   3. ΔF/F は次のように計算します:
      
      注意:基準期間は実験的操作前の安定した時代(例:社会的パートナーを導入する前)であるべきです。ベースライン期間が短すぎ(<2〜3分)や大きな変動が動きアーティファクトによって汚染される可能性がある場合は、制限されたベースライン期間ではなく、セッション全体の平均蛍光量を用いて正規化を検討してください。
2. 動きのアーティファクトは補正済み(図4A)。
   1. 回帰分析に基づくアプローチを用いてください。ただし、他の方法も適しています( 表2参照)
   2. 中央値を用いて領域間の信号大きさを正規化するZスコアΔF/F信号:
      
   3. L1正則化を用いたラッソ回帰を適用します。Lasso(最小絶対縮小および選択演算子)は、情報のない予測因子の係数をゼロに縮小することで、自動的な特徴選択を行います。
      1. 正則化パラメータ(α = 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100)でグリッドサーチを行います。グリッドサーチは、モデルの複雑さと過学習との最適なバランスを特定します。このステップは、標準的な機械学習ライブラリ(例:Pythonのscikit-learn)にあるクロス検証ルーチンを用いて完全に自動化できます。
      2. 二色光度測定(推奨手法)では、12の記録領域にまたがるすべての415 nm等爆制御チャネルを予測因子として使用します(理由は 図4B–C および 結果 を参照)。単色光度測定(GCaMPのみまたはRCaMPのみ)では、予測行列を補正対象のカルシウム信号と同じファイバーからのアイソベスト信号のみに制限します。
      3. 予測信号と観測信号の平均二乗誤差を最小化するモデルを選択します。
   4. 信号から予測される運動成分を差し引くことで、補正された活動が得られます。
3. 725msのウィンドウを持つSavitzky-Golayフィルターを使って信号を平滑化します。

結果

最大12のSBN脳領域から同時に記録するために、上記のプロトコルに従ってカスタマイズ可能なマルチファイバーアレイを構築しました。手術後の回復後、マウスは社会的相互作用中に記録されました(図5)。すべての実験において、CD1被験者のオスマウスは自宅ケージ内の雄Balb/cマウスと相互作用することが許可されました。Vgat-Creマウスを用いて、GABA作動性ニューロンで11のSBN脳領域でcre依存的にjRCaMP1b⁴⁰を発現させ、同じ脳領域で非GABA作動細胞でCre排除方式でGCaMP6f³⁹を発現させ、同じ脳領域⁴⁵でGRAB-DA1m³³を発現させ^ました(表1)。線維ターゲティングの組織学的確認は、過去の論文^42,43で確認できます。ここでは、動きのアーティファクト訂正のためのさまざまな手法の性能を検証しようとしました。具体的には、以下を比較しました:(1) 中央値フィルター単独;(2) 同じ繊維のアイソスベスト信号のみを用いたL1正則化を用いたラッソ回帰(単一予測器アプローチ)¹¹および(3) すべての繊維からのアイソスベスト信号を予測子として用いるラッソ回帰(マルチ予測器アプローチ)^41,42(図4A)。重要なのは、Lassoベースの手法は、アイソスティック周波数(415nm)LEDに応答して生成される活性非依存蛍光信号を用いて生信号を補正するのに対し、中央値フィルター平滑化は活性に依存しない信号を考慮しない点です。

モーション補正は絶対高周波ノイズとジッターの2つの異なる指標を用いて評価しました。高周波ノイズは、信号の一階微分の標準偏差として定義され、これは急速な信号変動の大きさを反映しています。ジッターは信号の微分の変動係数として定義され、フレームごとの信号変動の大きさを信号の微分の平均に対して反映しています。Lassoベースのアプローチ(単一予測器および多重予測器)は、高周波ノイズとジッターの低減において中央値フィルターを大幅に上回っており、マルチ予測因子補正は単一予測因子補正をわずかに上回ることが分かりました(図4C–D; 高周波ノイズ、18回の記録セッションで23信号に対してn=414:Kruskal-Wallisテスト、H = 501.9420、p < 0.001;ポストホックのMann-Whitney大学によるボンフェローニ補正:平滑化回帰 vs 単一サイト回帰 ***p < 0.001、平滑化回帰 vs 多サイト回帰 ***p < 0.001、単一サイト vs マルチサイト **p = 0.0073;ジッター:クルスカル・ウォリス検定、H = 495.6685、p < 0.001;ポストホック・マン・ホイットニー大学検定(ボンフェローニ補正付き):平滑化回帰 vs 単一サイト回帰 ***p < 0.001、平滑化回帰 vs 多サイト回帰 ***p < 0.001、単一サイト vs マルチサイト ***p = 0.0006)。具体的には、マルチプリメンタアプローチ(すべてのファイバーアイソスベストスを用いる)は、赤チャネル(RCaMP)信号に対して有益性を示しました。12個中5個の赤色信号は単一予測因子補正(n=18記録/領域)と比較して有意に低い残留ノイズを示しました。ジッターについては、BNST(t検定、t = 5.42、***p < 0.001)、POA(t検定、t = 2.68、*p = 0.011)、AH(t検定、t = 2.66、*p = 0.012)、PAG(マン・ホイットニーU検定、U = 279、***p < 0.001)で多重予測因子優位性が示されました。高周波ノイズに関しては、BNST(マン・ホイットニーU検定、U = 285、***p < 0.001)、POA(マン・ホイットニーU検定、U = 292、***p < 0.001)、AH(t検定、t = 7.10、***p < 0.001)、PAG(t検定、t = 13.72、***p < 0.001)、LHb(t検定、t = 5.47、***p < 0.001)が多重予測子の優位性を示しました。グリーンチャネル(GCaMP)信号では、ジッターまたは高周波ノイズ指標において12領域すべてにおいて、2つのLassoアプローチに有意な差は認められませんでした(いずれもp>0.05、統計検定の全リストは 表3参照)。これは、二色光度測定において、クロスチャネルのアイソスベスト情報を取り入れることで赤信号のモーション補正が改善されることを示唆しており、おそらくグリーンチャネルアイソスベストスティックがよりクリーンな動き情報を提供するためです。これらのデータは、アイソスベストスティックベースの回帰法を用いたモーションアーティファクト補正が単純なフィルタリング手法を大きく上回り、マルチチャンネル回帰がデュアルカラー録画に特有の利点をもたらすことを示しています。

図1。ソーシャル・ビヘイビア・ネットワークからの多拠点二色ファイバーフォトメトリーによる記録。(A) マルチファイバーアレイの構築方法の回路図表現。 (B) 手術ワークフローの回路図表現。 (C) 二色カルシウムイメージング実験の概略的表。 (D) アイソスベスト信号を用いて動作補正信号を計算する例。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2。製造および手術のための主要な手技の画像。(A) 録音用に使えるパッチコード。 (B) 0.25 mm x 5.5 mmのドリルビットをファイバースルーホールの上に配置したカスタムの立体視定位ホルダーにマルチファイバーアレイを設置します。 (C) すべてのファイバー貫通孔をクリアし、六角ナットを接着したマルチファイバーアレイ。 (D) ファイバースクライクを使ってファイバーを切断する。 (E) すべてのファイバーをスーパーグルーで貼り付け、カスタム研磨パックに配置したマルチファイバーアレイ。 (F) パッチコードコネクタをマルチファイバーアレイに合わせてねじ込む拡大図。 (G) ダウエルピンを貼り付けた完成型マルチファイバーアレイ。 (H) 頭蓋骨を露出させるために頭皮を切開した立体定位フレームにマウスを固定。 (I) 手術中に多繊維アレイを操作するために立体定位マニピュレーターに接続された製作されたマルチファイバーアレイ。 (J) 脳内に降ろされるマルチファイバーアレイの拡大図。 (K) マルチファイバーアレイを完全に下げて頭蓋骨にデンタルセメントで固定。 (L) 記録前にパッチコードにしっかり接続された動物のマルチファイバーアレイ。 (男性) 収録前後にパッチコードで繋がれたケージ内の動物のズームアウトビュー。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3。スペクトル分離。カルシウム指示器間のスペクトルクロストークが最小限であることを示すトレースの例。GCaMP6f(青色)信号は470 nm励起時に強靭な活性化を示しますが、560 nm励起では無視できるほどの応答を示します。jRCaMP1b(赤色)信号は逆パターンを示し、560 nmからは強い活性化を示しますが、470 nmの照射には最小限の応答を示します。(A) GCaMP6fおよびjRCaMP1b信号を470 nm照射のみで同時に記録。(B) (a)と同じですが、560 nmの照射のみです。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4。多ファイバー信号処理の異なる手法の比較。(A) 多サイト回帰に基づく光度信号補正を描いた回路図。このアプローチは、利用可能なすべての415nmアイソスベスト信号を各カルシウム依存信号に線形にマッピングする逐次処理ステップを含みます。この信号から予測された運動成分を差し引いて、最終的な活動の読み取り値を算出します。2つの信号から、動きアーティファクトが強く存在するzスコアのΔF/F信号。(B)上から下へ:同じファイバー/イメージングチャネルからのアイソスベスト信号(運動アーティファクトを描写)、平滑化のみのRCaMP(左)またはGCaMP(右)信号(中央値フィルタリング済み、緑)、同じファイバー/イメージングチャネル回帰補正信号(シアン)、多ファイバー回帰補正信号(青)。(C) 左:各記録信号(n = 21セッション)の平均高周波ノイズスコア。高周波ノイズは各信号の一次微分の標準偏差として計算されます。ノイズスコアは、1) ベースライン補正されたが補正されていない信号(グレー)、2) ベースライン補正かつ中央値フィルタリングされた信号(ピンク)、3) Savitsky-Golay平滑化によるベースラインおよび単一ファイバー回帰補正信号(シアン)、4) Savitsky-Golay平滑化によるベースラインおよび多ファイバー回帰補正信号(青)で示されています。中心:平滑化、単一ファイバー回帰、または多ファイバー回帰のみを用いた平均ノイズ除去割合で、23信号すべてに集約されたものです。除去されたノイズの割合は、補正によって生のノイズレベルと比べて、生のベースライン補正信号におけるノイズ全体のレベルに対して割合として計算されます。データはSEM±平均として報告されます(Kruskal-Wallis検定、H = 501.9420、p < 0.001;事後のMann-Whitney U検定とボンフェローニ補正:平滑化回帰 ***p < 0.001、平滑化回帰 vs 多サイト回帰 ***p < 0.001、単一サイト vs 多サイト **p = 0.0073)。右:単一ファイバーと多ファイバー回帰補正の結果、高周波ノイズが統計的に異なっている信号の割合(信号タイプ別に分けて)。23の信号それぞれについて、単一サイト補正後のノイズレベルを、独立t検定(正規分布の場合)またはマン・ホイットニーU検定(非パラメトリック代替法)を用いて複数サイト補正後のノイズレベルを比較しました。青色のセグメントは、複数サイト補正で単一サイト補正よりもノイズが有意に低い信号を示します(p < 0.05)。グレーの区間は補正方法間で有意な差がない信号を示します。シアンセグメントは、単一サイト補正によってノイズが大幅に減少した信号を示します。E: Vgat- GCaMP6f。DA:掴んで。I: Vgat+ jRCaMP1b。(D) (C) と同じですが、フレームごとの変動(ジッター)を示し、各信号の変動係数の微分として計算されます(Kruskal-Wallis 検定、H = 495.6685、p < 0.001;ポストホック・マン・ホイットニー U 判定(ボンフェローニ補正付き):平滑化回帰 vs 単一サイト回帰 ***p < 0.001、平滑化回帰 vs マルチサイト回帰 ***p < 0.001、単一サイト vs マルチサイト ***p = 0.0006)。統計検定および結果の完全な一覧については表3を参照してください。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5。二色ファイバーフォトメトリーのマルチサイト展示。 社会的行動中に同時に記録された複数の指標タイプの代表的な信号(居住者-侵入者テスト、侵入者進入時代)。トレースでは、同じ動物内の社会行動ネットワークサイトで正規化されずベースライン減算されたGCaMP6f(Cre陰性ニューロン)、jRCaMP1b(GABA作動性Vgat-Cre+ニューロン)、GRAB-DA1m(核伏位のドーパミンセンサー)が検出されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1。各ターゲット社会行動ネットワーク脳領域ごとのウイルス座標と繊維長。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2。多サイトファイバー光度測定における運動アーティファクト補正手法の比較。 以下のモーションアーティファクト訂正手法の基礎原理、最適なユースケース、利点と限界:単純な線形回帰、L1正則化を用いたラッソ回帰(マルチ予測器アプローチ使用)、ベイズ生成モデリング、周波数ベースのスケーリング、反復重み付けされた最小二乗法。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表3。図4に用いられた統計検定の詳細と結果。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル1。パッチコードコネクタ用の3Dプリントファイル。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル2. 3D通孔のないパッチコードコネクターのプリントファイル。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル3. 3D立体定位掘削アクセサリーのプリントファイル。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル4。カスタム研磨パックの設計図。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル5. 3D 12のSBNサイトを対象としたマルチサイトフォトメトリーアレイのプリントファイル。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル6. 3Dスルーホールなしのマルチサイトフォトメトリーアレイのプリントファイル。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル7。DAQソフトウェア用のDAQ設定ファイル。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル8。フォトメトリーシステム用のビジュアルコーディングファイル。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル9。プロトコルStep 4およびモーションアーティファクト修正比較に使用されるPythonコード。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

ファイバーフォトメトリーは、自由に動^く動物の深部脳領域や特定の細胞タイプからの集団カルシウム活動を記録するための有用かつコスト効率の高い技術です。複数の脳領域から同時に記録することで、自然主義的行動や頭部固定型準備中の領域や投影間の動態を比較^{できます。}ここでは、特注のファイバーアレイと市販カメラシステムを用いて、脳の皮質下「社会的行動ネットワーク」の最大12の脳領域から2色で記録する方法を詳述します。以下では、この手法を実装する際の重要なステップ、可能な修正案やトラブルシューティング戦略、そして既存手法と比較したその重要性と限界について論じます。

このプロトコルは主に3つの段階から成り立っています。まず、マルチファイバーアレイやパッチコードの製造では、立体定位座標にカスタム3Dプリント部品を穴開けし、その後ファイバーの挿入、研磨、品質管理を行い、≥75%の光透過率を確保します。正確な穴あけの位置合わせ(±0.03mmの精度)と徹底的な研磨が不可欠です。一般的な故障には、光の透過率が低い(<75%)やファイバーの通過穴の詰まりがあります。低効率は通常、切断時の繊維の汚れや不適切な研磨が原因です。解決策としては、挿入前に明視野顕微鏡下で各ファイバー端が無傷であることを確認(ステップ1.1.6.2)、完全なグリットグラデーション(6μm→0.01μm、ステップ1.1.6.1)による再研磨、ファイバークリーバーブレードの鋭さの確保などがあります。スループットを向上させるために、精密翻訳ステージを用いたカスタムファイバーカッティングジグやレーザーベースの切断システム(ステップ1.2.4)などのワークフロー変更を実施できます。高精度システムを備えた商業用3Dプリントメーカーは、手動の穴あけの必要性を減らすことができます(ステップ1.1.3–1.1.4、ステップ1.2.3)が、寸法精度はバッチごとに異なる場合があります。

次に、外科的埋め込みは頭蓋骨レベリング(許容±0.03mm)、11〜12箇所へのウイルス注射、多繊維アレイの埋め込み、その後セメント固定を行います。スカルレベリングが許容範囲を超えると、ターゲティングの精度が損なわれます。これは、前後の複数のポイントで8.25 mm離れた位置でピッチを測定し、±2.0〜2.5 mmの側方位置でロールを測定しつつ、耳バーが頭蓋骨を完全に安定させることで軽減できます。ウイルス注入マイクロピペット内の気泡は正確な投与を妨げ、マイクロピペット準備の再開始(ステップ2.9)を要求します。マルチファイバーアレイの埋め込み中は、頭蓋骨表面から上方にセメントピラミッドを作ってセメントピラミッドを組み立て(ステップ2.10.3–2.10.5)、十分な乾燥時間を確保(≥15分)を確保し、ファイバーチップとのセメント接触を避けてください。

第三に、記録およびデータ処理にはDAQシステムによるカメラ同期、LED電力キャリブレーション(0.1 mW/ファイバー、1.2 mW/12ファイバーパッチコード)、およびアイソスベスト制御による信号前処理が含まれます。ここで紹介するモーションコレクションパイプラインはLasso回帰を用いており、これはマルチチャネル予測器構成に適しており、情報のない予測変数を自動的にゼロに縮小し、アーティファクト訂正に意味のあるものだけを保持します。この特性は二色光度測定に特に有利です。赤と緑の両方のチャネルからのアイソスベスト信号を予測子として含めることで、Lassoは本物の動き情報を持つチャネルを選択的に活用し、同じファイバー補正単独と比べて赤チャネル(RCaMP)信号のノイズ低減を大幅に向上させます(図4C–D)).Lassoは最も有益な予測因子を自動的に特定するため、利用可能なすべてのアイソスベストチャネルを入力として使用することを強く推奨します。とはいえ、ラッソ回帰はいくつかの有効な補正手法の一つであり、代替案にはベイズ生成モデル⁴⁶、頻度ベーススケーリング⁴⁷、反復重み最小二乗法(IRLS)⁴⁸があり、いずれも同等のアーティファクト削減をもたらすと考えられており、実装ガイダンスは 表2に示されています。最適化された前処理にもかかわらず持続的に信号品質が悪いのは、ハードウェアや外科的な問題を示している可能性が高く、ステップ1〜2を再検討すべきです

これらの手続き上の考慮に加え、デュアルカラーフォトメトリーはスペクトル分離に関連する追加の技術的課題ももたらします。二色光度測定で重要な考慮事項は、緑色と赤色カルシウム表示器のスペクトル重なりの管理です。GCaMPとRCaMPの発光スペクトルが重なり合うためスペクトルクロストークを完全に除去するのは難しいですが、インターリーブLED励起(GCaMPは470 nm、RCaMPは560 nm、アイソスベストは415 nm)と最適化されたバンドパス発光フィルターを用いた時間的多重化アプローチにより、この問題を大幅に緩和しています。実際には、クロストークは最小限に抑えられます。470nm刺激では赤色チャネルではほとんど活性が見られず、逆に560nm刺激では緑チャネルではほとんど活性が見られません(図3)。残留スペクトル重なりを懸念する研究者は、特定の指示器の組み合わせに基づいて最大スペクトル分離を持つ狭帯域通過発光フィルターを選択することで、さらにシステムを最適化できます。

大規模な神経記録の他の手法と比べて、特注の2色マルチサイトファイバーフォトメトリーは多くの重要な利点を提供します。まず、単線ファイバー光度測定^1,2,3、^{現代の細胞}外記録^4,6、または皮質表面イメージング^8,9は単一または空間的に制約された脳領域(例:皮質表面)に限定されますが、ここで共有するカスタマイズ可能な3Dプリント設計は、200μm光ファイバーで脳のどこにでも最大12の脳領域をターゲット化することを可能にします。比較すると、市販のマルチファイバーフェルール^5,7は100μmの光ファイバーのみをサポートし、同様にフェルールの線形配列の真腹側にある限られた脳領域に制限されています。特定の脳領域からの標的化と記録に関しては、主なトレードオフはファイバーの直径と光度計システムの視野との間で起こります。200μmファイバーを備えた3Dプリントマルチファイバーアレイは、市販のマルチファイバーフェルールに比べて各サイトでより広い面積を記録します。現行のプロトコルでは、フォトメトリーシステムのカメラ視野は記録を200μmで12本の光ファイバーに制限しています。この制約は、最大60本のファイバーに対してファイバー径を100μmに縮小するか、より大きなカメラ対物レンズを持つカスタムフォトメトリーシステムを構築することで克服できます。

最後に、このカスタマイズ可能な2色多サイトファイバーフォトメトリープラットフォームは、11〜12の脳領域にわたる2つの遺伝的に異なる神経集団の神経活動動態を縦断的に追跡するために用いられています。 Vgat-creマウスにおいて、SBN集団間でCre依存的なRCaMPおよびCre排除GCaMPを発現するCre-in/Cre排除戦略を用い、攻撃的経験と観察の両方が将来の防御的社会的相互作用においてSBN全体の活動動態の共有パターンを促進することが示^{されました。}同じウイルス戦略を Esr1-creマウスで用いて、エストロゲン受容体アルファ発現ニューロンと非発現ニューロンから記録したところ、領域特異的な社会行動パターンはSBN全体の社会行動コードのホルモン感受性の急速な再スケーリングと関連し、ホーム領域での行動関連活動を促進しました⁴³。これらの領域特異的な行動やネットワークコードの違いは、オスマウスにおける循環テストステロンを必要とします。これらの研究はウイルスアプローチと単一のCreラインを使用していましたが、今後の研究では、交差ウイルスアプローチ、遺伝的に発現したカルシウム指標、または神経調節物質および神経ペプチドシグナル伝達の蛍光報告体などを活用してこれらの手法を拡張する可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#76 ドリルビット	ドリルビットシティ	#76
#78 ドリルビット	ドリルビットシティ	#78
#92 ドリルビット	ドリルビットシティ	#92
0.01 & mu;Mグリット研磨シート	ソーラボ	LFCF2
0.25 mm x 5.5 mm ドリルビット	ドリルビットシティ	カスタム製品	0.25 x 5.5 mmのドリルビット、製造会社に連絡
1 & mu;Mグリット研磨シート	ソーラボ	LF1D
12ファイバー分岐パッチコード	ドーリック・レンズ	CustomBBP(12)_200/220/3000-0.37 _5m_SMA-12xCL_LAF
200 & mu;M光ファイバー	ソーラボ	FT200UMT
3 & mu;Mグリット研磨シート	ソーラボ	LF3D
30 & mu;Mグリット研磨シート	ソーラボ	LF30D
6 & mu;Mグリット研磨シート	ソーラボ	LF6D
吸収性縫合	エティコン	J421H
適応的反復重み付けされたペナルティ最小二乗文書	グーグル	該当なし	https://code.google.com/archive/p/airpls/
合金鋼のダウエルピン	マクマスター・カー	98381a983
行動監視カメラ	テレダインFLIR	ブラックフライS
盆栽	盆栽ソフトウェア財団	バージョン 2.9.0
ブライトフィールド顕微鏡	ライカ	ES2
ブルドッグクランプ	ファインサイエンスツールズ	18038-45
DAQ	計測コンピューティング	MC USB-200シリーズDAQ
DAQソフトウェア	計測コンピューティング	ダカミ
ドリル	コップ・インストゥルメンツ	モデル1911 立体走位ドリル
ファイバークリーバー	ソーラボ	XL411/CLVB
ファイバー光度測定システム	神経光度測定	FP3002
ファイバー光度測定システムマニュアル	神経光度測定	該当なし	ウェブページホスティングデバイスマニュアル:https://neurophotometrics.com/documentation
ファイバースクライブ	ソーラボ	S90C
ファイバーストリッパー	ソーラボ	T10S13
細かい鉗子	ファインサイエンスツールズ	11252-00
細いハサミ	ファインサイエンスツールズ	14084-08
G5ドライブスクリュー	オープンEphys制作サイト	OEPS-7105
G5ドライバー	オープンEphys制作サイト	OEPS-7121
GCaMP6f	PNIウイルス神経工学研究室	EF1a-CreはGCaMP6f-WPRE-hGHpA より上がる
グラブダ	アッドジーネ	hSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
ヒートパッド	アドロイト医療用品	HTP-1500
暖房システム	ケント・サイエンティフィック	RT-0515
イソフルラン	コヴェトルス	29405
jRCaMP1b	アッドジーネ	pAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
M0.6 真鍮製六角ナット	MetricScrews.us	21614
メタボンドセメント試薬とツール	パーケル	S380
MicroFine ABSに似た樹脂3Dプリント	プロトラボ	カスタム製品	補足コードファイル1-3、5、6を参照
ナノリットルインジェクター	ドラモンド・サイエンティフィック・カンパニー	ナノジェクトII	ナノリットルインジェクター
パラフィンワックスシート	アムコア	パラフィルムM万能ラボフィルム
ピペッター	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	4641310N
研磨パック	プリンストン大学物理学科機械工場	カスタム製品	補足コードファイル4を参照
パワーメーター	ソーラボ	PM100D
プラルーベ眼軟膏	デクラ	P1490-1
パイソン	Pythonソフトウェア財団	該当なし
パッチコード用のソフトプラスチックチューブ	マクマスター・カー	3774N4
スピンビュー	テレダインFLIR	バージョン 1.25.0.52	挙動カメラを制御するイメージングソフトウェア
立体定位フレーム	コップ・インストゥルメンツ	モデル1900
TMACのドキュメント	該当なし	該当なし	TMACコード:https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
立体定位フレーム用のチューブ	サン・ゴバン	E-3603
ヴェポライザー	ケント・サイエンティフィック	VetFlo蒸気化器