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方法論記事

中枢神経系病原体検出のための脳脊髄液のメタゲノミック次世代シーケンシング

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DOI：

10.3791/70075

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2026年4月17日

 ,  ,  , 
1University of California, San Francisco Weill Institute for Neurosciences, Department of Neurology, University of California, San Francisco

この記事について

サマリー

この研究プロトコルは、脳脊髄液のメタゲノム次世代シーケンシング(mNGS)における最適化されたワークフローを示しています。低バイオマスサンプル特有の課題に対応することで、多様な資源環境での堅牢な病原体検出を可能にし、神経感染症研究の多用途な基盤を提供します。

要約

メタゲノム次世代シーケンシング(mNGS)は、臨床および研究現場で偏りのない病原体検出および宿主転写プロファイリングのための強力なツールとして登場しています。中枢神経系(CNS)感染症の診断における有用性はますます認識されていますが、脳脊髄液(CSF)サンプルは核酸の量が少なく分解されやすいため、独自の課題を抱えています。本研究は、CSF mNGSに特化したIlluminaシーケンシングプラットフォーム向けに最適化された研究ベースのプロトコルを提示し、サンプル取り扱い、核酸抽出、ライブラリー調製、シーケンス、バイオインフォマティクス解析を網羅します。また、高資源環境および低資源環境の両方に対応可能な品質管理手法も提供されており、毛細血管電気泳動の代替手段も含まれています。本研究は、NovaSeqベースの高度なワークフローとコスト意識の高いNextSeqベースのワークフローという2つの代表的なコホートを通じて、プロトコルの堅牢性を示しています。これらのコホート全体で、病原体は50%以上で検出されており、資源制約のある適応があってもこの方法の診断可能性が示されました。このプロトコルは再現可能なCSF mNGSを促進し、神経感染症の研究や診断における多様な応用の基盤を提供します。

概要

メタゲノム次世代シーケンシング(mNGS)は、特定の環境や宿主サンプル内で幅広い核酸の検出を可能にする、ますます利用されている分子技術です。サンプル内の遺伝物質の大部分を増幅・シーケンスすることで、mNGSは存在する可能性のある特定の微生物について先入観を立てる必要がありません。mNGSは、珍しい病原体や感染症の異常症状の検出など、さまざまな臨床現場での診断ツールとしての有用性を示しています(1,2,3)。さらに、mNGSアッセイで生成されるRNA配列決定データによっても宿主転写プロファイルが記録され、研究者は宿主免疫応答のさまざまな疾患状態をよりよく理解することを可能にします。mNGSが幅広い臨床および研究の文脈に適用できること、そして近年のジェネリックシーケンスのコストの劇的な低下により、この技術の利用は飛躍的に増加しました。

特に、mNGSは診断が依然として困難な中枢神経系(CNS)感染症の検出に有望な成果を示しています。臨床的なmNGS検査が導入される以前、カリフォルニア脳炎プロジェクトは州全体の脳炎の原因を調査し、分子検査の拡大パネルと詳細な臨床評価を用いたにもかかわらず、半数以上の症例が未診断のままであることを発見しました。そして20年以上経った今、臨床的に検証された脳脊髄液(CSF)mNGSアッセイにより、7年間にわたり中枢神経系感染症が疑われる患者の約15%の脳脊髄液中に病原性微生物が検出されました。さらに、感染性診断が確定した患者のうち、5人に1人がこの臨床的なCSF mNGSアッセイによってのみ診断されており、この検査アプローチの有用性が強調されています7。さらに、mNGSアッセイ9,10,11によって生成された宿主トランスクリプトームに基づき、さまざまな中枢神経系感染症の可能性を予測する可能性も示されています。

しかし、この有望な技術の利用可能性は、CSFサンプルの取り扱いや処理に特有の課題によって制限されています。特に、CSF DNAおよびRNAの量はライブラリー製剤キット12,13で指定された最小量より少ないことが多いです。また、臨床目的で採取されたCSFサンプルは、DNAやRNAsが活性を保てる温度で保存されることが多いため、核酸の品質も最適とは言えません。本論文は、病原体検出に利用可能なデータを生成する可能性を最大化するために最適化されたIlluminaシーケンシングプラットフォーム向けの研究ベースのCSF mNGSプロトコルについて説明しています(図1)。

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プロトコル

このプロトコルは、UCSF機関審査委員会が承認した研究の一環として収集されたサンプルを用いて開発・試験されました。

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図1:脳脊髄液(CSF)メタゲノム次世代シーケンシング(mNGS)サンプル処理および病原体検出のための分析ワークフロー。 この図は、CSF mNGSのウェットラボおよびバイオインフォマティック経路における主要なステップを示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. CSFサンプル取り扱いに関する考慮事項

注:mNGSの結果は、CSFライブラリーが採取時に行われる場合、または液体窒素でのスナップ冷凍で保存され、その後-80°C15で長期保存する場合に最適となります。あるいは、サンプル採取時にDNA/RNAシールドなどの防腐剤を使用することで、室温での長期保存が可能です16,17。これはコールドチェーンの信頼性に懸念がある場合に望ましい場合があります。さらに、不要な凍結融解サイクルを避けることも核酸の完全性の維持に寄与し、CSFサンプルに対して複数の分析ワークフローが予想される場合は、採取時にサンプルを事前アリクォートすることが推奨される場合があります18,19。

2. CSF核酸の抽出

注意:感染性微生物の感染リスクを減らすため、適切なバイオセーフティレベルのキャビネット内で手袋と実験用コートを着用してください。試薬は飲み込んだり、吸入したり、皮膚に触れると有害です。使用済み物質は地域の規制に準拠し、有害化学廃棄物として処分すること。

  1. クイックDNA/RNAキットは、核酸の含有量が低いサンプルに一般的に適しています。
  2. CSFサンプルを氷で解凍し、各サンプル100μL–1 mLを1.5 mLチューブに移し、遠心分離機で16,000 x g 、4°Cで10分間処理します。
  3. 慎重にピペットで上部清液を除去し、肉眼では見えないことが多いペレットと100μLの上清液を残します。
  4. 残りの100μLの上清液とペレットに100μLのDNA/RNAシールドを加え、ピペットで十分に混合します。
  5. 次に、DNA/RNA溶解バッファー600 μLとピペット混合液を加え、溶液が均一になるまで加えます。
  6. 補 足付録Aで製造者が説明したDNA/RNA抽出プロトコルの残りに従い、CSFに特有の重要な修正を以下以下に加えてください。
    1. すべての遠心分離工程を最大速度(~21,000 × g)で1分間行い、最後のDNA/RNA洗浄ステップは最大速度で3分間実行してください。
    2. 試料を25μLではなく22μL(25μLではなく)直接カラムマトリックスに加え、室温で3分間培養します。体積が多いほど、一般的にカラムから溶出される核酸の総量が増えます。
    3. 洗脱後、流れをカラムマトリックスに戻し、最大速度で1分間遠心分離機をかけます。サンプルを新しい1.5 mLの保存チューブに移し、直ちにライブラリーの準備に進むか、-80°Cで保存してください。

3. CSF RNAライブラリーの調製

注意:適切なバイオセーフティキャビネット内で、手袋と実験用コートを着用してください。試薬は飲み込んだり、吸入したり、皮膚に触れると有害です。使用済み物質は地域の規制に準拠し、有害化学廃棄物として処分すること。

注:開始前の重要な考慮点:mRNAの単離には、rRNAの除去が追加のビーズクリーンステップを必要としないこと(利用可能なmRNAの収量を減らすことがあるため)、また一部の神経侵襲性RNAウイルス転写産物はポリアデニル化を欠くため、ポリアデニル化よりもmRNA単離が推奨されます。ERCC(外部RNA制御コンソーシアム)RNA Spike-Inは品質管理手段として追加可能ですが、必ずしも必須ではありません。抽出後にRNAが-80°Cで保存されていた場合は、開始前に氷で解凍してください。

  1. RNA断片化およびプライミング:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブ内で以下の物質をピペットで混合します:3.5 μL RNAサンプル、0.5 μL 1:2500希釈ERCCスパイクイン、4 μL第一鎖反応バッファー(5回)、ランダムプライマー1 μL、希釈した1 μL 1:100 rRNA(材料表)。熱サイクル器で加熱した蓋を105°Cに設定し、サンプルを75°Cで2分間、70°Cで2分、65°Cで2分、60°Cで2分、55°Cで2分、37°Cで5分、25°Cで5分間を培養します。
  2. 第一鎖cDNA合成:ピペットは断片化・プライムされたRNA(10 μL)を8 μLのヌクレアーゼフリー水および2 μLの第一鎖合成酵素混合物と混合します。熱サイクル器で加熱した蓋を105°Cに設定し、サンプルを25°Cで10分、42°Cで15分、70°Cで15分間キュベートします。
  3. 第二鎖cDNA合成:ピペットで第一鎖合成済みDNA(20μL)を8μLの第二鎖合成反応バッファー、4μLの第二鎖合成酵素混合物、48μLのヌクレアーゼフリー水を混合します。熱サイクル器で、加熱された蓋を閉めた状態で16°Cで1時間培養します。
  4. SPRI磁気ビーズの比率1.8倍(144μL)を用いて磁気ビーズ精製(補足付録B)を実施します。53μLのヌクレアーゼフリー水に溶出し、最終上清液50μL(精製済み二本鎖cDNAを含む)をクリーンなヌクレアーゼフリーPCRチューブに移します。この時点で、必要に応じてサンプルは-20°Cで一晩安全に冷凍することができます。
  5. cDNAライブラリーの最終準備:サンプルを-20°Cで一晩保存した場合、再開前に氷で解凍します。ピペットで精製されたds-cDNA(50μL)を7μLのエンドプレップ反応バッファーおよび3μLのエンドプレップ酵素ミックスと混合します。
  6. サーモサイクラーで、20°Cで30分、65°Cで30分間インキュベートし、加熱された蓋を閉めて保存します。
  7. アダプターライゲーション(氷上でこのステップを実施):ヌクレアーゼフリーの水中でアダプターを1:100の希釈液で作成します。最終準備反応混合物(60 μL)を、30 μLのリゲーションマスターミックス、1 μLのリゲーションエンハンサー、2.5 μL 1:100希釈アダプターを含むチューブにピペット移します。アダプターは別途添加されていることを確認してください(例:リゲーションマスターミックスやリゲーションエンハンサーと事前に混合されていない)。これによりアダプターの二量体形成が起こらないようにしてください。
  8. サーモサイクラーで、加熱された蓋を閉めた状態で20°Cで15分間培養します。
  9. 直ちにSPRI磁気ビーズ(87μL)の0.9倍比率を用いた磁気ビーズ精製(補足付録2)に進みます。
  10. 17μLのヌクレアーゼフリー水に溶出し、最終上清15μLをクリーンなヌクレアーゼフリーPCRチューブに移します
  11. バーコーディングPCR:精製済みのアダプター結合されたcDNA(15μL)を、3μLのUSER酵素、25μLのQ5マスターミックス、10μLのユニークなバーコードプライマーを使ったチューブにピペットで抽出します。サーモサイクラーで加熱した蓋を105°Cに設定し、37°Cで15分、次に98°Cで30秒、さらに98°Cで10秒、65°Cで75秒を19サイクル行います。PCRの仕上げには、65°Cで5分間培養します。
  12. 最終的な磁気ビーズ精製を行い、0.8倍の磁気ビーズ(43μL)を用います。23 μLのヌクレアーゼフリー水に溶出し、最終ビーズ分離工程の後、20 μLをクリーンなヌクレアーゼフリーPCRチューブに移します。この時点で、必要に応じてサンプルは-20°Cで一晩安全に冷凍することができます。

4. CSF DNAライブラリーの製造

注意:適切なバイオセーフティレベルのキャビネットで、手袋と実験用コートを着用してください。試薬は飲み込んだり、吸入したり、皮膚に触れると有害です。使用済み物質は地域の規制に準拠し、有害化学廃棄物として処分すること。

  1. 抽出したDNAが-20°Cで一晩保存されていた場合は、再開前に氷で解凍してください。
  2. DNA断片化と末端調製:第一鎖反応バッファーをボルテックスで十分に混合し、ピペットで溶液を混合して沈殿物を再懸濁させます。抽出したDNA3.5 μL、ヌクレアーゼフリー水22.5 μL、第一鎖反応バッファー7 μL、第一鎖酵素ミックス2 μLをピペットで混合します。
  3. 熱サイクル器で加熱した蓋を105°Cに設定し、サンプルを37°Cで5分間、次に65°Cで30分間培養します。
  4. アダプターのライゲーションおよびバーコーディングPCRプロセスは、DNAおよびRNAライブラリで同一です。断片化済みおよび末端準備済みDNAで「CSF RNA ライブラリー調製」のセクション7–10を繰り返し、DNAライブラリーの準備を完了させます。

5. 図書館の品質管理とプール化

  1. DNA定量キットと対応する蛍光計を使ってサンプルライブラリの濃度を定量します。水の制御は他の試料と比べて、はるかに低い(または定量化不可能な)濃度を持つべきです。
  2. 自動毛細管電気泳動装置でサンプルを運用してサンプルライブラリのサイズを評価します。
  3. あるいは、自動毛細管電気泳動装置が利用できない場合は、Illuminaユニバーサルプライマーを用いたPCR反応を行い、さらに1〜2μLのサンプルを増幅し、その後2%アガロースゲル上で最終生成物10μLの電気泳動を行います。使用済み物質は地域の規制に準拠し、有害化学廃棄物として処分すること。
    注:最適なライブラリ長は約400〜500塩基対であるため、ライブラリのサイズが望ましいより多いまたは短くなった場合は、将来の断片インキュベーションを適切に調整する必要があります。さらに、アダプター二量体の存在を評価することも重要です。アダプターダイマーは約150塩基対の長さで、2つのアダプター分子がインサート配列なしで誤って結合した際に発生します。たとえ少量であっても、アダプターダイマーはフローセル上で効率的にクラスタリング・シーケンスされるため、シーケンス実行中の利用可能なリードの割合が減少します。したがって、アダプターダイマーが存在する場合は、SPRI磁気ビーズの0.8倍比率で追加の磁気ビーズ精製を行います。(なお、試料の>10%がアダプターダイマーの場合、ほとんどのアダプターダイマーを除去するには2〜3回の磁気ビーズ精製が必要になることがあります。)
  4. 同じシーケンスラン内でサンプル間で同じ深さのシーケンスを確保するためには、各サンプルの 等モル 量をプールする必要があります。ライブラリのサイズがすべてのサンプルで比較可能な場合は、各RNAライブラリーの同等 質量を プールし、それぞれのDNAライブラリごとに個別に繰り返します。

6. シーケンスの考慮事項

  1. プールされたサンプルは現在、イルミナのシーケンシング装置でシーケンスの準備が整っています。専用のシーケンシングコア施設を介さずに社内でシーケンスする場合は、試薬カートリッジにプールをロードする前に、シーケンス装置の指示に従ってプールを慎重に変性・希釈してください(ほとんどのIlluminaシーケンシングプラットフォームでは濃度は4 nMです)。
  2. 推定シーケンス深度は、Illuminaフローセルの期待データ収率をラン中に多重化されたサンプル数で割って算出します。
    注:望ましいシーケンス深度の決定は、コスト、使用されるシーケンス装置、実験目的など複数の要因に依存します。以下の代表的な結果セクションで、異なるシーケンス深度の2つの例を示します。

7. 病原体検出のためのデータ解析

  1. オープンソースのウェブベースのプラットフォームChan Zuckerberg ID(CZID、https://www.czid.org、Illumina mNGS Pipeline v8.3)を利用して、病原体検出のためのメタゲノム解析を行います。CZIDには、コマンドラインインターフェース経由でサンプルをアップロードしたり、Illumina BaseSpaceアカウントからCZIDへの直接転送も可能です。CZID mNGSのデータ解析の詳細な概要は https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis でご覧いただけます。
  2. CZIDにログインし、「アップロード」をクリックし、解析タイプを「メタゲノミクス」を選択し、シーケンスランの入力されたfastqファイルを選択します。各サンプルの必要な情報、サンプル名、サンプルタイプ(CSF)、ヌクレオチド(RNAまたはDNA)を入力してください。
    注:アップロードされたファイルはCZIDパイプラインを経由して自動処理されており、STAR、Bowtie2、Trimmomatic、PriceSeq、GSNAPなどの計算ツールを組み込んで、低品質のリードや人間のリードシーケンスを除去しています。パイプラインは、Minimap2とDIAMONDソフトウェアプログラムを通じて、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)ヌクレオチド(NT)およびタンパク質(NR)データベースを活用して、フィルタリング配列をアラインメント・組み立てます。最終的なCZID出力には、各サンプルのNT/NR分類群カウントおよびコンティグカウント(組み立て時に生成された連続した重複区間)が含まれます。
  3. 処理が終わったら、サンプルが入ったプロジェクトフォルダをクリックして、要約ダッシュボードに移動します。
  4. 下にスクロールして、サンプルごとのリード数(使用したIlluminaフローセルに基づく予想リード数とシーケンス実行で多重化されたサンプル数と比較)、品質管理フィルタリングを通過したリードの割合、重複圧縮比を確認し、バイアスPCR過剰増幅の有無を評価します。
  5. CSFサンプル採取過程中または抽出・ライブラリー調製中に取得される環境核酸断片による汚染の存在はよくある現象です。細菌、真菌、寄生虫のリードが真陽性かどうかを判断するために、正規化されたリード数(1百万あたりのreads、rPM)を用いる可能性のある方法を検討できます。
    1. CZID内で直接背景モデルを作成し(例:抽出、準備、シーケンスされた水サンプルを用いて)、背景モデルと同様か少ない(したがって汚染を代表しやすい)rPMを持つ分類群をフィルタリングします。プロジェクトフォルダ内で、各水制御サンプルを確認し、「背景モデル」をクリックして作成してください。各サンプルを分析する際、背景モデルを選択し、「しきい値フィルター」をクリックすると、「NTZスコア」>1(またはそれ以上)を適用して、可能性のある汚染物質を除去します。
    2. 事前に指定されたrPM閾値、例えばrpMサンプル >10*(平均rPMコントロール)やlog10(rPMサンプル)がlog 10より少なくとも1ログ大きい(平均rPM全体)を活用してください。まず、プロジェクトページで各サンプルを確認し、「ダウンロード」をクリックし、「結合サンプル分類群結果」を選択して、各サンプルごとのrPMをダウンロードします。得られた.csvファイルは、RやStataなどの統計ソフトウェアで必要に応じて解析可能です。
      注:ウイルス病原体の相対的な存在量が低いため、既知の神経侵襲性があり、少なくとも1つのリードがウイルスゲノムに一致するウイルスは陽性結果とみなされるべきです(理想的には、繰り返しmNGSや病原体特異的臨床試験で確認されるべきです)。さらに、解析パイプラインではfastqファイルの各読み取りがNCBIデータベース内の最も可能性の高い参照ゲノムに計算的にアライメントされること が求められ ます。その結果、一部のリードは特定の病原体に比較的非特異的であり、理論的にはCZIDに割り当てられた特定の分類群ではなく、幅広い生物に適合していた可能性があります。このリスクを考慮し、正反応の確認はウェブベースのNCBI BLASTツールでアラインメントを確認することで手動で行うべきです(分類群の特定のリードは、該当分類群の隣にあるブラストアイコンをクリックすることでCZIDからNCBI BLASTへ直接送信できます)。

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結果

図書館の品質管理
DNA/RNA抽出後、抽出されたDNAの測定濃度は一般的に1〜10 ng/μLです。しかし、抽出されたRNAの濃度はしばしばpg/μL程度であり、分光光度計では検出できないことが多いです。ライブラリー製備後、精製および増幅されたcDNAライブラリーは、それぞれ一般的に0.5–10 ng/μLおよび10–30 ng/μLの濃度で保たれます。 図2A の毛細管電気泳動および電気泳動データは、過剰断片化されアダプターダイマーを含むcDNAサンプルライブラリを示しています。プーリングとシーケンスの前に、アダプターダイマーは0.8倍の磁気ビーズ対サンプル比を用いて追加のビーズクリーンアップを行って除去します。対照的に、 図2B のデータでは、著しいアダプター二量体汚染がなく、プーリングやシーケンスに適した高品質なcDNAライブラリーを示しています。

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ディスカッション

望ましいシーケンス深度、使用するシーケンスプラットフォーム、品質管理機器の有無状況に応じて、このプロトコルに変更が必要な重要な点があります。それでも、ここに示した2つの代表的なコホートは、幅広い実験条件下で堅牢な病原体検出が可能であることを示しています。具体的には、コホートBは、浅層シーケンシング、ERCC対照群の排除、プロトコルの小型化、バイオアナライザーやTapeStationではなく従来のゲル電気泳動による品質管理の利用など、いくつかのコスト削減策を行ったにもかかわらず、サンプル中に多様な神経侵襲病原体が検出されることを示しました。

プロトコル中の成功率を最大化するためには、いくつかの重要なステップと考慮事項があります。抽出中(特にDNA/RNAシールド添加前)に効率的に作業し、望ましくないRNA劣化を防ぐことが重要です。ライブラリーの調製の各段階では、混合物を十分に混合し、均質化を確実にしつつ、過剰な気泡がライブラリーの収率を低下させないようにする必要があります。混ぜた後に気泡が見えたら、PCRチューブスト...

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開示事項

M.R.W.はロッシュ/ジェネンテック、ノバルティス、カイバーナ・セラピューティクスから独立した研究助成金を受けており、Delve Bio Inc.の創設者であり取締役会メンバーでもあります。ファイザー、バーテックス・ファーマシューティカルズ、オウロ・メディシンズ、インダプタ・セラピューティクスにコンサルティングサービスを提供しています。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所のフォガティ国際センターからの資金提供を受け、アワード番号D43TW009343を受けました。過去数年間にわたり、多様な研究用途のためのmNGSプロトコルの開発と最適化に貢献してくださったウィルソン研究所、UCSF、CZIの多くの研究者の皆様に感謝申し上げます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2mL PCRチューブストリップエッペンドルフ30124359
1.5 mL DNA LoBindチューブエッペンドルフ30108051
1.5 mL セーフロックチューブエッペンドルフ30120191
ERCC RNAスパイクインミックスサーモ・フィッシャー4456740
高感度D1000試薬アジレント5067-5585
Invitrogen Collibriライブラリ アンプ マスターミックスサーモ・フィッシャーA38539050
マスターサイクラー x50サーモ・フィッシャー6311000010
Illumina用のNEBNext多重オリゴニューイングランド・バイオラボ7335S/L
NEBNext Ultra II DNAライブラリ プレップキットニューイングランド・バイオラボE7645
ILLUMINA用のNEBNext Ultra II RNAライブラリー準備キットニューイングランド・バイオラボE7770
NextSeq 500/550 ハイアウトプットキット v2.5(150サイクル)イルミナ20024907
NextSeq 550イルミナ該当なし
QIAseq FastSelect -rRNA HMRキットクイアゲン334386
Qubit 1X dsDNA 高感度アッセイキット量子ビットQ33230
量子ビット4フルオロメーターサーモ・フィッシャー該当なし
クイックDNA/RNAマイクロプレッププラスキット ザイモD7005
テープステーション4150アジレントG2992AA

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中枢神経系病原体検出のための脳脊髄液のメタゲノミック次世代シーケンシング
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