二相酸溶媒法を用いたマウス糞便からの短鎖脂肪酸の抽出

サマリー

このプロトコルは、誘導化せずに低入力マウスの糞便サンプルから短鎖脂肪酸を分離するための二相酸・溶媒抽出法を説明しています。

要約

本記事では、低投入マウスの糞便サンプルから短鎖脂肪酸(SCFA)を二相酸・溶媒抽出戦略を用いるプロトコルについて説明します。この方法は約20〜50 mgの糞便入力を想定して設計されており、希釈された塩酸と酢酸エチルを用いて、誘導化せずに相分離を可能にします。このプロトコルは糞便均質化、酸性化、有機溶媒の分配、低温遠心分離で構成され、研究室で一般的に入手可能な標準的な実験機器を使用して実施可能です。抽出後、SCFAは通常のガスクロマトグラフィーベースのプラットフォームによる下流解析に適しています。プロトコルの成功は、個別マウスサンプルからアセテート、プロピオネート、ブチレートを含む主要な糞便SCFAで示されているように、背景ノイズを超える特徴的な保持時間における明確に分解されたSCFAピークの検出によって示されています。このプロトコルは、限られたサンプルから糞便SCFA抽出を標準化したワークフローを提供しつつ、通常の分析ワークフローとの互換性を維持することで、小動物研究における一般的な手続き上の課題に対応します。

概要

このプロトコルは、低入力マウスの糞便サンプルから短鎖脂肪酸(SCFA)を抽出するために開発され、通常のガスクロマトグラフィー(GC)分析と互換性のある形式で提供されました。SCFAは、主に酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む6個未満の炭素原子を持つ揮発性有機脂肪酸であり、消化不能な食物繊維の発酵を通じて腸内細菌叢によって生成されます^。糞便物質が限られている小動物研究では、個々のマウスからの代謝物の定量化が頻繁に求められ、サンプルは行動的、代謝的、生理的^{表現型2,3,4,5,6}と関連付けられています。したがって、動物ごとのSCFA測定に依存する実験設計を支援するには、実用的で低入力の抽出ワークフローが必要です。

糞便SCFA分析の既存のアプローチにはいくつかの方法論的制約があります。SCFAsの揮発性、低存在比、生物学的マ^{トリックスの複雑}さから、糞便サンプル中の定量化は依然として解析的に困難です。標準的なワークフローでは、導離化ステップ、大量のサンプル量、自動液体取り扱い、特殊な均質化プラットフォーム、固相抽出カラム^{8、9、10、11}などの特殊機器が必要です。これらの要件は、特にマウス研究において、動物ごとの糞便排出量が最小限で、縦断的または遺伝子型特異的サンプリングが一般的なマウス研究において、アクセスや拡張性を制限することがあります(12,13,14)。その結果、微量の便エントリからSCFAを誘導化せずに抽出しつつ、標準的なガスクロマトグラフィーのワークフローと互換性を保つプロトコルには方法論的なギャップが残っています。

ここで説明するプロトコルは、希釈塩酸と酢酸エチルを用いた二相酸・溶媒抽出戦略を用いてこのギャップを埋めています。このワークフローは糞便均質化、酸性化、有機溶媒の分配、低温遠心分離で構成され、少量の糞便投入量で動作するよう設計されています。追加の化学修飾工程や専門的な試料準備プラットフォームを必要とする派生化ベースのワークフローとは異なり、このプロトコルは標準的な実験機器を用いた通常のGCベース分析に適した形式でSCFAを直接抽出することを可能にします^。

この方法は、個別レベルの測定が必要な場合やサンプルの入手可能性が実験設計を制約する場合、限られた量のマウス糞便からSCFA抽出が必要な研究を目的としています。これは糞便サンプル中の一般的なSCFA(C2–C6)のGCベース解析に適していますが、誘導化依存的な検出、GC感度を超える超微量定量、または全身的なSCFA濃度の評価が必要な用途には設計されていません。

プロトコル

米国マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ州ブリガム大学(MGB)にある動物常任委員会は、使用される動物の数を最小限に抑えるために設計された前述の動物プロトコルを承認しました。このプロトコルは国立衛生研究所のガイドラインおよび規則に準拠しています。この原稿はARRIVEガイドラインに従って作成されました。プロトコル図は 図1に示されており、必要な材料は 材料表に記載されています。

図1:プロトコルの図。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. 便サンプルの採取と調製

1. 新鮮な糞便(~30 mg)サンプルを別々の1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブで採取します。SCFA濃度の正確な正規化のために、各サンプルの正確な便の輸入量を記録します。
   注意:採取時には各サンプルごとに清潔なバイアル、手袋、ピンセットを必ず含めてください。すべてのガラス製品や楽器は使用前にオートクレーブ処理されなければなりません。このプロトコルは、サンプルあたり約20〜50 mgの糞便入力量に対して検証されており、代表的な入力として~30 mgが用いられています。抽出量はこの範囲内で一定に保たれます。
2. サンプルに対応する必要な数の遠心分離バイアルを設置し、ラベルを貼ります。
3. 稀釈塩酸(0.5 M; pH 1–2)を濃縮HCl(12 M、ACS試薬グレード)を超純水にゆっくり加えて製製します。
   注意:HClは腐食性があります。皮膚、目、呼吸器に重度の火傷を引き起こすことがあります。吸い込むのは危険です。
4. サンプルは室温で30〜45分、または完全に解凍されるまで解凍します。

2. 試料均質化および酸性化

1. 各遠心分離バイアルに0.5 M HCl溶液を255 μL加えます。
2. 新しいバイアルを用意して、70%エタノールを入れてピンセットの掃除に使います。ピンセットをエタノールに浸してからきれいなペーパータオルで拭き取ります。
   注意:エタノールは可燃性で、皮膚や目を刺激することがあります。蒸気の吸入はめまいを引き起こすことがあります。
3. 乳棒用のエタノール浴を設置し、乳棒を容器に入れて70%エタノールを注ぎ、すべての乳棒を完全に浸かせます。
4. サンプルボックスから正しいサンプルを取り出します。バイアルの蓋を開けて、便を1つ(~30mg)取り出します。
5. 糞便サンプルを対応する遠心分離バイアルに入れます。
6. すべてのサンプルを正しい遠心分離バイアルに入れたら、エタノール浴から乳棒を取り出します。ペストルを清潔なペーパータオルで乾かします。
   注意:各サンプルごとに新しい乳棒を使いましょう。
7. 杵を使って糞便サンプルを正しく砕き溶かしてください( 図2参照)。糞便サンプルを、目に見える均一な懸濁液が得られ、固体の断片が目に見えないまで粉砕します。

図2:杵を用いた糞便サンプルの粉砕。 新鮮に採取された糞便は均一な一感を得るために挽き、SCFA分析を行います。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

8. 使った乳棒は空の箱に入れて後で洗うようにします。
9. パルス型ボルテックスミキサーを最大速度10秒間、チューブのキャップで厳重に遮断してサンプルを渦巻いています。
   注意:遠心分離バイアルは混合物のこぼれを防ぐためにしっかり蓋をしてください。

3. SCFA抽出および相分離

1. サンプルを16,000× g で4°Cで10分間遠心分離し、遠心分離機の適切なバランスを確保します。
2. 遠心分離機を起動した後、新しい遠心分離バイアルにサンプルに対応するラベルを貼ります。遠心分離が完了したら、サンプルを遠心分離機から取り出します。
3. 200 μLピペットを120 μLに設定。遠心分離後、ペレットの乱れを防ぎながら120 μLの水性上清液を慎重に採取してください。上清液を新たにラベル付けされた遠心分離バイアルに移し、ペレットを廃棄します。
4. 同量(120μL)の酢酸エチルを新たに標識したバイアルに上清液を加えます。これをすべてのサンプルで繰り返します。
   注意:エチルアセテートは可燃性で、皮膚、目、呼吸器系を刺激することがあります。蒸気の吸入や長時間の接触は避けてください。
5. サンプルを再び遠心分離機に運んでください。遠心分離機が適切にバランスを取られ、ローター蓋がしっかり固定されていることを確認してください。2,374 × g で4°Cで20分間回します。
6. 遠心分離後、下部水相を乱さずに上部有機相120μLを慎重に採取します。抽出したSCFA含有上清液を新しいラベル付き遠心分離バイアルに移します。
   注意:収集量は120μL未満の場合があります。界面に乳剤がある場合は、遠心分離を延長するか、冷やして冷やして相分離が透明になるまで冷却してください。糞便物質を含まず並行処理した手続き的ブランクサンプルは、試薬や取り扱いによって導入されたSCFAの背景レベルを評価するための品質管理ステップとしてオプションとして含まれることがあります。
7. 過去のバイアルを調べて、下層が誤って引き上げられていないか確認してください。
   注意:酸添加や有機溶媒の取り扱いに関わる工程は、揮発や蒸発損失を最小限に抑えるために、可能な限りチューブをキャップしたまま迅速に行うべきです。

4. 抽出、取り扱いと保管

1. 抽出ボックスを見つけて適切にラベルを貼り、抽出したサンプルをその中に置いてください。
   注意:有機相採取後は、抽出物を最大24時間、密閉チューブで保存し、その後長期保存のために−80°Cに移すことで安全に一時停止できます。
2. 箱を-80°Cの冷凍庫に入れてSCFA分析を待ちます。
   注:エチル酢酸塩とSCFAは非常に揮発性が高いため、抽出されたサンプルは−80°Cでの保管後は速やかに分析する必要があります。 長期保存はサンプルの完全性を損なう可能性があります。

5. ガスクロマトグラフィー解析

1. GCで抽出されたSCFAsを、溶融シリカキャピラリーカラムと遊離脂肪酸固定相を用いて、水素、空気、窒素の流量をそれぞれ30、300、20 mL/minで分析します。分析のために1μLの有機抽出物を注入します。
2. 定量的応用には^、前述の内部標準および校正手順(例:2-エチル酪酸)を取り入れてください。
   注:詳細な機器固有の設定は参照されたメソッド¹⁴に記載されています。

結果

上記のプロトコルにより、抽出された120μLのSCFAアリコートが得られ、それが抽出された便サンプル数に対応しています。抽出プロトコルの成功は、特徴的な保持時間で信号強度が背景雑音より上回る明確に分解されたSCFAピークの存在によって示されます。前述の方法で実施すると、サンプル間の定量比較に適した糞便SCFAプロファイルが得られます。私たちは酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、バレリック酸、イソバレリック酸、ヘキサン酸、および2-エチル酪酸(内部標準)の8種類のSCFAを定量^{化しました(}図3)。

図3:...

ディスカッション

このプロトコルには、小量マウス糞便サンプルからSCFAを効率的かつ再現性に抽出するためのいくつかの重要なステップが含まれています。このプロトコルは、希釈された塩酸と酢酸エチルを一定量の量で用いる二相酸・溶媒抽出システムを用いており、これはSCFAの低分子量・弱有機酸としての物理化学的特性に合わせて調整されています。酸性化によりSCFAはプロトン化された形態に移行し、糞便マトリックスとのイオン相互作用を減少させ、その後の相分離時に分配を促進します。低温遠心分離と標準化渦分法が組み込まれ、これらの化合物に伴う揮発損失を最小限に抑えつ効果的な相分離を促進します。徹底した均質化と制御された渦混合の組み合わせにより、サンプルの均一な分散が保証され、これはマトリックス関連SCFAの放出とサンプル間での一貫した抽出に不可欠です。さらに、固定されたマイクロ体積移動と定義された有機相の収集により、派生化や特殊な計測機器を必要とせずにオペレーター依存の変動を低減します。これらのステップはプロトコルの運用コアを定義し、抽出されたSCFA分数の品質に直接影響を与えます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
遠心分離機	ThermoFisher	75003424	"Sorvall Legend Micro 21R マイクロ遠心分離機"
遠心分離用バイアル	Fisher Scientific	05-408-129
マイクロチューブラック	Millipore Sigma	HS29025F-5EA
エチルアセテート	ThermoFisher	022912.K2	HPLCグレード、≥99.5%
緑色のピストン	Fisher Scientific	50-189-9195
HCl	Fisher Scientific	SA49	ACS認証（10 N、ストック溶液）; 使用時に0.5 Mに希釈
1000 μLピペット	USA Scientific	7110-1000
1000 μLピペットチップ	USA Scientific	1111-2821
エタノール	Fisher Scientific	BP82011	分子生物学グレード、70%溶液
200 μLピペット	USA Scientific	7100-2200
200 μLピペットチップ	USA Scientific	1110-1800
ピンセット	ThermoFisher	046638.KT
ボルテックス	Fisher Scientific	50-136-7909	"Research Products International Corp VORNADO ミニチュアボルテックスミキサー、パープルカップ"