このプロトコルは、誘導化せずに低入力マウスの糞便サンプルから短鎖脂肪酸を分離するための二相酸・溶媒抽出法を説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
本記事では、低投入マウスの糞便サンプルから短鎖脂肪酸(SCFA)を二相酸・溶媒抽出戦略を用いるプロトコルについて説明します。この方法は約20〜50 mgの糞便入力を想定して設計されており、希釈された塩酸と酢酸エチルを用いて、誘導化せずに相分離を可能にします。このプロトコルは糞便均質化、酸性化、有機溶媒の分配、低温遠心分離で構成され、研究室で一般的に入手可能な標準的な実験機器を使用して実施可能です。抽出後、SCFAは通常のガスクロマトグラフィーベースのプラットフォームによる下流解析に適しています。プロトコルの成功は、個別マウスサンプルからアセテート、プロピオネート、ブチレートを含む主要な糞便SCFAで示されているように、背景ノイズを超える特徴的な保持時間における明確に分解されたSCFAピークの検出によって示されています。このプロトコルは、限られたサンプルから糞便SCFA抽出を標準化したワークフローを提供しつつ、通常の分析ワークフローとの互換性を維持することで、小動物研究における一般的な手続き上の課題に対応します。
概要
このプロトコルは、低入力マウスの糞便サンプルから短鎖脂肪酸(SCFA)を抽出するために開発され、通常のガスクロマトグラフィー(GC)分析と互換性のある形式で提供されました。SCFAは、主に酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む6個未満の炭素原子を持つ揮発性有機脂肪酸であり、消化不能な食物繊維の発酵を通じて腸内細菌叢によって生成されます。糞便物質が限られている小動物研究では、個々のマウスからの代謝物の定量化が頻繁に求められ、サンプルは行動的、代謝的、生理的表現型2,3,4,5,6と関連付けられています。したがって、動物ごとのSCFA測定に依存する実験設計を支援するには、実用的で低入力の抽出ワークフローが必要です。
糞便SCFA分析の既存のアプローチにはいくつかの方法論的制約があります。SCFAsの揮発性、低存在比、生物学的マトリックスの複雑さから、糞便サンプル中の定量化は依然として解析的に困難です。標準....
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プロトコル
米国マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ州ブリガム大学(MGB)にある動物常任委員会は、使用される動物の数を最小限に抑えるために設計された前述の動物プロトコルを承認しました。このプロトコルは国立衛生研究所のガイドラインおよび規則に準拠しています。この原稿はARRIVEガイドラインに従って作成されました。プロトコル図は 図1に示されており、必要な材料は 材料表に記載されています。
図1:プロトコルの図。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
1. 便サンプル....
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結果
上記のプロトコルにより、抽出された120μLのSCFAアリコートが得られ、それが抽出された便サンプル数に対応しています。抽出プロトコルの成功は、特徴的な保持時間で信号強度が背景雑音より上回る明確に分解されたSCFAピークの存在によって示されます。前述の方法で実施すると、サンプル間の定量比較に適した糞便SCFAプロファイルが得られます。私たちは酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、バレリック酸、イソバレリック酸、ヘキサン酸、および2-エチル酪酸(内部標準)の8種類のSCFAを定量化しました(図3)。
図3:.......
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ディスカッション
このプロトコルには、小量マウス糞便サンプルからSCFAを効率的かつ再現性に抽出するためのいくつかの重要なステップが含まれています。このプロトコルは、希釈された塩酸と酢酸エチルを一定量の量で用いる二相酸・溶媒抽出システムを用いており、これはSCFAの低分子量・弱有機酸としての物理化学的特性に合わせて調整されています。酸性化によりSCFAはプロトン化された形態に移行し、糞便マトリックスとのイオン相互作用を減少させ、その後の相分離時に分配を促進します。低温遠心分離と標準化渦分法が組み込まれ、これらの化合物に伴う揮発損失を最小限に抑えつ効果的な相分離を促進します。徹底した均質化と制御された渦混合の組み合わせにより、サンプルの均一な分散が保証され、これはマトリックス関連SCFAの放出とサンプル間での一貫した抽出に不可欠です。さらに、固定されたマイクロ体積移動と定義された有機相の収集により、派生化や特殊な計測機器を必要とせずにオペレーター依存の変動を低減します。これらのステップはプロトコルの運用コアを定義し、抽出されたSCFA分数の品質に直接影響を与えます。
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開示事項
著者には利益相反を主張するものはありません。
謝辞
国立衛生研究所(NIH)からの資金援助、張怡英氏への寄付R21AG065606 R21AG08176およびボーテン家財団および唐家からの寄付に感謝申し上げます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 遠心分離機 | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R マイクロ遠心分離機" |
| 遠心分離用バイアル | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| マイクロチューブラック | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| エチルアセテート | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLCグレード、≥99.5% |
| 緑色のピストン | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS認証（10 N、ストック溶液）; 使用時に0.5 Mに希釈 |
| 1000 μLピペット | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 μLピペットチップ | USA Scientific | 1111-2821 | |
| エタノール | Fisher Scientific | BP82011 | 分子生物学グレード、70%溶液 |
| 200 μLピペット | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 μLピペットチップ | USA Scientific | 1110-1800 | |
| ピンセット | ThermoFisher | 046638.KT | |
| ボルテックス | Fisher Scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO ミニチュアボルテックスミキサー、パープルカップ" |
参考文献
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Zhang, Y., et al.
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再版と許可
