蛍光トレーサーを用いたマウスの歯肉上皮障壁の機能評価

Summary

このプロトコルの目的は、異なる分子サイズの蛍光標識デキストトランスを歯 肉表面に局所的に塗布し、その後単一光子顕微鏡システムを用いて 体外 画像を施すことで、マウスの歯肉上皮上皮障壁の完全性を定量的に評価する標準化されたアプローチを提供することです。

Abstract

歯肉上皮障壁は、口腔免疫と恒常性において重要な最前線防御として機能します。上皮バリアが完全な状態であれば、口腔環境からの有害物質の侵入を効果的に防ぎますが、その破壊は歯周炎や扁平口腔リケンヌスなどの病因と密接に関連しています。ここでは、マウスにおける歯肉上皮障壁の完全性を評価するための局所適用法を確立しました。まず、分子量(40 kDaまたは70 kDa)の蛍光標識デキストトランスを2%カルボキシメチルセルロースナトリウムに混ぜて、臼歯の陰唇表面に局所的に塗布しました。30分間の潜伏期間の後、上顎骨を剥離し、単一光子顕微鏡システムを用いた即時イメージング用にカスタマイズされたホルダーに固定されました。このアプローチにより、上皮層全体で異なるサイズのトレーサーを可視化・定量化でき、口腔炎症、創傷治癒、疾患モデリングの研究に応用できる歯肉上皮バリアの完全性の機能的読み取りを提供します。

Introduction

歯科上皮関門は口腔内の重要な防御インターフェースを形成し、物質輸送を選択的に調節しつつ、微生物の侵入を防ぎます^。層状の扁平上皮が緊密接合複合体で相互に接続されているこの動的構造は、微生物、高分子、溶質の非選択的浸透を制限するために細胞外透過性を正確に制御します^。歯肉障壁の完全性を損なう要因は複数あります。口腔内は人体で2番目に多様な微生物群集を抱えており、歯の表面、歯肉の隙間、口腔粘膜に700種以上の細菌が定着しています。^3,4。歯肉組織を覆う上皮細胞は、この密集した^{微生物環境に}絶えず露出しています5。

歯周病原体(例:ジンジガルバリ)によって分泌される病原性因子、特にリポ多糖は、上皮バリア機能を妨げ、歯肉組織の炎症反応を引き起こし、病理進行を促進することが示されています。^6,7。炎症性メディエーターや機械的ストレス要因はバリア機能障害をさらに悪化させ、口腔疾患への感受性を高めます。経口プロバイオティクスは、歯肉上皮関壁の安定性を促進することで歯周病の予防に役立つ可能性があります。それにもかかわらず、微生物と歯肉上皮細胞のバリア機能調節における生物学的相互作用は、依然としてほとんど解^{明されていません。}したがって、上皮バリア機能を評価する信頼性の高い方法の開発は極めて重要です。

高解像度かつ確立された検出システムで知られる単光子レーザー走査顕微鏡は、特に 生外組織 サンプルの検査に有用であることが証明されています¹⁰。先進的な画像診断手法は、歯肉障壁の特性評価を大幅に向上させます。歯肉組織は表面から約100μmの位置に上皮細胞が位置するため、このような画像診断に理想的に適しています。私たちの研究は、分子量の異なる蛍光標識デキストトランスを細胞外透過性トレーサーとして利用した 生外 評価技術を確立しました。単光子レーザー走査顕微鏡と組み合わせることで、歯肉上皮障壁の機能を正確に定量化し、歯周病のメカニズムや治療的介入の可能性についての洞察を提供します。

本研究で確立されたプロトコルは、局所的なゲルベースのトレーサー送達と三次元エクスビブイメージングを組み合わせており、歯肉上皮バリアの評価という独自の課題に対応するために特別に最適化されています。まず、既存の静脈内トレーサー注射アプローチ(表1)では、局所的な微小上皮部位の外部物質に対する透過性を正確に評価できません¹¹。第二に、従来の組織学的アプローチでは脱石化や切片が必要であり、これらは組織構造を乱し、労力と時間のかかるものです(12,13,14)。対照的に、我々のプロトコルは複雑な局所表面に効果的なトレーサー保持を実現するために高接着性ゲルを使用します。さらに、3D画像を通じて、トレーサーの浸透深度と分布を歯肉上皮内で正確に非破壊的に定量化し、組織の空間構造を完全に保存します。したがって、この方法は複雑かつ閉鎖された口腔環境下での歯肉上皮上皮関壁機能の高解像度時空間評価に特に適しています。

Protocol

すべての実験手順は北京大学保健科学センター動物研究倫理委員会の承認を受け、実験動物のケアと利用に関するガイド(NIH出版物番号85-23、1996年改訂)に準拠しています。この過程で、実験動物は痛みや不快感を最小限に抑えるよう丁寧に治療されました。

マウスの歯肉上皮における in vivo 透過性評価の各作業ステップの詳細は以下の通りです(図1A)。ここでは、結紮モデルおよび Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)誘発モデルの両方における上皮バリア機能の検出例を示しました。全職員が実験動物福祉および無菌技術に関する包括的な訓練を受けました。

1. 動物の取り扱い

1. 研究全体を通じて、動物を標準的な非病原体(SPF)条件下で飼育し、12時間の明暗サイクルで、 自由に餌と水を提供します。
2. 麻酔薬およびトレーサーの調製と投与
   1. プロトコル中は無菌状態を維持し、75%エタノールで洗浄された工具を使用してください。
   2. 実験には、成熟した成虫8〜10週齢のオスの野生型(WT)C57BL/6Jマウスを使用します。マウスを3つのグループに分けます:1つはコントロール群(未治療)と2つの実験グループ(結紮型および P. gingivalis誘発マウス歯周炎モデル)。
      注:グループ分けでは、年齢と体重が歯肉上皮の透過性に与える影響を減らすために、体重と週齢が近いマウスを選びます。結紮誘導モデルおよび P. gingivalis誘発マウス歯周炎モデルは、一般的に用いられるマウス歯周炎モデルです。詳細なモデリングプロトコルについては、結紮誘発の¹⁵ および P. gingivalis誘^{発のマウス} 歯周炎モデルに関する文献を参照してください。
   3. FITC標識デキストラン(40 kDa;FD40)およびロダミンB標識デキストラン(70 kDa;RD70)を用いて、対応するFITCおよびロダミンフィルターを用いて信号検出を確実にします。
   4. トレーサーを薄めて。このプロトコルに従うには、FD40(1 g/L)とRD70(1 g/L)を2%のカルボキシメチルセルロースゲルに混ぜ、4°Cで保存します。
   5. マウスに麻酔するために腹腔内注射で1.25%のトリブロモエタノール(体重200mg/kg、体重15-17 μL/g)を投与します。
      注意:トリブロモエタノール溶液は光に敏感です。 テルトアミルアルコールは可燃性で揮発性かつ刺激性のある有機溶媒です。準備、取り扱い、投与に関わるすべての手順は、化学換気フードまたは非常に通気の良い場所で行われ、点火源から厳格に離れた場所で行われなければなりません。職員は手袋、化学防護ゴーグル、白衣などの適切な個人防護具(PPE)を着用しなければなりません。廃棄物処理:トリブロモエタノール溶液、 テルトアミルアルコール、およびすべての汚染された備品(例:注射器、ピペットの先端、手袋)は、機関の環境衛生安全(EHS)規則および可燃性・有毒化学物質に関するプロトコルに厳格に従って有害化学廃棄物として収集・処分されなければなりません。
3. 麻酔中は、フィードバック制御式の温熱パッドを使って体温を37 ± 0.5°Cに保ちます。角膜乾燥を防ぐためにエリスロマイシン眼軟膏を塗布してください。
   注意:研究期間中、すべての動物に適切なケアを提供すること。
4. 手術後は、動物を温かく静かなリカジケージの柔らかい寝床の上で単独で飼育し、完全に歩けるようになるまで確保してください。動物を1日2回48時間観察し、完全な回復後に通常の姿勢、活動、給餌行動から判断して初めて再びケージに戻してください。
5. 口の口を開けたまま、分子量の異なる2種類以上の細胞外透過性トレーサーを5μLから50μLの混合物で、臼歯の唇側歯肉表面に塗布します(図1B)。30分ほど離れてください。動物が混合物を飲み込んだ場合は、再度塗布してください。
6. 上顎の孤立
   1. 透水性トレーサーを30分間塗った後、ネズミを段ボールに固定し、仰向けにして手足をテープで固定します。
   2. 固定後、口腔内を開いて上顎骨を隔離します。周囲の組織を優しく取り除き、PBSで標本を丁寧にすすいでください。
   3. 上顎骨をガラススライドの上に置き、両側にモデリングクレイを敷いて、サンプルの上にカバースリップをしっかりと取り付けやすくします。

2. 単光子顕微鏡装置

1. 解剖したマウス上顎骨をカスタムデザインのサンプルホルダーに慎重に配置し、画像撮影のために安定した位置を確保します。
2. 25×/NA 1.0の水浸透対物レンズを搭載した直立単一光子顕微鏡で画像を取得し、上顎骨の下に取り付けられた支持領域に焦点を当てます。
   注意:蛍光信号はトレーサーゲルを除去した直後に見えるはずです。

3. 上顎画像診断

1. 上顎の第2大臼歯の頬面で関心のある領域を選定した後、すぐに画像診断を開始してください。
2. 上顎歯肉面から100〜200μmの深さまでステップサイズ1μmのZスタック画像を取得し、三次元(3D)再構築を行います。
3. 上皮バリアの透過性を評価するためにZシリーズ画像診断を行います。参照ソフトウェアのパラメータを以下のように設定します:
   1. ファイルメニューで新しいフォルダを作成し、データセットの説明名を割り当てます。
   2. 取得タブでXYフォーマットを512×512、解像度0.99 μm/ピクセルに設定してください。
   3. ズームファクターを1に設定してください。
   4. 励起波長を488 nm(FD40)と561 nm(RD70)に設定し、発光ウィンドウはそれぞれ500-550 nmと570-620 nmに設定します。
      注:利得値はそれぞれ50(488nm)と60(561nm)に設定されています。
   5. Zシリーズおよび3Dイメージングの場合は、 ND取得モードを選択してください。 Zステップ を 1μm に設定(必要に応じて調整)。
4. パラメータが設定されたら、 ライブ モードを選択して、イメージングウィンドウ内の個別および統合された蛍光チャネルの両方で歯肉領域を可視化します。
5. パラメータ設定後に取得を開始するには 「今すぐ実行 」をクリックしてください。

4. 透過率測定

1. FD40とRD70の蛍光強度を異なるチャネルに分けます。背景引き算は不要です。Z軸のスライスをマージします。その後、ImageJソフトウェアを使って蛍光強度を計算し、透過率を評価し、上皮バリア機能を示します。
   1. ファイルをクリックし、「開く」を選択して単一光子顕微鏡で撮影した上顎の写真を開きます。
   2. 画像メニューに行き、画像タイプを解析用の8ビット形式に変更してください。
      注:蛍光顕微鏡や共焦点システムで撮影された画像は一般的にRGB形式であり、蛍光強度測定に直接使用することはできません。個別のチャンネルに分割するか、モノクロ画像を直接インポートする必要があります。
   3. 分析メニューを開き、「セット測定」を選択し、「面積」「平均」「基準」にチェックを入れてください。確認はOKをクリックしてください。
   4. 解析するチャネルを選択し、閾値を調整してください: 画像へ |調整 |しきい値。システムはデフォルト値とアルゴリズムを自動的に適用し、通常は選択された領域を示すために赤色を使用します。
      注意:蛍光画像は通常黒背景なので、暗 い背景 オプションも選択してください。
   5. 測定パラメータの設定: 分析 に行き、 測定値を設定します。ダイアログボックスで「 平均グレー値 」と 「閾値に制限」をチェックしてください。最後に 「OK」をクリックします。
      注意:結果表に画像名が表示されるように表示 ラベル を確認することを推奨し、実験グループを特定しやすくします。
   6. 測定を行う際: フリーハンド選択 ツールを選択してください。カーソルを使って、歯肉側の蛍光信号領域の輪郭を手動かつ正確になぞります。分析をクリック |測定。結果表が表示され、 IntDen は蛍光強度を表します。
2. 計算用に結果をスプレッドシートにコピーし、グラフ作成のためにインポートしてください。
3. 相対蛍光強度の計算:まず、対照群の 平均蛍光強度 を計算します。次に、各実験群の蛍光強度値を対照群平均値で割って相対蛍光強度を求めます。

Results

標準化されたプロトコルに従い、歯肉組織を含むマウス上顎骨はカスタム設計されたホルダーに取り付けられました(図1C)。顕微鏡検査では、歯肉内に緑色(FD40)および赤色(FD70)蛍光信号が見られ、上皮障壁を越えたトレーサーの浸透が示されました。レンズの下で関心のある領域を特定した後、ソフトウェアで画像を取得しました。対照群では、両方の蛍光トレーサーは主に歯肉表面に限定されていました。少量のFD40およびRD70が歯肉上皮を通って浸透し、微細構造の特徴を明確に示しました。結紮群および P. gingivalis治療群の両方で、FD40およびRD70が歯肉上皮内に有意に漏出していることが観察され(図2A)、これは歯周上皮障壁を横断したトレーサー転座の著しい増加を示し、歯周炎時に歯肉上皮障壁の機能が障害されたことを示した。トレーサー透過性の向上を反映した蛍光強度の半定量的解析により、バリアの完全性が損なわれることが反映され、これらの結果を裏...

Discussion

歯肉上皮は細菌侵入に対する重要な物理的バリアとして機能し、口腔微生物は病原性因子によるバリアの完全性を破壊するか、その維持を促進する二重の調節能力を示します。これらの生物学的相互作用が最終的に組織の恒常性や疾患の進行を決定する^17,18。この基盤の上に、これらのメカニズムをさらに調査するための革新的な方法論的アプローチを開発しました。この技術は、局所トレーサー塗布と単光子顕微鏡イメージングを組み合わせ、マウスの歯肉上皮障壁機能を定量的に評価できる実験システムを構築します。標準化された操作手順と定量的分析手法の導入により、口腔粘膜関門検査の精度と再現性が大幅に向上します。

この方法にはいくつかの重要なプロトコルステップがあります。まず、重要な手順は、2%カルボキシメチルセルロースゲル中で40 kDaのFITCデキストラン(FD40)と70 kDaのロダミンデキストラン(RD70)を製剤する精密なトレー...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 kDa FITC-labeled dextran	シグマ・アルドリッチ	78331
70 kDa rhodamine B-labeled dextran	シグマ・アルドリッチ	R9379
Blunt tissue separation nickel	Beijinghuabo Company	NZW28
carboxymethylcellulose	MREDA	M049898
Disposable sterile syringe	Zhiyu Company		1 mL
ImageJソフトウェア	米国国立衛生研究所
マイクロチューブ	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
NIS-Elements AR イメージソフトウェア	ニコン
Phosphate buffered saline 1x	Servicebio	G4207-500
Single photon microscope Nikon A1 MP+	ニコン
Tissue scissors	Beijinghuabo Company	M286-05