再生 中のヒドラ 球体の準備とライブイメージング

サマリー

タイムラプスイメージングを用いて、 ヒドラ 球体の再生過程を完全に追跡できます。このプロトコルでは 、ヒドラ 球体の生成方法を説明し、さまざまな取り付け戦略を論じ、回転ディスク共焦点顕微鏡および光シート蛍光顕微鏡を用いた長期ライブイメージングの実施方法を詳述します。

要約

ハイドラは その卓越した再生能力で知られています。驚くべきことに、 ヒドラ 組織の小さな再生断片である ヒドラ 球体は 、新たに組織化する組織体を形成することができます。確立されると、この組織は周囲の組織を適切な口腔構造へと誘導します。数日以内に球状体は小さく、しかし完全に模様のあるポリプに発達します。このプロセスの比較的短い時間スケールにより、プロセス全体の連続したタイムラプス撮影が可能となり、再生の時空間的ダイナミクスを研究するユニークな機会を提供します。ここでは、再生中の ヒドラ 球体のタイムラプスデータセットを生成するための詳細なワークフローと代表的な結果を示します。プロトコルには球状体生成の詳細な手順と、画像診断に最適なサンプル選択のガイドラインが含まれています。本研究では、生体サンプルの長期イメージングに適したマウント戦略について論じ、回転円盤コフォーカス顕微鏡とライトシート顕微鏡の両方を用いたイメージング手法を実演します。ここで述べた原理は、長期イメージングを用いて動的な形態形成過程を研究できる他のモデルシステムにも広く適用可能です。

概要

ヒドラは小さな淡水性ポリプで、その卓越した再生能力で最もよく知られています。体の中央から切り取られた組織断片は折りたたまれ、ヒドラの二つの上皮層である外胚葉と内胚葉からなる中空の球状体になります。再生中、これらのヒドラ球体は新たなオーガナイザーを形成^します。約3日以内に体の軸が伸び、頭と足の末端の細胞が分化します。この比較的短い時間枠のおかげで、再生プロセス全体をライブイメージングで記録できます。タイムラプスデータセットは、ヒドラ球体が再生2期に経験する特徴的な膨張と縮縮のサイクルを明らかにするのに重要な役割を果たし^{ています。}これらの浸透圧駆動の機械的振動によって生じる組織の伸縮は、オーガナイ^ザー3の局在化に寄与します。

長期のライブイメージングを成功させるには、動きのアーティファクトを避けるために迅速な画像取得が必要であり、同時に試料の光損傷を防ぐために光の照射を最小限に抑える必要があります。従来の単点走査共焦点顕微鏡はこれらの要件を満たしていません。しかし、高度な技術も開発されています。本プロトコルでは、スピニングディスク共焦点顕微鏡(SDCM)とライトシート蛍光顕微鏡(LS....

プロトコル

記載されたすべての手順は、スイスの動物研究に関する国家規則の倫理ガイドラインに従って実施されました。実験を始める前に、ハイドラは週3回、少なくとも2週間は正常に与えるべきです。実験に使われるヒドラは^{健康である}べきで、性器官もなく芽も出ない。最近芽が出たヒドラも避けるべきで、群れ内の他のヒドラに比べて体長が短いため識別されます。

1. ヒドラ 球体の調製(図1)

1. まず解離培地(DM;レシピは 表1参照)で皿を準備します。実験中はDMは室温に置くべきです。
2. 作業スペースの残りの準備:10cmの細胞培養皿の蓋をステレオスコープの下に置き、 ヒドラ 培地(HM;レシピは 表1参照)を一層敷きます。細胞培養皿自体は残存する ヒドラ 組織の採取に利用できます。最後に、 ヒドラ を集めてステレオスコープの近くの皿に入れます。
3. ガラス製のパスツールピペットを使って、 ヒドラ....

結果

回転円盤共焦点顕微鏡(SDCM)と光シート蛍光顕微鏡(LSFM)の両方を用いて 、ヒドラ 球体の再生のための長期タイムラプスデータセットを成功裏に生成しました。再生は両方の画像設定で正常に起こり、球体は対称性を破り、伸長し、触手と足を3日以内に発達させました(図5A、 図6A、 補足映像1、補足映像2)。長時間の画像撮影の後、再生した動物は動きが鈍くなり、焦点が合わず、視野から完全に外れて動くようになりました(図5A)。

蛍光マーカーを用いて、 ヒドラ の再生に不可欠な動的な細胞プロセスを可視化しました。例えば、 ヒドラ 球体はアクチン線維を急速に再編成^します。アクチン組織の多くは遺伝しますが、組織の両端.......

ディスカッション

SDCMとLSFMはどちらも再生中のヒドラ球体の長期タイムラプスデータセットを生成するのに適しています。各技術の光学原理は異なり、それぞれ独自の利点と制約があります(表2)。サンプルの完全かつ高解像度の表示が不要な場合、SDCMが好まれます。複数のサンプルを1つの実験で画像化できるため、薬物治療など様々な条件の試験に特に有用です。さらに、SDCMデータセットは処理・解析が容易であり、この手法がより高速でアクセスしやすいものです。しかし、包括的な空間的概要が不可欠な場合、LSFMが好まれるアプローチです。また、LSFMは高光感度の試料のイメージングにも有利です。SDCMは単点走査共焦点顕微鏡に比べて光毒性を大幅に低減しますが、試料全体を繰り返し照射します。LSFMは薄い光学面のみを励起し、光の露光と光損傷を最小限に抑えます^13,14。しかし、LSFMは学習曲線が急です。マルチビューレジストレーションや融合.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
20×/0.8 Plan-Apochromat objective	Zeiss	440640-9903-000	スピンディスク共焦点顕微鏡用
20x/1.0 W Plan-Apochromat water dipping objective	Zeiss	421452-9700-000	Zeiss Lightsheet 7の検出レンズとして使用
3DプリントされたFEPチャンバー用ホルダー			カスタムメイド
4ウェルガラス底イメージングプレート（#1.5H）	Ibidi	80427
アガロース	Carl Roth	3810.4
FEPチャンバー用アルミニウムモールド			カスタムメイド
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	C4901
缶入りエア	Durable	POWERCLEAN STANDARD 400
細胞培養プレート（6cm）	Thermo Fisher Scientific	150288
D-(+)-グルコース	Sigma-Aldrich	G8769
FEPフォイル（127μm厚）	Adtech Polymer Engineering
FluoSpheres カルボキシレート改質（0.2μm、ダークレッド）	Thermo Fisher Scientific	F8807
ガラスキャピラリー	Brand	701904
ガラス製パスツールピペット（150mm）	VWR	612-1701
Hydra vulgaris
イメージングソフトウェア	Visitron	VisiView	スピンディスク共焦点顕微鏡用
倒立光学顕微鏡	Zeiss	Axio observer 7	スピンディスク共焦点顕微鏡用
ライトシート顕微鏡	Leica	Viventis Deep LS2
ライトシート顕微鏡	Zeiss	Lightsheet 7
低融点アガロース	Thermo Fisher Scientific	R0801
塩化マグネシウム	Sigma-Aldrich	M8266
硫酸マグネシウム	Sigma-Aldrich	M2643
マイクロスカルペル	pfm medical	200300745
ピペットバルブ
ピストンロッドトランスファーペット	Brand	701932
塩化カリウム	Sigma-Aldrich	P9333
安全バーンナー	INTEGRA Biosciences	FIREBOY plus
sCMOSカメラ	Photometrics	Prime 95B	スピンディスク共焦点顕微鏡用
重炭酸ナトリウム	Fluka Analytical, Sigma-Aldrich	71630
クエン酸ナトリウム二水和物	Sigma-Aldrich	W302600
ピルビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	P2256
スピンディスク共焦点スキャンユニット（50μmのピンホール）	Yokogawa	CSU-W1	スピンディスク共焦点顕微鏡用
ステレオスコープ	Leica	M80
TES	Sigma-Aldrich	T1375
熱成形機	Yuyao Jintai Machine Factory	Jintai JT-18
組織培養皿（10cm）	VWR	734-2321
Tris-HClバッファー	Roche Diagnostics	10812846001