本研究は、タンシノンIIA(Tan IIA)が、動物モデルや分子ドッキングで示されているIL-33/ST2調節を介して心筋梗塞後線維症を緩和し、ELISAおよびウェスタンブロットで検証されることを示しています。
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研究記事
* These authors contributed equally
本研究は、タンシノンIIA(Tan IIA)が、動物モデルや分子ドッキングで示されているIL-33/ST2調節を介して心筋梗塞後線維症を緩和し、ELISAおよびウェスタンブロットで検証されることを示しています。
心筋梗塞(MI)は重度の冠動脈疾患の一種であり、しばしば心筋線維症を引き起こし、心機能障害や心不全の主な原因となっています。心外膜脂肪組織(EAT)は、サイトカイン媒介による心臓機能の調節を通じて心血管病理にますます関与しています。タンシノンIIA(TanIIA)は 、サルビア・ミルティオリザ由来の脂溶性化合物で、抗炎症、抗酸化、抗線維化の特性を示します。本研究は、TanIIAが心筋筋線維症後期の心筋線維症を軽減する治療的可能性を評価し、in vivo 実験と in silico 解析を統合的に組み合わせてその基礎メカニズムを探ることを目的としました。マウスMIモデルを確立し、分子ドッキングを用いてインターロイキン-33/成長刺激発現遺伝子2(IL-33/ST2)シグナル伝達経路の主要成分に対するTanIIAの結合を評価しました。私たちの結果は、TanIIA治療が心臓機能を有意に改善し、組織学的損傷を減少させ、心筋線維症を軽減し、N末端脳前腎上腺利尿ペプチド(NT-proBNP)および高感度心トロポニンI(hs-cTnI)の血清レベル低下を示しました。また、TanIIAは血清、心筋、EATにおける炎症反応や酸化ストレスを軽減しました。機構的には、TanIIAはIL-33およびST2発現をダウンレギュレーションし、骨髄分化因子88(MyD88)/核因子カッパB(NF-κB)経路を抑制し、トランスフォーミング成長因子β1(TGF-β1)レベルを低下させました。さらに、インシリコ 解析ではTanIIAがIL-33、ST2、MyD88、NF-κB p65に対して強い結合親和性を示し、ST2で最も安定した相互作用が予測されていました。これらの発見は総じて、TanIIAがEAT関連の炎症および酸化ストレスを調節し、IL-33/ST2軸の多標的阻害を通じて心筋線維症を緩和することを示しています。これらの結果は、TanIIAが心筋筋維症の管理における有望な治療候補であることを支持しています。
心筋梗塞は、病的に長期的な虚血による心筋細胞の死と定義され、生命を脅かす心血管イベント1として依然として存在します。再灌流戦略や薬物療法の大きな進歩にもかかわらず、心筋梗塞は世界的に多くの罹患率と死亡率の主要な原因であり続けています 2,3,4,5,6。心筋梗塞の主要な病態生理学的結果は心筋線維症であり、細胞外マトリックスタンパク質の過剰な沈着であり、これがその後の有害な臨床転帰の主要な決定要因となっています7。この線維化性瘢痕は心室壁破裂の予防に不可欠ですが、しばしば複雑な炎症性および細胞間シグナル伝達経路5,7,8,9,10によって開始される不適応修復過程となります。機能的な心筋を非収縮性瘢痕組織に置き換えることで、不適応線維症は心室の硬さの増加、進行性の心機能障害、最終的に心不全を引き起こします9,11。したがって、梗塞後線維症を特異的に標的かつ軽減する新規薬理学的治療法の研究は、長期的な患者の罹患率と死亡率を改善するための重要な治療目標です。
サルビア・ミルティオリザ(Danshen)は伝統の中国医学であり、そのさまざまな製剤は心血管疾患の管理に広く用いられています。主な脂溶性成分である炭シノーネIIAは、抗動脈硬化、抗心筋虚血、抗酸化作用など複数の心臓保護特性を持つとされています(12,13,14,15)。機構的には、TanIIaは多様なシグナル伝達経路13、14、15、16、17を調節することで抗炎症および抗線維化効果を発揮します。特に、TanIIAは脂肪細胞を直接標的にし、炎症反応を抑制することで細胞機能障害を改善することが示されています18。しかし、これらのTanIIaの保護効果が心外脂肪組織にも及ぶかどうかは、まだ解明されていません。
心外膜脂肪組織は独特の内臓脂肪の蓄積であり、冠動脈疾患(CAD)、心房細動(AF)、心不全の病因に強く関与しています。心筋と心外膜の内臓層の間に構造的に位置し、中間筋膜層を介さず、EATは隣接する心臓構造19,20,21,22との直接的な副分泌コミュニケーションを促進します。生理的状態において、EATは心臓保護効果を持ち、代謝支援を提供し、抗炎症および抗酸化作用のアディポキン(20,21,23,24,25,26)を放出します。逆に、病理学的状態下では、EATは炎症促進、酸化促進、線維化促進のメディエーターの供給源となり、心臓の逆再形成を引き起こす27,28,29,30。その結果、TanIIAは心外膜脂肪中の炎症反応や酸化ストレスを抑制することで、新たなシグナル伝達経路を通じて心筋線維症を抑制する可能性があるという仮説が立てられました。
インターロイキン-33は、サイトカイン31のIL-1ファミリーのメンバーであり、心血管系における強力な抗肥大および抗線維化特性で知られています25。その生物学的効果は、ST2という異なる受容体複合体を介して媒介されており、ST2は2つのアイソフォームから存在します。すなわち、シグナル伝達を開始する膜貫通受容体(ST2L)と、IL-33を隔離する可溶性デコイ受容体(sST2)です。臨床的には、心筋梗塞(MI)後に血清sST2レベルが急性に上昇し、心不全および心筋炎の有害な予後を示す強力な予後マーカーとして機能します。標準的なIL-33/ST2Lシグナル伝達カスケードは、アダプタータンパク質MyD88のリクルートとTRAF6の活性化を伴い、NF-κB阻害剤(IκB)のリン酸化と分解、そしてNF-κB37,38の核転座を引き起こします。この経路は他の主要な炎症性サイトカインと密接に関連しています。例えば、IL-33/MyD88シグナル伝達は抗炎症性サイトカインIL-10の分泌を促進します。一方、炎症促進サイトカインであるTNF-αはNF-κBを活性化してIL-33発現を誘導することで炎症反応を増幅します(40,41)。重要なのは、IL-33とST2の両方が脂肪組織内で発現しており、局所的な抗炎症効果を発揮すると考えられていることです(31,42,43)。しかし、TanIIAの心保護効果がIL-33/ST2軸の調節に関与しているかどうかは未だに解明されていません。
したがって、本研究は、TanIIAがIL-33/ST2経路の調節を通じて心外脂肪組織から生じる炎症および酸化ストレスを軽減することで心筋線維症を予防するという中心仮説を検証するために設計されました。具体的には、この治療作用はTanIIAがこのシグナル伝達カスケードの主要なタンパク質と直接的かつ多標的に結合することによって駆動されると仮説を立てました。これを検証するために、私たちは二重アプローチを採用しました。まず、心筋梗塞のラットモデルを用いて、TanIIAの 体内での心臓 リモデリングの抑制効果を確認しました。次に、これらの観測を直接的な分子基盤として、計算ドッキングを用いてTanIIAが経路の4つの主要ノードであるIL-33、ST2、MyD88、NF-κB p65への潜在的な結合を特徴づけました。組織レベルから特定の分子結合イベントに至るまでのメカニズムを調査することで、本研究はTanIIaの心臓保護効果に関する新しい機構的枠組みを確立することを目指しています。
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すべての実験手順および動物福祉の実践は、江西中国医学大学倫理動物委員会の実験動物のケアおよび利用に関する倫理規則(番号)に厳格に従って実施されました。JZLLSC2023-0702)、中国。
分子ドッキングシミュレーション
TanIIAとIL-33、ST2L、MyD88、NF-κB p65の直接的な相互作用を探るために、 インシリコ 分子ドッキング手法が用いられました。TanIIAの3D座標はPubChemデータベースから取得され、初期のSDFファイルはその後PDB形式に変換されました。IL-33(PDB ID: 4KC3)、ST2L(PDB ID: 4KC3)、MyD88(PDB ID: 7L6W)、およびNF-κB p65(PDB ID: 1NFI)の結晶構造は、タンパク質データバンクから取得されました。受容体の初期処理はPyMOL(v2.3.4)で行われ、水分子と元の配位子が除去され、その後AutoDockToolsで水素の付加および電荷割り当てのためのさらなる準備が行われました。両分子は最終的にPDBQT形式に変換されました。AutoDock Vina(v1.1.2)は、アクティブなサイトを中心とした定義されたグリッドボックス内でドッキングシミュレーションを行うために利用されました。最適な結合ポーズは、最も低い結合エネルギーに基づいて選定され、PLIPウェブツールを用いて詳細な相互作用を特定しました。最終的なドッキング構造はPyMOL(v2.3.4)を用いて可視化されました。
動物
オスのスプラグ・ドーリー(SD)ラット、SPFクラス、生後6週、体重200 ± 20g(証明書番号)SCXK(Su)2023-0009)。ラットは標準化された条件下で管理され、12時間の明暗サイクルと22°C±2°Cの温度が保たれました。 実験中、動物たちは食べ物と水の両方に無制限にアクセスすることが許されていました。
実験プロトコル
左前降行(LAD)冠動脈を結紮することで、ラット心筋梗塞モデルが確立されました。偽手術ラットはLAD結紮なしで同じ外科手術を受けました。簡単に、ラットは1%ペントバルビタールナトリウム(50 mg/kg)の腹腔内注射で麻酔され、その後気管挿管と換気が行われました。心臓を露出させるために左開胸術が行われました。その後、LADは4-0非吸収性縫合糸で結紮されました。心筋梗塞誘導の成功は、連続心電図によるST節の上昇と左心室前壁の目に見える白白化によって確認されました。手術後、ラットはセフォキシチンナトリウム(200 mg/kg/d、直発)を3日間投与しました。手術後24時間後、生存ラットは無作為に6グループに割り当てられました(各グループあたりn = 10名)。
シャム群:生理食塩水(1 mL·kg-1·day-1)腹腔内注射を受けました。
心筋梗塞群:生理食塩水(1 mL·kg-1·day-1)の腹膜内注射を受けました。
TanIIA-L群(低用量):腹膜内注射TanIIIA(7.5 mg·kg-1·day-1)を受けました。
TanIIA-M群(中用量):腹腔内注射でTanIIA(15 mg·kg-1·day-1)を受けました。
TanIIA-H群(高用量):腹腔内注射をTanIIA(30 mg·kg-1·day-1)を受けました。
XST群(陽性対照):バルサルタン(30 mg·kg-1·day-1)を経口ガベージ投与。
すべての治療は28日間連続で毎日実施されました。TanIIAとXSTの用量は、過去の研究および予備的な未発表データ44,45に基づいて選択されました。
心電図(ECG)および心エコー
治療28日後、経胸腔心エコー検査で心機能が評価されました。2%イソフルラン麻酔(モーションモード)下で、Mモード画像を取得し、左心室拡張末期/収縮期直径(LVIDd/s)を測定しました。左心室駆出率(LVEF)および分数短縮率(LVFS)は、連続した3周期の心臓周期の平均から計算されました。さらに、心電図は術前、結紮後15分、実験的エンドポイントで記録され、心臓の電気活動を監視しました。
サンプリングおよび2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)染色
腹部大動脈からの血液は1370× g で15分間遠心分離し血清を分離し、血清は-80°Cで保存されました。 心臓と心外膜脂肪組織は迅速に切除され、体重測定されました。分子解析のために、EATおよび梗塞境界組織を液体窒素にスナップ冷凍し、-80°Cで保存しました。 他の組織サンプルは組織学的検査のために4%パラホルムアルデヒドに固定されました。さらに、選ばれた心臓は-20°Cで凍結され、切開され、TTCで染色されて梗塞の大きさを評価しました。材料や動物組織は、実験室の安全規則に従って使用・取り扱われます。
組織学的検査
組織病理学的評価のため、パラフィン切片にヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を施し、心筋の形態を観察しました。マッソンのトリクロム染色法を用いて、心筋線維症の程度と心外脂肪細胞の大きさを評価し、コラーゲン体積分数(CVF)を定量化しました。さらに、非梗結部のタイプIとタイプIIIの比率はピクロシリウスレッド(PSR)染色によって決定されました。すべてのセクションは定量分析のためにデジタルスキャンされました。
免疫組織化学
パラフィン埋め込み心筋切片は脱脂され、再水和されました。抗原回収はクエン酸バッファー(pH 6.0)を用いて行われました。切片は3%BSAでブロックし、その後4°Cで一晩、コラーゲンI、コラーゲンIII、IL-33、ST2、MyD88、NF-κB p65、TGF-β1に対する一次抗体とともにインキュベートしました。その後、切片をHRP標識の二次抗体で室温で1時間インキュベートしました。染色はDABで可視化され、核はヘマトキシリンでカウンター染色されました。画像はデジタルスキャナーで撮影され、画像解析ソフトウェアで解析され、正染色の積分光学密度(IOD)を定量化しました。
酵素結合免疫吸着アッセイ
血清サンプルでhs-cTnI、NT-proBNP、IL-33、ST2の濃度を定量化しました。さらに、血清、心筋均質細胞、心外膜脂肪組織溶除液中でIL-10およびTNF-αのレベルを測定しました。すべてのアッセイは、製造元のプロトコルに従い、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを使用して実施されました。
ウェスタンブロッティング
組織均質物質から総タンパク質を抽出し、濃度はビシンコニン酸(BCA)アッセイで決定されました。同量のタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離され、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に移されました。5%無脂肪ミルクでブロッキングした後、膜を4°Cで一晩、IL-10、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、IL-33、ST2、NF-κB p65、TGF-β1、GAPDH(1:1000)に対する一次抗体でインキュベートしました。その後、膜をHRP結合二次抗体(1:5000)でインキュベートし、ECL試薬で可視化しました。バンド強度はソフトウェアで定量化され、タンパク質レベルは内部対照としてGAPDHに正規化されました。
統計解析
すべての統計解析は医療統計ソフトウェアを用いて実施されました。データは平均の標準誤差±平均として提示されます。2つの独立したグループ間の比較にはt検定が用いられました。複数グループの場合、一方向または二元ANOVAを用いて、その後Tukeyのポストホック検定が適用されました。すべての解析において、P<0.05は統計的に有意とされました。
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心筋梗塞を発症したラットにおけるTanIIAの心機能への影響(図1)
健康状態と体重の変化:MI群のラットは腹部膨張を伴う全体的な状態が悪化したのに対し、TanIIA群のラットは健康状態の改善、食事と水分摂取の増加、活動の増加が見られました。4週間後、TanIIA群のラットでMI群と比較して体重が有意に増加したことが観察されました(P < 0.01)(図1A)。死因は心筋損傷または心不全に関連しており、治療群は心筋梗塞群に比べて生存率と死亡時間の遅延が有意に高いことが示されました(P < 0.05)(図1B)。
心機能の変化:Sham群と比較して、MI群のラットは心肥大と心指数(P
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本研究は、心筋梗塞後の心筋線維症に対するTanIIAの効果と、その基礎となるメカニズムを調査します。主な所見は以下の通りです:(1) TanIIAは心臓の逆再構築を緩和し、心線維症を抑制することで心機能を改善する。(2) TanIIAは心外膜脂肪中の炎症反応や酸化ストレスを減弱することで心筋線維症を抑制することがわかっています。(3) TanIIAはIL-33/ST2シグナル伝達経路を通じて抗線維化作用を媒介します。
心筋梗塞は心血管疾患で、高い罹患率と死亡率を持ち、患者の生活の質や予後に重大な影響を与えます。心筋梗塞(MI)による死亡率の低下に大きな進展があるにもかかわらず、心筋梗塞後の心筋線維症は依然として重要な病理学的プロセスです。この疾患は心室拡張や左心室機能障害を伴い、心室の逆性再構築を引き起こし、最終的には心不全や突然の心死の素因となる
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著者らは、本論文で報告された研究に影響を与えた可能性のある競合する財政的利害関係や個人的な関係は知られていないと述べています。
本研究は江西省トップ学科である江西中西統合医学学科(zxyylxk20220103)の支援を受けました。さらに、王曉敏が支援する複数のイニシアチブから資金を得ており、江西省教育局の科学技術研究プロジェクト(GJJ2200940)、江西高レベル学部教育チームプロジェクト(2020008)、江西大学院教育改革プロジェクト(JXYJG2019117)、江西省大学院生向け質の高いコース(2020041)、江西中医薬大学学部生イノベーションプロジェクト(2023091)などが含まれます。資金提供者は研究の設計、出版決定、原稿作成に参加しました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BCAタンパク質定量キット | サーモ・フィッシャー・コーポレーション | PICPI23223 | |
| CATキット | 上海酵素リンクバイオテクノロジー | 202211202 | |
| コラーゲンI抗体 | 武漢サービスバイオテクノロジー株式会社 | GB114197 | |
| コラーゲンIII抗体 | 瀋陽万雷比オバイオテクノロジー有限公司 | WL03186 | |
| GAPDH抗体 | セルシグナル伝達技術株式会社 | #5174 | |
| GraphPad プリズム | グラフパッド・ソフトウェア・コーポレーション | バージョン9.0 | |
| GSHキット | 上海酵素リンクバイオテクノロジー | 202211131 | |
| H&E染色溶液 | 北京ソーラーバイオテクノロジー有限公司 | H8070;G1100 | |
| HRP標識されたヤギ抗ウサギ抗体 IgG抗体 | 北京ソーラーバイオテクノロジー有限公司 | SE134 | |
| Hs-cTnI キット | 上海元傑バイオテクノロジー有限公司 | 20220808 | |
| IL-10抗体 | 瀋陽万雷比オバイオテクノロジー有限公司 | WL03088 | |
| IL-10 キット | 上海元傑バイオテクノロジー有限公司 | 202211172 | |
| IL-33 キット | 上海元傑バイオテクノロジー有限公司 | 202211192 | |
| IL-33抗体 | 瀋陽万雷比オバイオテクノロジー有限公司 | WL04438 | |
| ImageJソフトウェア | 国立衛生研究所 | フィジー版 | |
| イメージプロ | メディア・サイバネティクス、アメリカ | バージョン6.0 | |
| オスのスプラグ・ドーリー(SD)ネズミ | 江蘇集翠耀康バイオテクノロジー有限公司 | SCXK(Su)2023-0009 | |
| マッソン染色キット | 武漢ボルフバイオテクノロジー有限公司 | 20221218 | |
| MDAキット | 上海酵素リンクバイオテクノロジー | 202211171 | |
| MyD88抗体 | 瀋陽万雷比オバイオテクノロジー有限公司 | WL02494 | |
| NT-proBNP キット | 上海元傑バイオテクノロジー有限公司 | 20220805 | |
| 核因子カッパB(NF&カッパ;B)(p65)抗体 | アブマート・コーポレーション | TP56372 | |
| オープンバベル | オープンソースの化学情報学ツールキットプロジェクト | バージョン 2.3.2 | |
| ポリビニリデンフッ化物(PVDF)膜 | メルク・ミリポール | R9M2784 | |
| PSRソリューション | 北京ソーラーバイオテクノロジー有限公司 | G1472 | |
| SODキット | 上海酵素リンクバイオテクノロジー | 202211201 | |
| ST2抗体 | プロテインテック・グループ・コーポレーション | 11920-1-AP | |
| ST2キット | 上海元傑バイオテクノロジー有限公司 | 202211183 | |
| 統計的製品・サービスソリューション(SPSS) | IBMコーポレーション | バージョン26.0 | |
| スルフォタンシノンナトリウム注射 | 上海製薬第一生化学製薬有限公司 | 2012303 | |
| 超高感度ECL発光試薬 | 大連美倫バイオテクノロジー有限公司 | MA0186 | |
| TGF-&ベータ;抗体1本 | ABクローナル・コーポレーション | A2124 | |
| タイタンヴィン・バルサルタンカプセル | 湖南千進湘江製薬有限公司 | 211120 | |
| TNF-およびα; キット | 上海元傑バイオテクノロジー有限公司 | 202211202 | |
| TNF-およびα;抗体 | 瀋陽万雷比オバイオテクノロジー有限公司 | WL01581 | |
| TTCの解決策 | 福州ファイジーンバイオテクノロジー有限公司 | 20210620 | |
| 超高分解能小動物超音波イメージングシステム | VEVO中隊 | ヴェヴォ2100 |