紫外線A誘導皮膚光老化モデルにおける成長因子β1/SMADシグナル伝達のホノキオール調節研究プロトコル

サマリー

本プロトコルは、ホノキオールが人間の真皮線維芽細胞およびマウスの皮膚におけるUVA誘発性の光老化をTGF-β1/SMAD経路の活性化とMMP発現の活性化を通じて改善するかどうかを調査します。

要約

ホノキオール(HNK)は、 マグノリア・オフフィシナリス由来の主要成分であり、皮膚疾患の治療に有望です。現時点では、HNKが皮膚内の紫外線A(UVA)誘発光損傷に与える影響と作用機序は不明です。UVA誘導によりHDF細胞と無毛マウス皮膚の光老化損傷モデルを構築しました。HNKが正常なHDF細胞およびUVA誘発性HDF細胞の生存能力に与える影響を、細胞生存可能性アッセイを通じて検証しました。HDF細胞のSOD、GSH、CAT、MDAレベルは異なるキットで測定され、ROSレベルはDCFH-DAおよびジヒドロエチジウムで測定されました。SA-β-ガラクトシダーゼおよびTUNEL染色はHDF細胞の老化とアポトーシスを検出し、フローサイトメトリーは細胞周期の進行を評価しました。皮膚の組織病理学的損傷は病理的染色によって評価されました。さらに、免疫蛍光法およびウェスタンブロットを用いて、Ki67、コラーゲン、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、およびTGF-β1/Smad経路関連タンパク質レベルを評価しました。HNK(2.5-10 μM)処理は正常なHDF細胞の生存率に悪影響を与えませんでしたが、UVA誘発性のHDF細胞損傷を軽減し、酸化ストレスおよびアポトーシスを減少させました。UVAはHDF細胞の老化を誘発し、S期停止を誘発し、Ki67のダウンレギュレーションを行い、コラーゲン含有量を減少させ、MMP発現を増加させました。一方、HNKはこれらのUVA誘発異常を効果的に弱めました。さらに、UVAはマウス皮膚のシワを深くしわにし、水分量とコラーゲン含有量を減少させ、上皮層の厚みを増やしました。一方、HNKの皮下注射は皮膚組織への病理的損傷を軽減し、水分とコラーゲンの含有量を増加させました。さらに、HNKはTGF-β1/SMAD経路を活性化し、TGF-β1阻害剤SB431542 HDF細胞における光老化損傷に対するHNKの保護効果を損ないました。結論として、HNKはTGF-β1/Smad経路の活性化を通じてMMP発現を減少させることで、HDF細胞およびマウス皮膚におけるUVA誘発性の光老化を抑制することで、光老化損傷を緩和する薬剤となる可能性があります。

概要

肌のエイジングのプロセスは複雑で、主にナチュラルエイジングと^{フォトエイジ}ングの2つの形態に分かれます。研究によると、皮膚老化の80%から90%が環境の外因要因(例:紫外線、大気汚染)によって引き起こされており、その中でも長期にわたる紫外線による光老化が最も深刻な影響をもたらす^{とされています2,3}。紫外線はUVC、UVB、UVAに分けられます。UVCはオゾン層を通過できないため、現在の光老化研究はUVA(320-400 nm)とUVB(280-320 ^{nm)に焦点を当て}ています^4,5,6。UVBと比べてUVAはエネルギーが少ないものの、より浸透性が高く、表皮を通り抜けて真皮の奥深くまで届きます。これは深刻な^肌老化の重要な原因です。これまでの研究では、HaCaT細胞に対する57 mJ/^{cm 2} UVBおよび20 J^/cm2 UVA照射による損傷は同等であることが示^{されています。}皮膚の光老化は、皮膚の機能や構造に変化をもたらし、特に皮膚表面組織のたるみ、しわの深化、コラーゲンの減少、肉眼で見える灰色の肌の色が現れることで現れます。重症の場合、さまざまな良性の前がん病変や腫瘍が^{発生します。}老化やアンチエイジングに関する研究の増加とともに、フォトエイジングの健康リスクは世界的に最も重要な健康問題の一つとなっています。したがって、UVAによる光老化損傷の病態生理学的プロセスを調査し、新たな治療法の開発を目指すことが重要です。

伝統的な中国薬草であるマグノリア・オフィシナリスから抽出されるホノキオール(HNK)は、化学式C₁₈H₁₈O₂¹¹を持つ重要な生物活性化合物です。HNKはさまざまな薬理学的活性を示し、そのフェノールヒドロキシル基は酸化に非常に敏感で、強い抗酸化作用およびフリーラジカル除去効果を持っています¹²。さらに、HNKは抗菌、抗炎症、抗ウイルス、抗腫瘍、抗うつ、神経保護、抗早期卵巣不全の薬理学的効果を持っています。13,14,15,16。経口HNKは動物実験および臨床試験で本質的に安全と判断されており、有意な副作用は確認されていません(17,18,19)。最近の研究では、HNKがUVB誘発性^{皮膚がんを}予防し、UVBによる皮膚炎症反応やDNA高メチル化を抑制することが明らかになりました。²¹は、皮膚疾患治療への応用の可能性を示唆しています。ビタミンCやレスベラトロールなど広く使われている抗光老化薬と比べて、HNKは明確かつ優れた特性を持っています。脂溶性構造により、親水性^{ビタミンCよりも}経皮透過性が優れています。また、レスベラトロール²³よりも高い光安定性と生体内での生体利用能を示します。これらの前臨床的発見は、HNKが紫外線誘発性の皮膚損傷に対する安全かつ効果的なスキンケア製品および臨床介入の候補として有望なトランスレーショナルな可能性を持つことを支持しています。しかし、UVAによる皮膚の光老化損傷に対するHNK治療の影響はまだ報告されていません。

トランスフォーミング成長因子β1(TGF-β1)は、細胞の成長と発達、組織修復と再生、細胞・組織・臓器の成長と発達に不可欠な多機能サイトカインです(^24,25)。TGF-β1は主にSmadタンパク質ファミリーのメンバーを通じて細胞にシグナルを送り、下流標的遺伝子の転写を特異的に制御することが示されています。TGF-β1シグナルが活性化されると、Smad2およびSmad3のリン酸化が起こります^26,27。最近の研究では、TGF-β1/Smad経路と皮膚線維症および光老化との強い関連性が示されています^28,29。哺乳類のラパマイシン標的は、ラットの皮膚組織におけるTGF-β1/Smad経路を活性化し、それが皮膚の水分保持と皮膚バリアの維持に重要なセラミドの合成を促進すると報告^{されています。}特筆すべきは、HNKが肝星状細胞のTGF-β1/SMAD経路を調節し、それが肝線維症³¹を改善したと報告されていることです。そのため、UVA誘発性光老化損傷の細胞モデルおよびマウスモデルが確立され、HDF細胞では2.5–10μMのHNK処理、無毛マウスでは5 mg/kgまたは10 mg/kgのHNK介入を用いて、HNKが光老化損傷に与える影響とTGF-β1/Smad経路の調節における潜在的な役割を探りました。本研究はUVA誘発性皮膚光損傷に対する新たな治療戦略の開発を目指しました。

プロトコル

すべての細胞培養実験は、機関のバイオセーフティガイドラインに従い、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の実験室条件下で実施されました。動物実験は、中国人民解放軍合同後方支援部隊第988病院動物倫理委員会の承認(承認番号:2023-089)を得て実施されました。

すべての実験手順は、実験動物のケアと利用に関する機関および国家のガイドラインに厳密に従って実施されました。実験終了時にマウスはナトリウムペントバルビタール(100 mg/kg、腹腔内注射)の過剰投与で安楽死させられました。飼育、治療、サンプリングの過程での動物の苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力がなされました。プロトコルで使用される試薬、化学物質、機器、ソフトウェアは材料表に記載されています。

1. 細胞培養と処理

1. 線維芽細胞培養培地でヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を培養します。培養物は飽和湿度の環境で37°Cに保温し、_CO2濃度5%を保持します。
2. 培養培地は3日ごとに交換し、HDFが合流した場合は1:3の比率で通過します。
3. UVAランプ(発光スペクトル:320-400 nm)でHDFを5 J^{/cm 2}の線量で照射します。
4. UVA照射30分後すぐに新しい培地を補充してください。UVA照射を^8日連続で1日1回繰り返します。
5. 線量スクリーニング実験では、HDFを2.5、5、10、20、または40μM HNKで24時間または48時間処理^します。HDFを2.5、5、または10μM HNKで24時間処理し、その後の実験でUVA照射(5 J/cm²)を行います。
6. HDFを10μM HNKに4時間曝露し、その後10μMのTGF-β1阻害剤SB431542で24時間インキュベートし、最後にHNK+SB431542群でUVA(5 J/cm²)を照射します。

2. 細胞生存能力評価

1. 密度1×10の⁴ セル/ウェルで96ウェル培養プレートにHDFを接種します。
2. 異なる処理の後、各ウェルに10μLの10%水溶性テトラゾリウム塩試薬を加え、最終体積は1ウェルあたり100μLにし、37°Cで暗闇で1.5時間培養します。
3. マイクロプレートリーダーを使ってセルのOD450値を測定します。

3. スーパーオキシドジムターゼ(SOD)、マロンジアルデヒド(MDA)、カタラーゼ(CAT)、グルタチオン(GSH)レベルの測定

1. HDFを1 mLの予冷却PBS(0.01 M、pH 7.4)で洗浄し、SODアッセイキットの200 μLのSODサンプル調製液を氷上で溶成細胞に15分間加えます。
2. 溶解液を 8000 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上澄液をアッセイサンプルとして採取します。
3. BCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイキットを使って上清液のタンパク質濃度を測定し、サンプルを50μLの総タンパク質に調整します。
4. 50μgのタンパク質サンプルをSODアッセイバッファーと混合し、最終反応容積200μLにし、37°Cで暗闇で30分間培養し、その後OD450値を測定します。
5. SODアッセイで使われたのと同じ細胞溶解上清液を、それぞれのアッセイキットでCAT、GSH、MDAレベルを測定します。

4. 細胞ROSレベルの測定

1. HDF細胞を異なる条件で処理し、500μLのPBSで2回洗浄し、500μLの10μM活性酸素種蛍光プローブとよく混ぜて37°Cで光から20分間インキュベートします。
2. 室温で1000 × g で5分間遠心分離し、細胞を採取した後、500 μL PBSで2回洗浄します。
3. 細胞を500μLの培養液に再懸浮させ、その後フローサイトメトリーで染色を分析します。
4. フローサイトメトリー解析ソフトで蛍光強度を記録し、蛍光強度に基づいてROSレベルを計算します。ROSが高いほど緑色蛍光が強いと分かります。

5. 老化関連のβ-ガラクトシダーゼ(SA-β-ガラクトシダーゼ)染色

1. HDFを6ウェル培養プレートに1×10個の密度でシードし、^6セル/ ウェルにアヒューマーを形成します。異なる処理の後、HDFを2mLのPBSで一度洗い流します。
2. 各ウェルに1mLのβ-ガラクトシダーゼ染色固定液を加え、固定液を併用して室温で15分間培養します。
3. 細胞を2 mLのPBSで3回洗浄し、各ウェルに1 mLの染色作業液を加え、暗闇で37°Cで一晩培養します。
4. 光学顕微鏡で細胞を観察し、写真撮影してください(老化した細胞は青く見えます)。

6. 細胞周期アッセイ

1. 6ウェルプレートにHDFを1×10⁶ セル/ウェルでシーディング;異なる処理の後、2mLのPBSで細胞を2回洗浄します。
2. 1000 × gで室温で5分間遠心分離し、細胞を採取し、70%エタノール(細胞固定剤)1 mLを加え、ピペッティングで優しく混ぜます。固定セルを4°Cの冷蔵庫で12時間保管します。
3. プロピジウムヨウ化物(PI、最終濃度50 μg/mL)とRNaseA(最終濃度200 μg/mL)をPBSで混合し、細胞染色溶液1枚あたり500 μLを準備します。細胞を500μLの染色液にさらし、37°Cの暗闇で30分間培養します。
4. フローサイトメトリーを用いて蛍光強度を評価する。フローサイトメーターを用いて細胞周期解析を行います。

7. チューネル染色

1. 異なる処理群のHDF細胞を4%パラホルムアルデヒド1mLに曝露し、室温で30分間培養します。
2. 細胞に0.3%のトリトンX-100を含むPBS1 mLを加え、室温で5分間培養します。
3. 細胞をPBSで2回洗浄し、その後500μLのTUNELアッセイ溶液を滴状に加えて細胞を均一に覆います。暗闇で37°Cで1.5時間孵化します。
4. 細胞を覆うためにDAPI染色液200μLを加え、光の少ない場所で25°Cで10分間培養します。
5. 蛍光信号保存培養液で細胞を密封し、蛍光顕微鏡で観察・撮影します(TUNEL陽性細胞は緑色蛍光を示します)。

8. 免疫蛍光染色

1. 異なる処理群のHDF細胞を12ウェルプレートにシードします。細胞密度が50%〜60%に達したら、細胞を4%パラホルムアルデヒド1mLに曝露し、室温で25分間培養します。
2. 5%の牛血清アルブミン(BSA)を1mLを滴ごとに加えて細胞表面を遮断し、室温で30分間培養します。
3. 一次抗体Ki67(1:300)、コラーゲンI(1:100)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)-1(1:50)、またはMMP-3(1:100)をドロップごとに500μL加え、4°Cで一晩培養します。
4. 翌日、細胞を500μLのフルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)標識付き二次抗体(1:100)を光から離れた37°Cで1時間培養します。
5. 細胞を覆うために200μLのDAPI染色液を加え、光から離れた10分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察し、画像解析ソフトウェアで解析します(コラーゲンIおよびMMP-1陽性細胞は赤色蛍光を示し、Ki67陽性細胞とMMP-3陽性細胞は緑色蛍光を示します)。

9. エリサ

1. MMP-1またはMMP-3のELISAキットプレートのウェルにHDF細胞培養上清100μLを加え、37°Cで2時間培養します。
2. ウェルを200 μLのPBSで3回洗浄し、それぞれのウェルに対応する抗体100 μLを加え、暗闇で37°Cで1時間インキュベートします。
3. 200μLの洗浄バッファー(キットに付属)でウェルを3回洗浄し、余分な溶液を振り落とし、100μLのストレプタビジンHRPで37°Cの暗闇で30分間培養します。
4. PBSで洗浄した後、キットの説明に従って100μLの基質AとBを加え、37°Cで暗闇で10分間培養します。
5. 終端液50μLを加え、よく混ぜてマイクロプレートリーダーでOD₄₅₀ 値を評価し、濃度を計算します。

10. 写真老化による損傷マウスモデルの構築

1. SPFグレードのメスのSKH1無毛マウス(15-20g、生後4-5週間)を22°C、湿度55%〜60%で飼育し、自律的に餌や水を得られます。食品容器、水筒、飲料水の注ぎ口などの施設を定期的に消毒してください。
2. マウスをランダムに対照群(n=6)とモデル群(n=18)に割り当てます。モデル群マウスにUVAを0.35 J^/cm2 で照射し、8週間³⁴;同じ環境でUVA照射なしにハウスコントロールグループマウスを配置しました。
3. モデル群マウスを3つのサブグループ(n=6個)に均等に分けます。
4. UVA照射中に2つのサブグループ(記録:5 mg/kg HNK群および10 mg/kg HNK群)に、5 mg/kgまたは10 mg/kg、10 μLの皮下注射を週2回投与します。UVA照射中に3番目のサブグループ(UVAグループとして記録)に週に2回、100μLの生理食塩水皮下注射を投与します。
5. モデリング成功後に皮膚のしわ形成と水分含有量を評価する³⁵。
6. マウスを腹腔内でペントバルビタール100 mg/kg投与して安楽死させ、その後、さらなる実験のために背側皮膚組織を採取します。

11. 皮膚コラーゲンI含有量の測定

1. マウスの背側皮膚組織50mgを採取し、液体窒素で十分に挽き、500μLの予備冷却済みRIPA溶解バッファー500μLで氷上で30分間溶解します。
2. 8000 × gで4°Cで5分間遠心分離し、上清液を採取し、製造元の指示に従ってプロコラーゲンICペプチドアッセイキットでコラーゲン含有量を測定します。

12. ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色

1. マウスの皮膚組織を10 mL 4%パラホルマルデヒドに室温で24時間固定し、勾配エタノール(50%、75%、95%、100%、各5分間)で脱水し、パラフィンに埋め込み、4μmのスライスに切断します。
2. スライスを65°Cで8時間焼き、キシレンで2回10分ずつ脱水し、室温の勾配エタノールで再水和します。
3. スライスをヘマトキシリン溶液で8分間染色し、流れる水道水で1分間すすいで、分化液で30秒分ずつ、室温でエオシンで1分間染色します。
4. 染色されたスライスを勾配エタノールで脱水し、キシレンで透明化し、マウント培地で密封し、顕微鏡で観察します(細胞核は青紫色に見え、細胞質、コラーゲン線維、赤血球は程度の差はあれピンク色をしています)。

13. マッソン染色

1. マウスの皮膚組織のパラフィン断片をMassonトリクロム染色キット³⁶で染色します。パラフィン断片をキシレンで2回、各10分間脱硫し、ワイガート鉄ヘマトキシリン染色液を加え、10分間染色します。
2. 酸性エタノール分化液で30秒分異し、流れる水道水で5分すすいで、その後室温でポンソー・フクサン染色液を滴下10分染めます。マッソンの青色溶液で逆青化を行い、その後蒸留水で1分間すすいでください。
3. 弱酸作業液を蒸留水の比率で準備します:キットに付属の弱酸溶液=2:1;1mLの弱酸作動液を滴ごとに加え、室温で30秒洗います。
4. 余分な液体を注ぎ、1mLのリン酸溶液を滴ごとに加え、室温で2分間処理します。弱酸の加工液を1mLずつ滴るように加え、30秒洗います。
5. 余分な液体を注ぎ、1mLのアニリンブルー染色液を滴ごとに加えて1分間着色します。薄酸の作動液1mLを滴ずつ加え、30秒ほど洗います。
6. 95%エタノールで2秒間素早く脱水します。絶対エタノールで2回、10秒ずつ脱水してください。
7. 乾燥後、部分をキシレンでクリアし、ニュートラルガムで取り付けます。顕微鏡で各グループのコラーゲン線維の分布を観察してください(コラーゲン線維は青く見えますが、筋繊維、細胞質、赤血球は鮮やかな赤色、細胞核は明確に青黒色に見えます)。

14. 皮膚組織のROSレベルの測定

1. 摘出から1時間以内に準備したマウスの皮膚組織の凍結切片を取り、1mLの洗浄液を切面全体に滴ずつ塗り、室温で10分間放置します。
2. 洗浄液を振り落とし、10 μM活性酸素プローブ1 mLを滴下に加えて切片を均一に覆います。37°Cで光の遠い場所で30分間孵化します。
3. 切片をPBSで2回洗い、カバースリップを加え、蛍光顕微鏡で観察します(ROS陽性の部分は赤色蛍光を示します。ROSレベルが低いほど赤色蛍光信号は弱くなります)。

15. 生化学的指標の検査

1. マウス血清を採取し、対応するアッセイキットの指示に従って検出試薬を準備します。
2. マウス血清中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)およびアラニントランスアミナーゼ(ALT)の活性を、それぞれのキットを用いて測定してください。
3. マウス血清中の血尿素窒素(BUN)およびクレアチニン(CRE)のレベルをそれぞれのキットで測定してください。

16. ウェスタン・ブロット

1. 50 mgの組織または1×10個^の6 細胞を採取し、200 μL RIPA溶解バッファーを使って30分間氷上で溶除してタンパク質を取得します。
2. 8000 × gで4°Cで5分間遠心分離し、上清液を採取します。BCAタンパク質濃度アッセイキットを用いて細胞や組織のタンパク質含有量を評価します。
3. サンプルタンパク質を12%SDS-PAGEゲル上で電気泳動を行い、分離したタンパク質を4°CのPVDF膜に移します。
4. PVDF膜を室温で3時間、5% BSAでブロックします。膜をTBST(20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% Tween-20を含む)で3回洗浄し、その後4°Cで一重抗体(P53(1:1000)、P21(1:1000)、P16(1:1000)、コラーゲンI(1:1000)、サイクリンA2(1:500)、サイクリン依存性キナーゼ2(CDK2、1:1000)、MMP-1(1:500)、MMP-3(1:1000)、TGF-β1(1:1000)、Smad2(1:1000)、Smad3(1:1000)、p-Smad2(1:1000)、またはp-Smad3(1:1000)と共に培養します。
5. 2日目にTBSTで膜を3回洗浄し、その後ヤギ抗ウサギIgG1 mL(1:10000)を室温で2時間培養します。500μLの増強化学発光(ECL)試薬を均一に膜に塗布し、その後ゲルイメージングシステムでスキャンします。
6. 画像解析ソフトウェアを使ってグレー値分析を行います。相対的な表現レベルを、そのグレー値とGAPDHの比として表現します。

17. 統計解析

1. in vitro 細胞ベースのアッセイでは、すべての実験が独立して3回繰り返されます(n=3、生物学的複製)。
2. 生 体内 動物実験では、グループあたり6匹のマウス(n=6)が含まれており、これは実験室の動物福祉と倫理に関する3R原則に準拠しています。
3. すべての結果は標準偏差±平均で表されます。統計解析ソフトウェアを使って統計解析を行います。データの正規性はシャピロ・ウィルク検定を用いて検証されました。
4. 正規分布データでは、複数グループ比較には一元ANOVAを用い、その後グループ間のペアワイズ比較にはTukeyの事後検定を用います。正規分布でないデータについては、ノンパラメトリックなクルスカル・ウォリス検定を適用します。 P<0.05は有意な差を示しています。
5. グラフソフトを使ってグラフを作成してください。

結果

HNKはUVAによるHDF細胞の酸化ストレス損傷を軽減します
24時間または48時間にわたるさまざまな濃度のHNK処理がHDF細胞の生存可能性に与える影響を、細胞生存能力アッセイによって適切な濃度と治療期間をスクリーニングするために検証されました。結果は、2.5、5、10μMのHNKが治療後24時間または48時間後に正常なHDF細胞の生存率に有意な影響を与えず、これらの用量でHNKが正常細胞に対して無毒であることを示しました。特に、2.5、5、10μMの濃度でのHNKはUVAによるHDF細胞の生存能力障害を緩和し、HNKがHDF細胞をUVA損傷から守ることを示唆し、24時間での処理効果は48時間よりも優れていました。HNK濃度を20および40μMに上げると、正常なHDF細胞とUVA処理されたHDF細胞の両方の生存率が著しく低下し、高濃度のHNK(20-40μM)がHDF細胞に一定の毒性効果を持つことを示唆しています(図1A、B)。そのため、その後の実験では、2.5、5、10 μM HNKがHDF細...

ディスカッション

紫外線は細胞や生物に害を及ぼす環境要因の一つです。過去の研究では、UVAが高い透過力を持つため、^{地球表面に}到達する主な紫外線の種類であると報告されています。線維芽細胞は真皮の重要な機能細胞であり、その老化は直接的または間接的に^{皮膚の老化}を引き起こすことがあります。HDF細胞モデルおよび無毛マウスモデルにおけるUVA誘発光老化損傷は、皮膚^光老化の研究に広く用い^{られています。}したがって、UVA誘発性の光老化損傷の細胞および動物モデルは、過去の研究(HDF細胞では8日間^1日5 J/cm、マウスでは8週間 0.35 J/cm²)を参考に構築されました。32,33,34。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ALT活性分析キット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	P2711M	アラニントランスアミナーゼ活性検出キット
Amplex Red CRE検査キット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	S0291S	クレアチニン検出キット
アンチフェード搭載媒体	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	P0126	蛍光信号保存用マウントメディウム
AST活性分析キット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	P2715S	アスパラギン酸トランスアミナーゼ活性検出キット
BCAタンパク質アッセイキット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	P0012	タンパク質濃度測定キット
BSA	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	V900933	非特異的結合のためのブロッキング試薬
BUNアッセイキット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	S0574S	血尿素窒素検出キット
CAT検査キット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	S0051	カタラーゼ活性検出キット
CCK-8試薬	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	96992	水溶性のテトラゾリウム塩である細胞生存能力測定液
CDK2抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	PA5-79024	CDK2検出のための一次抗体
化学発光剤 ECL	MedChemExpress、ニュージャージー州モンマスジャンクション、アメリカ合衆国	HY-K1005	強化化学発光検出試薬
コラーゲンI抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	PA1-26204	コラーゲンI検出のための一次抗体
サイクリンA2抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	PA5-34682	サイクリンA2検出のための一次抗体
DAPI染色溶液	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	D9542	核染色染料
DCFH-DA蛍光プローブ	MedChemExpress、ニュージャージー州モンマスジャンクション、アメリカ合衆国	HY-D0940	活性酸素種蛍光プローブ
微分解法	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	C0161	ヘマトキシリン分化ステップ用試薬
ジヒドロエチジウムプローブ	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	S0063	活性酸素種プローブ
線維芽細胞培養培地	サンセル・バイオテクノロジー株式会社、武漢、湖北省、中国	SNPM-H342	線維芽細胞増殖のための完全培養培地
FITC標識ヤギ抗ウサギIgG	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	F-2765	フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)標識された二次抗体
フローサイトメトリー	BDバイオサイエンス、カリフォルニア州サンノゼ、アメリカ合衆国	BD FACSCaliburTM	フローサイトメーター
FlowJoソフトウェア	BDバイオサイエンス、カリフォルニア州サンノゼ、アメリカ合衆国	v10.8	フローサイトメトリー解析ソフトウェア
蛍光顕微鏡	ライカ、ハイデルベルク、ドイツ	DMイリノイド	蛍光イメージング用顕微鏡
GAPDH抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	PA1-987	タンパク質正規化のための内部対照抗体
ゲルイメージングシステム	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	iBright CL1500	タンパク質検出のためのイメージングシステム
ヤギ抗ウサギIgG	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	31460	免疫検出のための二次抗体
Graphpad Prism 9.0ソフトウェア	GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ、アメリカ合衆国	プリズム9.0	グラフ作成ソフトウェア
GSHアッセイキット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	S0053	グルタチオン含有量検出キット
HE染色キット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	C0105S	組織形態解析用の組織学的染色キット
HNK	MedChemExpress、ニュージャージー州モンマスジャンクション、アメリカ合衆国	HY-N0003	ホノキオール、バイオアクティブ化合物
ヒトの皮膚線維芽細胞	サンセル・バイオテクノロジー株式会社、武漢、湖北省、中国	SNP-H342	原発ヒト皮膚線維芽細胞
IBM SPSS Statistics 26.0 ソフトウェア	IBMコーポレーション、ニューヨーク州アーモンク、アメリカ合衆国	IBM SPSS 統計 26.0	統計解析ソフトウェア
ImageJソフトウェア	ウェイン・ラスバンド、米国国立精神衛生研究所	バージョン 1.54h	画像解析ソフトウェア
Ki67抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	MA5-14520	細胞増殖マーカー検出のための一次抗体
光顕微鏡	ライカ、ハイデルベルク、ドイツ	DM3000	明界イメージング用光学顕微鏡
マッソントリクロム染色キット	ソラルビオ、北京、中国	G1340	コラーゲンおよび結合組織染色キット
MDAアッセイキット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	S0131S	マロンジアルデヒド濃度検出キット(脂質過酸化マーカー)
マイクロプレートリーダー	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム、アメリカ合衆国	1410101	細胞ベースのアッセイ用吸収度測定装置
MMP-1抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	PA5-27210	マトリックスメタロプロテイナーゼ-1検出のための一次抗体
MMP-1 ELISAキット	酵素結合バイオテクノロジー、中国・上海	ML038199	生物学的サンプル中のMMP-1の定量検出
MMP-3抗体	アブカム、マサチューセッツ州ケンブリッジ、アメリカ合衆国	AB52915	マトリックスメタロプロテイナーゼ-3検出のための一次抗体
MMP-3 ELISAキット	酵素結合バイオテクノロジー、中国・上海	ML105322	生物学的サンプルにおけるMMP-3の定量的検出
ニュートラルガム	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	C0173	取り付け媒体
P16抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	PA5-20379	P16タンパク質検出のための一次抗体
P21抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	MA5-14949	P21タンパク質検出のための一次抗体
P53抗体	アブカム、マサチューセッツ州ケンブリッジ、アメリカ合衆国	ab131442	P53タンパク質検出のための一次抗体
パラホルマルデヒド	ソラルビオ、北京、中国	P1110	細胞および組織固定試薬
PI	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	ST512	細胞周期解析におけるDNA染色のためのプロピジウムヨウ化物
プロコラーゲンI-Cペプチドアッセイキット	宝(TAKARA)、東京、日本	MK101	コラーゲン合成検出キット
p-Smad2抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	44-244G	リン酸化Smad2検出のための一次抗体
p-Smad3抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	44-246G	リン酸化Smad3検出のための一次抗体
PVDF膜	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	88520	ウエスタンブロッティング用のタンパク質転送膜
RIPA溶解バッファー	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	P0013B	細胞および組織の溶解液用タンパク質抽出バッファー
RNaseA	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	ST579	DNA染色中のRNA除去のためのリボヌクレアーゼ
SA&β;-ガラクトシダーゼ染色キット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	C0602	細胞老化検出キット
SB431542	MedChemExpress、ニュージャージー州モンマスジャンクション、アメリカ合衆国	HY-10431	TGF-&ベータ;1 シグナル伝達経路阻害剤
SDS-PAGEゲル	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	WG1403BX10	タンパク質電気泳動用のポリアクリルアミドゲル
SKH1の無毛マウス	中国・北京、ヴィタルリバー		皮膚写真老化研究のための動物モデル
Smad2抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	51-1300	Smad2検出のための一次抗体
Smad3抗体	インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国	51-1500	Smad3検出のための一次抗体
SODアッセイキット	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	S0101S	超酸化物ディスミューターゼ活性検出キット
TGF-&ベータ;抗体1本	アブカム、マサチューセッツ州ケンブリッジ、アメリカ合衆国	ab215715	TGF-およびβの一次抗体;1 検出
トライトン X-100	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	X-100	細胞膜透過化のための非イオン性洗剤
TUNELアッセイ溶液	ビヨタイム・バイオテクノロジー、上海、中国	C1086	DNA断片化のためのアポトーシス検出試薬
キシレン	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	247642	組織脱硫化のための有機溶媒