マウス胚から白および茶色の前脂肪細胞を単離・培養するための新しく、堅牢かつ再現性のあるアプローチを提示し、脂肪細胞系統のコミットメントと分化を支配する細胞および分子メカニズムを解析する強力な in vitro 戦略を確立し、脂肪組織発生の影響を調査するための枠組みを提供します。
方法論記事
マウス胚からの白色および茶色のプレディポサイトの分離と培養
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
脂肪組織は代謝恒常性において中心的な役割を果たし、その性質は胚発生中に脂肪細胞分化を通じて形成されます。したがって、胚性前脂肪細胞は脂肪組織形成および系統指定の初期事象を研究する上で重要なモデルとなります。本記事では、胚15.5日(E15.5)にマウス胚から分離された白および茶色の前脂肪細胞を分離し、体 外 で分離するための再現可能なプロトコルについて説明します。この段階で脂肪貯留施設が形成され始めます。この方法は、細胞の生存率と脂肪形成成熟を支援する組織マイクロセリション、酵素的消化、一次培養、系統特異的分化条件に関する詳細な指針を提供します。代表的な結果としては脂質滴の蓄積や系統関連マーカーの発現が含まれ、特定の培養条件下での成功した分化が確認されました。このアプローチを用いることで、胚の前脂肪細胞を白色または茶色の脂肪細胞の運命に誘導し、発生時期、系統特性、遺伝子発現プロファイルの比較解析が可能になります。このプロトコルは、管理された実験環境下で脂肪組織形成および周産期プログラミング機構を調査するための実用的かつ発達に関連したツールを提供します。
概要
脂肪組織は、エネルギー貯蔵、内分泌シグナル伝達、適応的熱生成を調節することで全身の恒常性維持に中心的な役割を果たし、局所および遠方の臓器と広範に相互作用します。脂肪組織には主に2つのタイプが分けられます。白い脂肪組織(WAT)と茶色脂肪組織(BAT)で、これらは細胞系統、生理機能、解剖学的分布、代謝活動において著しく異なります。
WATは生物の一次エネルギー貯蔵庫を構成しています。白色の脂肪細胞は脂質の蓄積に非常に特化しており、細胞質空間の大部分を占める単一の大きな脂質滴(LD)が存在することが特徴です。これに対し、BATは震えない熱発生に特化しています。茶色の脂肪細胞は複数の小さなLDを含み、高いミトコンドリア密度を示します3,6。BATの熱生成能力は、膜を越えたプロトン漏れを促進する内ミトコンドリア膜タンパク質であるアンカップリングプロテイン1(UCP1)に依存しています。ATP合成からの酸化リン酸化を切り離すことで、UCP1は陽子勾配を熱として消散し、体温8の維持に寄与します。多様な役割を持つWATとBATは、代謝疾患における主要な調節因子や潜在的な治療標的としてだけでなく、複雑で広範な全身的相互作用により発生・進化生物学、免疫学、加齢の分野でも大きな関心を集めています(9,10)。蓄積される証拠は、胎児の代謝プログラミングが脂肪組織の発達と密接に関連しており、子宮内環境の乱れが脂肪細胞の数、分布、機能に影響を与え、肥満や代謝疾患の素因を生みやすくすることを示しています11。
脂肪組織の生物学を調査するには、成熟した脂肪細胞の利用可能性が不可欠です。in vitro培養システムは、脂肪形成や脂肪細胞の機能に影響を与える特定の要因を評価するための管理された環境を提供します。成マウスや新生児幼獣からの脂肪細胞の分離および分化のためのいくつかのプロトコルが確立されています 12,13,14,15。しかし、これらの脂肪細胞の前駆体は、発生過程で脂肪組織を形成する元の細胞群とは異なる場合があります。マウスでは、BATデポが胚発生時に最初に発達し、新生児に震えのない熱生成能力を提供し、出生後の寒冷適応に不可欠です。茶色脂肪細胞のデポは胚14.5日目(E14.5)16から肩甲間領域で検出可能です。LDはE15.5で形成され始め、UCP1の発現はE16.5付近で始まります。マウス胚では、鼠径WAT(iWAT)の前脂肪細胞もこの段階16ですでに存在しています。
ここで説明するプロトコルは、E15.5で分離された前脂肪細胞に焦点を当てています。この段階は胚期にあたり、前駆細胞がin vivoで分化を開始する16期に対応し、WATおよびBATを生み出す主要な前駆細胞を表します。一方、成人または新生児期に分離された脂肪生成性前身は、すでに環境要因の影響を受けている可能性があり、より限定的な可塑性を示す可能性が高いです。したがって、胚の前駆細胞をE15.5で使用することで、生体内脂肪生成プログラムを忠実に再現する能力が高まります。これらの細胞は高い発生可塑性を保持し、生理学的分化の軌跡をたどりやすいからです。このアプローチは特に発生生物学の課題に関心を持ち、周産期における環境要因が前脂肪細胞の分化に与える影響を調査する際に注目されており、早期の曝露が脂肪組織の発生や長期的な代謝結果にどのように影響するかを研究する貴重なモデルを提供します。ただし、この段階特異性には注意が必要です。この方法はE15.5胚に最適化されており、胚の年齢や解剖精度の偏差は細胞の収量や生存率に影響を与える可能性があります。さらに、マイクロディセプション技術は、胚のデポが小さいため、非脂肪組織との汚染を避けるための練習が必要です。このプロトコルは、胚性前脂肪細胞を成熟した茶色および白色脂肪細胞に分離、培養、増幅、分化するためのすべての手順と手順をまとめています。
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プロトコル
すべての動物処置は、現地の規則に従い、2010年9月22日の欧州連合理事会指令(2010/63/EU)(APAFIS#2617-201510517317420)で定められたガイドラインに従って行われました。
すべての生物廃棄物および酵素溶液は、生物有害物質に関する機関のバイオセーフティガイドラインおよび規制に従って取り扱い、処分されなければなりません。具体的には:
- 生物廃棄物:承認されたバイオハザード容器に収集し、オートクレーブ処理または機関のバイオセーフティオフィスの指示に従って処分します。
- 酵素溶液:残留酵素活性を10%漂白剤を加えて30分間不活化し、現地の規制に従って化学廃棄物として処分します。
- 汚染された消耗品(ピペットの先端、チューブなど):バイオハザードバッグやオートクレーブに入れてから廃棄してください。
- 固定試薬:指定された容器に有害化学廃棄物として処分されます。
廃棄物を扱う際は必ず適切なPPEを着用してください。
1. マウス胚の採取
- 妊娠中のマウス(C57Bl/6J)は、施設動物ケア・利用委員会のガイドラインに従って安楽死させてください。
- 妊娠中のマウスの腹部を70%エタノールで消毒し、子宮を露出させるために正中切開を行ってください。
- E15.5で胚を含む卵黄嚢を腹部を切開し、冷たい(4°C)1倍PBSを含むアガロース箱に入れます。
- 各卵黄嚢の外膜と胎盤を除去し、胚のへその緒を切断します。
- 胚を新しいアガロース箱に入れ、冷たい1xPBSを入れます。
注:この妊娠期では、意識的な痛み知覚の基盤となる中枢神経系の構造が完全に発達していませんが、末梢の侵害受容体はE13からE15の間に形成され始めます。動物管理ガイドラインに従い、侵害受容反応の可能性を最小限に抑えるため、胚は実験的操作の前に斬首による安楽死を推奨します。
2. 胚性脂肪組織の解剖(図1)
- 肩甲間BATの解離(図1A)
- 5%アガロースプレートから長方形を切り取り、胚をその中に置いて動けなくします。皿に冷たい1倍PBSを詰めます。胚入りのアガロースボックスを双眼顕微鏡の下に置きます。
- 胚の背面から皮膚を剥がす。
- 細かい鉗子と顕微なハサミを使って肩甲間BATを解離します。
- 微細ハサミを使ってBATを周囲の組織(結合組織および筋肉)から慎重に分離し、約4–6 mm x 2–3 mmのBATサンプルを採取します。
- BATを2 mLのチューブに、1 mLの冷たい(4°C)ドルベッコ改良イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F-12)と100 U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を入れたチューブに入れます。
- iWATの解剖(図1B)
- 胚を横向きに(片側に、次にもう片側に)アガロースプレートに置きます。
- 細かい鉗子と顕微なハサミを使ってiWATを解剖します。
- iWATを周囲の組織(結合組織と皮膚)から慎重に分離し、約2–4 mm x 0.5–0.8 mmのデポが2つになるまで続けます。
- 2つのWATサンプルを、100 U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含む2 mLの冷たいDMEM/F-12グルタミン入りチューブに入れます。
注意:すべての解剖は、事前に消毒された器具を使い、できるだけ無菌の環境で双眼顕微鏡で行わなければなりません。
3. 脂肪組織の消化
- ピペットでDMEM/F12を取り出し、チューブに200μLのDMEM/F12グルタミンと100 U/mL p/S、0.2%の牛血清アルブミン(BSA)、0.5 Uコラーゲン酵素D、0.5 U Dispase IIを加えます。
- チューブ内のマイクロシザーで組織を切断し、組織の断片をできるだけ減らし、ピペットで上下に10回動いて消化を助けます。
注意:完全に分解されたサンプルは、組織の塊が目に見えない濁った懸濁液として見えるはずです。 - 37°C(水浴)で15分間孵化します。
- 反応を止めるために、600μLの冷DMEM/F-12グルタミンと100 U/mL p/s、20%胎児牛血清(FBS)を加えます。ピペットで上下に10回ずつ均等に再懸浮します。
4. 一次細胞培養
注意:この段階以降、すべての手順は汚染を防ぐために、生物安全キャビネット(BSC)内で厳格な無菌条件下で実施されなければなりません。滅菌手袋、白衣、安全ゴーグルを着用し、無菌性を維持し、潜在的な危険から身を守ってください。滅菌使い捨てプラスチック器具を使用し、無菌技術を持ち、すべての試薬とメディアが無菌であることを確認しましょう。汚染を防ぐために、無菌でない表面への接触を避けてください。
- セルをウェルスライドにプレートし、標準条件(37°C、5%CO2)で1時間キュベートします。8ウェルプレートの場合は、200 μL/ウェルを投与します。培養後、顕微鏡で観察しながらプレートを優しく動かして細胞が付着しているか確認します。
注:この段階では、異なるBATまたはWATサンプルを1本のチューブにまとめて、異なるウェルで均質化された培養を得ることができます(例:類似培養に対する処理効果の試験)。 - 培地を予温(37°C)のDMEM/F-12グルタミンと100 U/mL P/S、10% FBSで交換し、細胞を37°C、CO5%で一晩培養します。
注意:培地を変えることで、分解できなかった死んだ・未結合の細胞や組織断片が除去され、付着した細胞だけが残ります。 - 分化処理(72時間)
- 褐色脂肪細胞分化のために、予備加熱(37°C)DMEM/F-12グルタミンを100 U/mL p/s、10% FBS、125 nMインドメタシン、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、1 nMトリヨドチロニン(T3)、1 μM ロシグリタゾン、1 μM デキサメタゾン、850 nM インスリンを加えて培地を交換し、37°C、5% CO2 で72時間培養します。
- 白色脂肪細胞分化のために、予温されたDMEM/F-12グルタミンを用いて培地を100 U/mL p/s、10% FBS、0.5 mM IBMX、1 μM デキサメタゾン、850 nM インスリンで交換し、37°C、5%CO2 で72時間培養します。
- 維持治療(48時間ごと)
- 培地を予備加熱(37°C)のDMEM/F-12グルタミンと、100 U/mL p/s、10% FBS、1 nM T3、1 μM ロシグリタゾン、850 nM インスリンを用いて交換します。48時間ごとに更新してください。
注:記載されているすべての濃度は試薬の最終的な作動濃度を指します。処理するウェル数に応じて、8ウェルプレートの標準体積として1井戸あたり200μLを用いて、最終的な差別および維持媒体の体積を調整します。
- 培地を予備加熱(37°C)のDMEM/F-12グルタミンと、100 U/mL p/s、10% FBS、1 nM T3、1 μM ロシグリタゾン、850 nM インスリンを用いて交換します。48時間ごとに更新してください。
5. 固定と免疫染色(図2A)
- 培地を吸引し、冷たい1倍PBSで細胞を洗浄します。
- 細胞を10分間、1xPBSに4%ホルムアルデヒドを冷たい溶け液で固定します。
- 細胞をPBS1回で3回、5分洗います。
- 細胞を0.1%トリトンを1x PBSに浸して10分間透過させてください。
- 細胞をPBS1回で3回、5分洗います。
- 室温(RT)で1xPBSに5%の正常なドンキー血清(NDS)を1時間ブロックします。
注:ブロッキング血清の種の選択は、二次抗体が産生される種によって異なります。 - 一次抗体を5% NDSで希釈し、1xPBSを4°Cで一晩培養します。
注意:一次抗体をウェルに添加しないでください。これは陰性対照として機能します。 - 細胞を1回のPBSで2回×5分洗います。
- 細胞を5%NDSで1xPBSに5分間洗い流します。
- 二次抗体、DAPI、ボディピを1時間RTで培養し、光から守るために覆いをします。
- 井戸をPBS1回で3回、5分ずつ洗浄します。
- 画像を入手するまで、暗闇でセルを4°Cの温度に保ちます。
6. 前細胞の冷凍保存
注:分化過程の前後に培養を停止し凍結して保存し、次の細胞培養に再利用することも可能です。
- 冷凍培地を準備します:50% FBS、40% DMEM/F-12 グルタミン、100 U/mL p/S、10% ジメチル硫酸(DMSO)を充填します。
注意:DMSOは有害な化学物質です。皮膚や目の刺激物質であり、他の有害物質の吸収を皮膚から促進し、吸入や摂取時に害を及ぼす可能性があります。DMSOは必ずBSC内で取り扱い、曝露や汚染を最小限に抑えてください。適切な個人用防護具(PPE)(滅菌手袋、白衣、接触防止の安全ゴーグル)を着用してください。肌の接触は避けてください。接触した場合は、すぐにたっぷりの水で洗ってください。使用しないときはBSC内の密閉容器にDMSOを保管し、検査室の安全プロトコルに従って適切に処分してください。 - セルは予温(37°C)の1倍PBSで洗浄します。
- 予温(37°C)0.05%トリプシンを加えて細胞を化学的に剥離し、37°C、5%CO2で5分間培養します。顕微鏡で細胞剥離の有無を目で確認してください。
- 反応を止めるために、予温(37°C)のDMEM/F-12グルタミンを3倍の体積に加え、p/s100 U/mL、FBS10%を加えます。均等に再懸置してください。
- 遠心分離機で7分、RTで300g ×、上 清液を捨てます。
- 細胞を10mLの冷凍培地に再懸浮させます。離心分離機でRTで7分、300 × g で、上清液を捨て、約3 mLを残します。
注意:カウント後、セル数を計算するには正確な体積を測定してください。 - 小さな体を1:2のトライパンブルーで希釈し、ノイバウアーチャンバーを使って生細胞を数えます。
- 冷凍培地で体積を調整し、5 × 10 – 1 – ×105 細胞/バイアル(最終体積:1 mL/バイアル)にします。
- バイアルを冷凍容器(冷却速度:-1°C/min)に移し、-80°Cで一晩保存します。
- 長期保存のために液体窒素に移します。
注:このプロトコルにより、解凍後の生存率は90%を超えます。 - 必要に応じて、37°Cの水浴で素早く解凍して細胞を解凍します。
- バイアルの内容物を予温(37°C)DMEM/F-12グルタミン4mLに移し、p/sは100 U/mL、FBSは10%です。ピペットで上下に10回優しくリスペントします。37°C、CO25%で一晩培養します。
- ミディウムを新しいDMEM/F-12グルタミンに置き換え、100 U/mL P/S、10%のFBSを含み、48時間ごとに更新してください。
注:DMSO残留物を除去するために培地交換を行うことが非常に重要です。長期間の曝露は細胞の生存率、分化、機能を損なう可能性があるためです。細胞毒性を避けるために、完全な培地置換を必ず行ってください。 - 実験やパスセージセルは80%の合流度に達したら進行します。
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結果
図1に示すように、未去のBATおよびiWATデポはE15.5の胚から効率的に分離できます。BATはE15.5胚で容易に検出できますが、iWATの検出には訓練が必要かもしれません。いずれの場合も、他の細胞タイプの培養を避けるために、粗い解剖後に周囲のすべての組織を顕微解剖することが不可欠です。
白い前脂肪細胞と茶色の前脂肪細胞の初期消化および培養段階は同一ですが(図2A、B)、その後の分化段階は、前脂肪細胞が分離された組織の起源によって、細胞を白色または茶色の脂肪細胞系統に誘導する方向性が異なります。したがって、細胞は適用された処理によって異なる分化プロファイルを示します(図3A)。このプロトコルを用いることで、E15.5で胚あたり約20万個の生存可能な茶色脂肪細胞と15万個の生存可能な白色脂肪細胞を一貫し...
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ディスカッション
プレディポサイト培養は、さまざまな実験的文脈で広く記述されています。しかし、既存のプロトコルは主に成人組織や胚性線維芽細胞に依存しており、発生中の脂肪組織から胚性前脂肪細胞を直接分離・培養する標準化された方法は現時点で存在しません。これらの細胞の研究は特に重要であり、それらはそれぞれのネイティブ胚の微小環境内に存在する本物の前脂肪細胞集団を表しています。このような解析は、胚発生中の白・茶色脂肪細胞の形成、分化手がかりや各発達段階を支配する分子因子を理解する上で極めて重要です。E15.5は、主に成熟した前駆細胞が得られる成虫分離株や新生モデルでは可塑性が制限されるのに対し、WATおよびBATデポが活性化している臨界点を示しています。さらに、胚性前脂肪細胞培養は、環境の影響が脂肪形成プログラムに与える影響を調査する独自の戦略を提供します。これらの前駆細胞をin vitroで培養することで、微小環境の精密な操作が可能となり、これまでに行ったsiRNA介在のノックダウンなどの遺伝子介入が可能になります。
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開示事項
著者には利益相反を主張するものはありません。
謝辞
クリスチャン・デュヘムの助言に感謝します。フランス国立保健医療研究所(INSERM)からの支援に感謝します。M.C-MはANR-23-CE13-0044によって支えられていました。M.Aは欧州糖尿病ゲノム研究所(EGID、ANR-10-LABX-0046)、糖尿病精密医療国立センター(PreciDIAB、ANR-18-IBHU-0001)、およびオー・ド・フランス地域評議会(22005973)の支援を受けました。 図2 はBioRenderで作成されました。メイユーフ・ルーシャール、A.(2026年)https://BioRender.com/3pbzif1。SBはANR-24-CHBS-0002助成金の支援を受けていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3,5,3'-トリイオドチロニン | シグマ | 709719 | T3 |
| 3-イソブチル-1-メチルキサンチン | シグマ | I7018 | IBMX |
| アガロース | シグマ | A0169 | |
| アルコール | VWR | 1.59010.0500 | |
| 抗UCP1抗体 | アブカム | AB10983 | |
| 双眼鏡現微鏡 | ライカ | MZ9.5 | |
| 生物学的安全キャビネット | サーモ・サイエンティフィック | 51022482 | BSC、HeraSafe KS クラスII安全キャビネット |
| ボディピー | インビトロジェン | D3922 | 励起/放出 493/504 nm |
| 牛血清アルブミン | ユーロメデックス | 04-100-812-C | BSA |
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | 5430 R | |
| クランプ | FST(ドイツ・ステンレス) | ||
| コラーゲン酵素D | シグマ | 11088882001 | |
| クライオチューブ | サーステット | 72.379 | |
| 培養プレート(8ウェル) | Ibidi | 80826 | |
| 培養プレート(12ウェル) | コーニング・コスター | CLS3513 | 発泡スチロール板、平底、無菌 |
| デキサメタゾン | シグマ | D2915 | |
| ディスパースII | シグマ | 4942078001 | |
| DMEM/F12 | ギブコ | 31331 | グルタミン添加 |
| DMSO | シグマ | D2438 | |
| ロバ抗ウサギ抗体 | インビトロジェン | A32795 | Alexa Fluo Plus 647 |
| エッペンドルフス 1.5 mL | エッペンドルフ | 15625367 | |
| FBS | ギブコ | A5256701 | |
| ホルムアルデヒド 37% | サーモ・サイエンティフィック | 119690010 | |
| 冷凍容器 | サーモ・サイエンティフィック | 5100-0001 | |
| ホエクスト | インビトロジェン | H3570 | |
| インキュベーター | サーモ・サイエンティフィック | 50116048 | ヘラセル150i CO2インキュベーター |
| インドメタシン | シグマ | I7378 | |
| インスリン | シグマ | I9278 | |
| 10倍の時間を備えた倒立顕微鏡;対物レンズ照明とハロゲン照明 | カール・ツァイス アクシオ・ヴェールA1 | ||
| マウス C57BL/6J | チャールズ川 | ||
| マイクロシザーズ | FST(ドイツ・ステンレス) | ||
| NDS | シグマ | D9663 | |
| ノイバウアー・チェンバー | サーモ・サイエンティフィック | 10195580 | |
| PBS 10x | ギブコ | 14200 | |
| PBS 1x | ギブコ | 14190 | |
| ペニシリン/ストレプトミシン | ギブコ | 15140-122 | |
| ペトリ皿 | サーステット | 83.3902 | |
| qPCRプレート | サーモ・サイエンティフィック | AB-0600 | |
| Fabp4用のqPCRプローブ | サーモ・サイエンティフィック | 4331182 | タクマンが分析Mm00445878_m1 |
| Pparg用のqPCRプローブ | サーモ・サイエンティフィック | 4331182 | タクマンが分析し、Mm00440940_m1 |
| Ucp-1用のqPCRプローブ | サーモ・サイエンティフィック | 4331182 | タクマンの分析、Mm01244861_m1 |
| 逆転写キット | サーモ・サイエンティフィック | 4368813 | 高容量cDNAキット |
| RNA抽出キット | オメガ・バイオテック | R6934-02 | E.Z.N.A. トータルRNAキットII |
| ロジグリタゾン | シグマ | R2408 | |
| トライトン X-100 | サーモ・サイエンティフィック | A16046 | |
| トライパン・ブルー | シグマ | T8154 | |
| トリプシン-EDTA | ギブコ | 25300054 | |
| 水浴 | グラント | SAP12 | 12リットル容量 |
参考文献
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