本プロトコルは、サンデル・コルトフ反応を用いてヒト肝微量体における化学物質がデヨオジナーゼ1(DIO1)活性に与える影響を信頼性高く評価する比色法を記述しています。このプログラムには、あらかじめ定められた受容基準や統計的パフォーマンス指標が含まれており、OECD試験ガイドラインの組み込みに向けた継続的な取り組みを支援しています。
この記事について
サマリー
要約
この方法は、DIO1活性を阻害し、甲状腺ホルモンの恒常性を妨げる可能性のある検査物質の特定を可能にします。提示されたプロトコルは、ヒト肝臓マイクロソームにおけるデイオジナーゼ1(DIO1)の酵素活性に対する試験物質の効果を評価する非放射性比色法を記述しています。このアッセイはSandell-Kolthoff(SK)反応に基づいており、逆トリヨードチロニン(rT3)からジヨードチロニン(T2)への脱ヨウ化物化時に放出されるヨウ化物を定量化します。黄色いセリウム(IV)はヨウ化物の存在下で無色セリウム(III)に還元され、415 nmの測光検出が可能になります。この標準化されたセットアップでは、セリウム(IV)濃度を40 mMに設定し、信号の安定性と堅牢性を向上させます。アッセイの信頼性と再現性を確保するために、包括的なコントロールセットアップが組み込まれています:6-プロピル-2-チオウラシル(参照項目)、オーロチオグルコース(陽性コントロール)、1-チオβ-D-グルコースナトリウム塩(陰性コントロール)、および1%ジメチルスルフォキシド(溶媒コントロール)。プロトコルには、適切な検査濃度を決定する距離測定法、ミクロソームのバッチ特異的ヨウ化物放出活性の標準化、ミクロソーム不在時の構造化化学干渉試験、さらにジチオスレイトール(DTT)を使わない追跡評価によるDTT依存性アーティファクトの特定が含まれます。DIO1-SKアッセイは中〜高スループットスクリーニングおよび機構毒性学研究に適しています。その堅牢性、拡張性、そしてヒトのマイクロソームへの適用性から、内分泌撹乱の調査に貴重なツールとなっています。このプロトコルは規制の検証努力を支援します。
概要
内分泌撹乱物質(ED)はホルモン調節を妨げ、その結果として人間に有害な影響を引き起こす化学物質です1,2。デイオジナーゼ(DIO)は膜結合酵素であり、その活性部位にはセレノシステインが主要な残基です。この酵素ファミリーは、3つの異なるアイソフォーム(DIO1、DIO2、DIO3)からなり、循環中の甲状腺ホルモン(TH)濃度を調節し、細胞内での組織特異的利用可能性を制御します。プロホルモンとして機能するチロキシン(T4)と活性型のトリイオドチロニン(T3)は、体内のエネルギー消費、成長、発達過程、体温調節に重要な役割を果たします。DIOアイソフォームは、脱ヨウ化部位特異性、速度論的特性、基質選好性において異なります。DIO1は成人肝臓における主要なデヨジナーゼアイソフォームであり、逆トリヨードチロニン(rT3)および硫酸ヨードチロニンに対して強い基質親和性を示します。一方、DIO2はT4とrT3を優先的に利用し、DIO3は主にT4とT3に作用します。ヒト肝微小体とrT3を基質として用いることで、DIO1活性を選択的に検出でき、他のアイソフォームからの干渉を最小限に抑えます。物質誘発性DIO1阻害の正確な結果はまだ完全に解明されていませんが、DIO1に影響を与えるヒト遺伝子変異の証拠は、DIO1が甲状腺ホルモン系を破壊できることを明確に示しています5。その結果、DIO1阻害を調査するためには、堅牢で再現性のある手法が極めて必要とされています。
本手法の目的は、Sandell-Kolthoff(SK)反応に基づく非放射性比色法を用いて、in vitroでDIO1活性を定量化することです。DIO1は逆rT3をT2に変換する触媒を働き、ヨウ化物イオンの放出を引き起こします。SK反応により、放出されたヨウ化物の感度が高い検出が可能となり、IOO1活性の直接的な指標としてヨウ化物放出活性(IRA)を測定することが可能になります。このアッセイにより、試験物質のDIO1に対する阻害効果の検出が可能となり、機構毒性学、スクリーニング、規制決定を支援します。特に、EURL ECVAM 6,7が主導する国際的な検証努力で示されているように、甲状腺障害を引き起こす有害な結果経路の分子開始イベントとしてのDIO1阻害の調査に特に重要です。この方法は2012年に開発され、特に甲状腺ホルモン代謝の文脈で内分泌スクリーニングのテストバッテリーに統合できる堅牢で再現性があり、スケーラブルなin vitroアッセイの需要が高まることに応じてさらに最適化されました。最近、中10から高スループットスクリーニング11へのアナログSKベースのセットアップの応用が発表され、SKベースのアプローチの広範な適用性が示されました。
DIO1-SKアッセイはTH産物ではなくIRAを定量することでDIO1活性を間接的に測定しますが、他の手法に比べていくつかの利点があります。放射性標識基質12や、枯渇または形成された甲状腺ホルモンの質量分析による定量に依存する手法とは異なり、SK反応は415nm14でヨウ化物放出を測定することで、シンプルで拡張可能かつコスト効率の高い測定値を提供します。固体相抽出を用いたLC-MS/MS(SPE-LC-MS/MS)法はrT3およびT2の定量において高い特異性と感度を提供しますが、高価な機器を必要とし、高スループットスクリーニングにはあまり適していません。対照的に、DIO1-SKアッセイは標準的な実験室環境で実装可能であり、ヒト肝マイクロソームでの使用が事前検証されており、高い再現性と予測性を示しています6,7。比較研究では、SK反応、特にヨウ化物放出の結果が、SPE-LC-MS/MS 15を用いた甲状腺ホルモン代謝物(rT3およびT2)の定量と直接比較されました。この発見は、さまざまな試験物質や阻害効果において両者のアプローチに強い一致があることを示しました。試験対象のすべての物質において、SK反応で測定されたヨウ化物放出活性(IRA)の変化は、質量分析で決定されたrT3およびT2レベルの変化とほぼ一致していました。これにより、SK表示がDIO1活性の代理として有効であることがさらに裏付けられました。これらの比較解析により、SKアッセイはより複雑な分析手法に対する堅牢かつ信頼性の高い代替手段を提供し、ヨウ化物放出を自信を持って測定してVITROでのDIO1阻害評価が可能であることが確認されました。
しかし、SK法には考慮すべきいくつかの制限があります。すなわち、遊離ヨウ化物を不純物として含む物質、非酵素的にヨウ化物を放出する物質、またはジチオスレイトール(DTT)などのアッセイ成分と反応する物質からの干渉を受けやすいことです。DTTは、ターンオーバー中の活性部位セレノシステインの再生を補助することで、デヨジナーゼ触媒能力を維持する還元補因子として含まれています。DTTは強力な還元剤であるため、特定の試験物質(または不純物)が酸化還元反応を起こし、比色表示に影響を与え、場合によっては酵素ヨウ化物放出とは無関係なDTT依存のアッセイアーティファクトを引き起こすことがあります。このような干渉は、測定されたヨウ化物がrT3の酵素変換に由来しない可能性があるため、DIO1阻害の偽陰性結果をもたらすことがあります。したがって、SKアッセイは通常のスクリーニングやほとんどの試験物質に適していますが、LC-MS/MSはアッセイ干渉が疑われる場合や複雑な化学特性を持つ物質の確認に使用できます。
DIO1-SKアッセイは現在、国際的なPEPPER(内分泌撹乱物質特性評価手法の検証のための官民連携プラットフォーム)プロジェクトのOECD検査ガイドラインとして組み込まれる準備が進められており、規制応用における重要性の高まりや内分泌撹乱物質検査戦略の国際調和に注目されています。このアッセイは包括的なin vitro試験バッテリーに統合され、化学的安全性評価と内分泌撹乱の機序的調査の両方を支援することができます。甲状腺の有害なアウトカム経路に沿った追加の重要な事象に対応するアッセイと組み合わせることで、甲状腺ホルモンの撹乱メカニズムのより完全な理解に寄与します。
さらに、このプロトコルのスケーラビリティと高い再現性により、中〜高スループットのスクリーニングに適しています。これは、薬剤開発や学術現場で大量の物質を評価するために不可欠であり、最近11が実証しました。スクリーニング、機構的毒性学、規制上の意思決定など、DIO1阻害に関心のある研究者は、堅牢でアクセスしやすく、多用途なアッセイから恩恵を受けるでしょう。この方法の検証により、甲状腺ホルモン系の乱れ研究や化学物質安全性の評価における標準的なツールとなるでしょう。
プロトコル
注:主アッセイを行う前に、DIO1-SKアッセイの正確性、再現性、妥当性を確保するために一連の準備作業が不可欠です。これらのプレアッセイ活動には、イオン交換や樹脂充填フィルタープレートの鋳造が含まれ、SK反応における効果的な分離と背景干渉の最小化に不可欠です。サンデル・コルトホフ反応は、ヨウ化物標準曲線を用いて定期的に標準化され、体系的な変化を監視し、アッセイの質を維持しています。ヒト肝マイクロソームの活性を測定し、バッチ特異的なヨウ化物放出能力を決定し、実験間で一貫した酵素性能を確保します。これらのステップが組み合わさることで、その後の主要なアッセイ作業とデータ評価の強固な基盤が築かれ、再現可能で解釈可能な結果の生成を支援します。
1. プレアッセイ作業
- バッファーおよび試薬の調製
- 表1に記載されているように、バッファーとストック溶液は事前に準備してください。安定性と再現性を確保するために、指示通りにアリクオートを保存してください。
- アッセイ当日には、96ウェルプレートごとに基質混合物を新たに準備します。96ウェルプレート1枚に対して、5.75 mLのHEPES/EDTAバッファー(50 mM HEPES、2.16 mM EDTA、pH 7.0)、解凍した1 M DTT 0.5 mL、6 mM rT3 10 μL(DMSOに溶解)を組み合わせます。優しく混ぜて、使うまでは床材のミックスを氷の上に置いておく。
- 参考文献の作成
- アッセイ実施当日に、適切な溶媒(例:DMSO)で10-1M の基準制御6-PTUストック溶液を準備します。
- このストックをdiH2O(RI-C8)で1:10希釈してDMSO濃度を10%にし、表2に記載されたように10% DMSOをdiH2Oに希釈して一連の希釈を準備します。
- 陽性対照の調製
- 適切な溶媒(例:DMSO)に10〜2 Mの正対照オーロチオグルコースのストック溶液を準備し、4°Cで最大6ヶ月保存します。
- アッセイ当日、ストックを2Oの2Oで10〜3Mに希釈し、DMSO濃度を10%にします。
- 陰性コントロールの調製
- アッセイを行う当日に、陰性対照の1-チオβ-D-グルコースナトリウム塩を新鮮に10〜2M のストック溶液を準備します。
- アッセイ当日、ストックを2Oの2Oで10〜3Mに希釈し、DMSO濃度を10%にします。
注意:特にヒ素ナトリウムや硫酸などの有害化学物質を扱う際は、常に適切な安全対策を講じてください。すべての試薬は脱イオン水で準備され、製造者の推奨に従って保管されるべきです。基質混合物は、一度調製され解凍されたDTTアリコートは、アッセイ当日の単発使用を想定しており、再冷凍は必要ありません。
- イオン交換樹脂の鋳造
- 準備には適切な長方形の透明容器を使いましょう。
- 大きな容器に約250g(または希望の量)のイオン交換樹脂を加えて洗い流します。酢酸10%を加えて洗い、樹脂の懸液を10分間休ませます。
- 懸濁液を10分間静かにした後、少し傾けて上清液を吸引します。合計で最低5回は洗うか、溶剤に色が漏れなくなるまで洗ってください。
- 最後の洗浄工程の後、酢酸を10%加えて全体の約50%を占めるようにします。
- 容器を傾けて樹脂が片側に動くようにし、傾いた状態に安定させます。フェーズが分離するまで約10分待つ。
- 96ウェルのフィルタープレートを96深ウェルプレートの上に置き、それぞれのウェルに100μLの10%酢酸を加えます。
- 樹脂鋳造用の先端を~1cmの高さで切り、端の開口部を広げ、96ウェルフィルタープレートの各ウェルに300μLのイオン交換樹脂を鋳造します。
注:当研究で使用されるチップは最大容量1,200μLで、マルチチャネルピペットに接続可能です。 - 酢酸は、100〜200 g の×を遠心分離機で遠心分離し、1分間スイングアウトローターを装着した遠心分離機で1分間溶出します。樹脂がプレート全体に均等に分布しているか確認してください。
- プレートを不透水のプラスチックシートで密封し、最大6ヶ月間4°Cで保存します。
注:イオン交換樹脂の成分は、適切に洗い流さないとSK反応に影響を与えることが知られています。除去された上清液はSK反応に直接使用可能で(上清液サンプル50μL、セリウム50μL、最後にヒ素溶液50μLを加え)、10%酢酸サンプル(ブランクコントロール)と比較して成分の完全な洗浄を確実にします。
- サンデル・コルトフ反応の標準化
- それぞれのヨウ化物供給源(例:ヨウ化物標準溶液)から、推奨濃度1,500、1,000、750、500、400、300、200、100、50、25、10、5、1 nMのヨウ化物希釈物を、それぞれのヨウ化物標準を用いてdiH2Oで調製します。
- 対照として純粋なdiH2Oを50 μL、調製したヨウ化物希釈物50 μLを図 1のレイアウトに三重にまとめた96ウェルプレートに加えます。
- すべての井戸に40 mMのセリウム溶液50 μLを加え、反応を開始します。すべての井戸に25 mMのヒ素溶液50 μLを加えます。
- ヒ素溶液を加えた後、できるだけ早く415 nm(±2 nm)のプレートリーダーで吸収を測定し、21分間1分ごとに光学密度(OD)を記録し、初期ODも記録します。
- 第4節で説明されている結果を評価してください。
注:通常、純粋なdiH2OコントロールでΔOD21分>0.3のバックグラウンドは、根底にある原因(例:AsまたはCeバッチの汚染、水質の低下)について注意し、さらなる調査が必要です。
- マイクロソーム活性の評価
- ステップ1.2で説明した基準項目(6-PTU)の最高濃度(RI-C8)を準備します。
- 表3に記載された6つのマイクロソーム希釈と表1に記載された基質混合物を準備します。
- 図2のプレートレイアウトに示されたように、図2のプレートレイアウトに示された30倍の3倍の3倍の96ウェルプレートに、10μLの10μL(v/v)溶媒希釈液10μL(例:diH2O)に加えます。
- プレートレイアウトに示すように、diH2Oに40μLの微量体希釈を加え(1ウェルあたり20、10、5、2.5、1.25、0.68、0μgのミクロソームタンパク質が得られます)。
注:供給業者は通常、微粒体タンパク質の在庫濃度を提供します。そうでない場合は標準的なタンパク質定量法を用いることがありますが、本研究では適用していません。 - 各ウェルに新たに準備された基質混合物50μLを加え、不透水プラスチックシートでプレートを密封します。
- 96ウェルのプレートをシェーカーに置き、インキュベーター(37°C、850rpm)で2時間培養します。
- 孵化時間が終わったら、皿を氷にして反応を止めます。
- ステップ2.2に類似したイオン交換を行います。
- イオン交換ステップで得られた深層井戸から適切な量の試料を新しい96ウェルプレートに移し、希釈(50μL試料)、1:2(25μL試料+10%酢酸25μL)、1:4(12.5μL試料+37.5μL10%酢酸)の希釈を測定し、プレートレイアウトは変えません。
- セクション4で説明した結果を評価し、10%酢酸での試料の希釈係数と、サンデル・コルトフ反応で飽和度の上限に達しない最高ΔOD21min -BG値をもたらす微粒体タンパク質濃度を決定します。
注:通常、20μgのミクソームタンパク質の1:4または1:2酢酸希釈で、ΔOD21分>0.5のヨウ化物放出は容易に達成可能で、通常はΔOD21分の1前後です。高濃度の微粒体タンパク質は、アッセイ中の背景結合や非特異的結合を増加させるため推奨されません。結果を確認するために、測定されたマイクロソーム濃度と希釈係数を用いて6-PTU希釈系列の測定を再度行うことが推奨されます。
- 試験項目の溶解度評価
- 試験物質を適切な溶媒(例:DMSO)に室温で100 mMまたは200 mg/mLで溶解します。混合またはボルテックスで溶解を目視(顕微鏡)で確認してください。
- 溶かしていなければ、最大5分間ソニックで処理してから再度確認してください。まだ溶けていなければ、37°Cで最大60分加熱して再度確認してください。
- 不溶性の場合はさらに希釈するか、低濃度の新しいストックを準備して同じ手順を繰り返します。DMSOが適さない場合は、代替溶剤として水やエタノールを試してみてください。
- 溶解後、diH2O(溶媒10%)に1:10の希釈液を準備し、必要に応じて混合、超音波処理、加熱を繰り返します。
- アッセイ条件をシミュレートするために、アッセイバッファーで1%の試験物質を希釈し、溶解度の確認を繰り返します。
- 試験項目準備と距離測定
- 試験品のストック溶液は、ステップ1.8の溶解度評価時に決定された適切な溶媒(できればDMSO)で最高溶解濃度の溶液を準備します。
- 距離測定アッセイでは、ストック溶液とdiH2O中の10% DMSOを用いて、連続した1:10(v/v)希釈ステップで8つの試験項目を希釈します。
- セクション2で説明された手順を実行し、試験項目の阻害プロファイルを推定するためのレンジ測定アッセイを実施します。試験項目が任意の濃度で≥25%の阻害を示した場合、最終アッセイの濃度範囲を線形阻害範囲内の少なくとも3つの濃度と、該当する場合はIRA10%未満の濃度を2つ含めるように調整してください。
- テスト対象がすべての濃度で<25%の阻害を示した場合は、最終アッセイで同じ希釈シリーズを再利用してください。この場合、レンジ測定アッセイは3つの独立したアッセイランのうちの1つとしてカウントされることがあります。
注意:再現性と信頼性を確保するために、各試験項目に対して少なくとも2回、理想的には3回の独立した実験を実施してください。活性範囲をよりよくカバーするために別の希釈が選ばれる場合は、希釈比から逸脱することが許容されます。この試験戦略の25%のカットオフ(ステップ1.9.3および1.9.4参照)は、試験項目効果をネガティブコントロールと区別し、ベースライン活動の変動を考慮しつつ追加の安全マージンを提供します。この閾値により、抑制プロファイルの確実な分類が保証されます。
図1:ヨウ化物標準曲線のプレートレイアウト。 この図はヨウ化物標準曲線を生成するために用いられる96ウェルプレートの配置を示しています。井戸には1 nMから1,500 nMまでのヨウ化物の連続希釈と、diH2のOのみ制御が含まれています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図2:微粒体タンパク質滴定および参照品検査用のプレートレイアウト。 この図は、微粒体タンパク質滴定および参照阻害剤(6-PTU)検査のための96ウェルプレートレイアウトを示しています。6-PTUの有無にかかわらず、1ウェルあたりのマイクロソームタンパク質含有量は増加しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
2. DIO1–SKアッセイの実施
- テスト項目を用いたマイクロソーム培養
- ステップ1.2で説明された参照項目と、ステップ1.3および1.4で説明された正・陰の対照を準備します。ステップ1.8および1.9で説明されたプロトコルに従い、適切な濃度でテスト項目を準備します。
- 表1に記載された基質混合物を準備し、ステップ1.7に従ってあらかじめ定められたタンパク質濃度で、慎重に解凍し分離されたマイクロソーム溶液をdiH2Oに希釈して作製します。マイクロソーム懸濁液は培養が必要になるまで氷上に保管します。
- 図3および図4のプレートレイアウトに従い(複数の試験項目が同時に評価された場合)、参照品目濃度、正負対照、溶媒制御(diH2O中の溶媒10%(v/v)、および試験項目の濃度を井戸に追加します。
- すべてのウェルに40μLのマイクロソーム懸濁液を加えます。新たに調製した基質混合物を50μL加えます。
- プレートを不透水のプラスチックシートで密封し、インキュベーター(37°C、850rpm)でシェーカーに2時間置きます。孵化後は皿を氷に置いて反応を止めます。
- 孵化後は皿を氷に置いて反応を止めます。
注:試料の完全性を保つため、プレートは測定まで氷上に保管することができます。最初のアッセイプレートには8つの基準値が含まれており、同じ日に追加される各プレートには基準値の最高濃度のみが含まれるため、必要に応じて追加の検査項目のためのスペースが確保されます。
- イオン交換樹脂充填96ウェルフィルタープレートによる分離
- ステップ1.5で準備したように、準備済みのイオン交換樹脂充填96ウェルフィルタープレートを96深ウェルプレートの上に置き、イオン交換樹脂充填96ウェルフィルタープレートの各ウェルに10%酢酸150μLを加えて、カラム内の樹脂を湿らせます。
- 酢酸は、使用済みの96深ウェル板に100〜200 g の×を遠心分離機で1分間浸し、スイングアウトローター(マイクロタイタープレート用)で除去します。
- 使用済みの96深ウェルプレートを 新しい 96深ウェルプレートに交換してください。
- ステップ2.1.6の96ウェルプレートの各ウェルに133μLの10%酢酸を加え、プレートを軽く振って溶液を混ぜます。
- 前段階で準備したサンプルの175μLをイオン交換樹脂充填の96ウェルフィルタープレートに移し、初期のプレートレイアウトを維持します。
- サンプルを樹脂を通し、100〜200 g×遠心分離機で遠心分離し、マイクロタイタープレート用のスイングアウトローターを1分間処理します。イオン交換樹脂充填の96ウェルフィルタープレートを取り外します。
注:96深の井戸板にはサンプルが入っており、不透水プラスチックシートで密封し、4°Cで少なくとも3か月間保存できます。これにより、手動や技術的ミスやサンデル・コルトフ反応や測定における希釈因子の変化があった場合に追加の測定が可能になります。
- サンデル・コルトフ反応
- 使用されたマイクロソームバッチの10%酢酸中のサンプルの希釈率に応じて(ステップ1.7参照)、希釈されていないまたは適切に希釈されたサンプル50μLを新しい96ウェルプレートに加えます。
- すべての井戸に40 mMのセリウム溶液( 表1に記載された方法で調製)を50 μL加え、反応を開始します。すべての井戸に25 mMのヒ素溶液( 表1に示した方法で調製)を50 μL加えます。
- ヒ素溶液を加えた後、できるだけ早くプレートリーダーを使って415 nm(±2 nm)で吸収を測定し、21分間1分ごとに光学密度(OD)を記録し、初期ODも記録します。
図3:2つの試験項目の並行試験用のプレートレイアウト。 複数の濃度で3つの試験項目を3つずつ検査し、陰性、陽性、溶媒対照、参照項目の複製を含む96ウェルプレートレイアウト。その日の最初のアッセイプレートとして使用されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図4:3つの試験項目の並行試験用のプレートレイアウト。 96ウェルプレートレイアウト:3つの試験項目を複数濃度で三重に検査し、陰性、陽性、溶媒対照群の複製を含みます。参照品は最初のプレートで完全に検査されているため、最高濃度のみ含まれています(図3参照)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
3. 干渉の検査(±マイクロソームおよび±DTT)
- ステップ1.2で説明された基準品物(6 PTU)の最高濃度(RI C8)を準備し、試験品のストック溶液と希釈液(最高濃度を含む)を準備します。
- ミクロソーム懸濁液は、1.7段階の定義濃度で、慎重に解凍し分離されたマイクロソームをdiH2Oで希釈して準備します。使用までは氷上に保管してください。
- 2種類の基板混合物を準備します。表 1に記載されている標準的なDTT付き基板混合物と、DTTなし(DTTのみは省略)の同一基質混合物です。
- 図5に従い、96ウェルプレートの指定ウェルにディスペンスします:RI C8 10 μL、diH2O(溶媒制御)の10 μL 10%(v/v)DMSO、各試験項目希釈10 μL。
- 図5によると、「微小体付き」と指定されたウェルに40 μLのマイクロソーム懸濁液を、図5に示す「ミクロソームなし」と指定されたウェルに40 μLのdiH2Oを添加します。
- 氷上では、「DTT付き」と指定された井戸にDTTを含む基質混合物50μLを追加し、「DTTなし」と指定された井戸にはDTTなしの基質混合物を50μL追加します(図5)。
- プレートを不透水のプラスチックシートで密封し、インキュベーター(37°C、850rpm)のシェーカーで2時間培養します。
- 培養後、皿を氷に置いて反応を止めます。
- ステップ2.2および2.3で説明された通り、SK反応によるイオン交換分離およびヨウ化物定量を行い、セクション4で説明した結果を評価します。
注:この単一プレートセットアップ(図5)は、マイクロソーム有無およびDTTと並行して最高濃度を測定し、酵素的DIO1活性とアッセイの人工物を区別します。マイクロソームを含まない井戸でIRAが増加した場合≥20%はSK干渉(ヨウ化物放出/表示値がDIO1に依存しない)を示し、この物質は「DIO1 SKアッセイに適用されない」と分類され、解析から除外されます。DTT有無の条件の違いは、DTT依存性ヨウ化物放出を追加の干渉メカニズムとして特定するのに役立ちます。
図5:干渉試験用のプレートレイアウト。 この図は干渉試験のための96ウェルプレートレイアウトを示しており、試験項目、基準項目、溶媒制御が、DTTの存在下およびマイクロソームなしおよびDTTなしの両面でテストされます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
4. データ評価
- DIO1活性の評価
- ΔOD21分 値は、すべてのサンプルの21分値を初期測定(0分)値から差し引いて求めます。
- すべてのサンプルのΔOD-21分値から、阻害された10個の3 M 6-PTU(RI)対照群のΔOD21min値の平均を引いてΔOD-BG値を求出します。
- 試験項目の値を、各溶媒制御値(TI)をそれぞれの溶媒制御(SC)のΔOD21min -BGSC値の平均で割って正規化し、ヨウ化物放出活性(IRA)値を%単位で生成します。
- 統計ソフトウェアパッケージ内で、検査項目の異なる濃度のIRA値をプロットし、IRA値はy軸(線形)、テスト項目濃度はx軸(対数)に配置します。
- 曲線適合アルゴリズムを使って、選ばれる統計ソフトウェアで濃度と反応の関係(例:「[阻害剤]対反応――変数傾き(4つのパラメータ)」)を可視化します。「トップ」は最大応答を表し、「ボトム」は最も低い応答、「ヒルスロープ」は曲線の急勾配を表します:
- 参照項目のIC 50と、該当する場合は試験項目のIC50 を決定します。
- 参照項目のlog IC50 推定の分散係数(CV)を%単位で計算します:
- 溶媒コントロールに正規化された陰性コントロールのIRAを%で計算します。
- 溶媒コントロールに正規化された陽性コントロールのIRAを%で計算します:
- z'因子を計算します:
- 実験の妥当性を確認するために、計算値を 表4の受け入れ基準と比較してください。
注意:有効なアッセイランを得るにはすべての基準を満たす必要があります。 - 最大阻害量およびIC50 値( 表5にまとめた通り)に基づき、検査項目を完全阻害剤、部分阻害剤、非阻害剤に分類します。
- ΔOD21分 値は、すべてのサンプルの21分値を初期測定(0分)値から差し引いて求めます。
結果
図6 はDIO1-SKアッセイのワークフローの概要と、実験室でこの手法を成功裏に確立するために必要な主要な標準化ステップを示しています。ワークフロー(図6A)は、ヒト肝マイクロソームの使用、試験項目および対照群を用いた培養、イオン交換分離によるヨウ化物抽出、Sandell–Kolthoff(SK)反応を用いた比色ヨウ化物定量を含む、アッセイの連続フェーズをまとめています。 図6B は、(i) SK反応の標準化、(ii) バッチ特異的マイクロソーム活性試験、(iii) 溶解度評価および干渉試験、(iv) レンジファインディングアッセイ、(v) 最初の有効なアッセイ実行に基づく試験項目濃度の調整など、堅牢な性能と有効な結果を支える標準化戦略を示しています。
この戦略の中心的な要素はバッチごとのミクロソーム活性試験であり、ヒト肝臓マイクロソームのバッチはrT3脱ヨウ素化活性に大きく異なり、通常の物質検査前に各バッチに適した酵素濃度を決定する必要があります。
この段階的試験戦略は実装に不可欠です。アッセイの基準性能(対照群、SK反応挙動、マイクロソーム活性)が検証され、アッセイ条件が標準化されて初めて、物質試験は有効で解釈可能な阻害プロファイルを得られることが期待されます。
図6:DIO1 SKアッセイのワークフローと標準化ステップ。(A) ワークフローは、ヒト肝マイクロソームの使用、96ウェルプレートの設置、試験項目および対照群を用いた培養、ヨウ化物抽出、SK反応による比色定量を示しています。各ステップは順番に示され、アッセイの主要な段階を強調します。(B) 標準化のステップには、サンデル・コルトフ反応の標準化、バッチ特異的マイクロソーム活性試験、溶解度評価および干渉試験、レンジ測定アッセイ、初回有効なアッセイ実行に基づく試験項目濃度の調整が含まれます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図6に示されたワークフローと標準化フレームワークを基に、図7は研究室が適切な微粒体タンパク質濃度(およびイオン交換後の希釈)を決定し、参照阻害剤のシグモーイド阻害応答を維持しつつ十分なダイナミックレンジを達成する方法を示しています。図7Aでは、ΔOD21min-BGは微粒体タンパク質の増加とともに増加し、イオン交換後の希釈(希釈なし、1:2、1:4)に依存します。シグモイド応答を維持しつつ最も高いΔOD21min-BGを得る希釈が後続の実験で選ばれます(例:1:2希釈)。図7Bでは、6-PTU阻害曲線を微粒体タンパク質量で比較し、シグモイド曲線を生じる最低タンパク質濃度を特定しています(例:5μgタンパク質/ウェル)。これにより感度と背景のバランスが取られています。
重要なのは、この最適化ステップは各研究所が実施しなければならない点です。なぜなら、必要なタンパク質濃度は使用されたマイクロソームバッチの活性に依存し、酵素濃度のバッチごとの標準化が必要だからです。
図7:6-PTUによる微粒体活性と阻害。(A) グラフは、希釈なし、1:2、1:4希釈で検証された1:2および1:4希釈で検証された、1ウェルあたりの微粒体タンパク質量増加(ΔOD21分n-BG)による(BG)補正後の活性増加を示しています。最も希釈され、ΔODが21分–のBG値が高く、かつシグモイド形状のものが今後の実験に使用されます。この場合、それは1:2の希釈です。(B) 異なる微粒体タンパク質ロード(5、7.5、10 μgタンパク質/ウェル)で、ヨウ化物放出活性(IRAを%単位で示す)6-プロピル-2-チオウラシル(6-PTU)の濃度-応答曲線をlog10[濃度(M)] に対してプロットしたもの。IRA値は溶媒制御に正規化されます。両グラフのデータポイントは、代表的なマイクロソーム活性テストから各条件につき3回の技術的重複(ウェル)の平均標準差(±SD)を表しています。曲線は4パラメータロジスティック(「可変傾き」)モデル(阻害剤対応答)を用いた非線形回帰でフィッティングされました。シグモイド曲線を持つ最小タンパク質濃度が今後の実験に使用されます。この場合、5μg/wellです。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
ワークフローと標準化ステップ(図6)が完了し、選択したマイクロソームバッチに適した微粒体タンパク質濃度が確立されると(図7)、コアアッセイパラメータが整い、通常の物質検査に進みます。この段階では、試験項目をプレートコントロールセット(参照項目、溶媒対照、正負対照)と並べて標準化されたプレート形式で評価でき、堅牢な正規化と阻害プロファイルの一貫した解釈を可能にします。
図8 は、ヨウ化物放出活性(IRA)における濃度反応挙動に基づくアッセイ識別を示しています。参照阻害剤6-PTU(図8A)は、濃度依存的なIRAの低下を示し、アッセイ性能検証に期待されるシグモイド阻害プロファイルを提供します。タンニン酸(図8B)は、示された条件下で基準阻害剤と同等の阻害プロファイルを示し(最大阻害率>90%)。試験物質の最高濃度3件ではIRA値が陰性でした。IRA値<0%は生物学的に意味のある「負のヨウ化物放出」を反映するものではなく、計算手順(背景減算と溶媒制御への正規化)によって生じ、溶媒制御の小さな変動を負の正規化値に変えることがあります。したがって、IRAの値が0%未満の場合は、結果解釈において0%(基準値)と同等とみなされます。ジブチルフタル酸イオン(図8C)は、試験された濃度範囲全体で阻害(最大阻害が25%未満)を示しず、非阻害剤プロファイルを示します。これらのプロファイルを合わせることで、標準化された条件下で抑制性と非抑制性の行動を区別できることが示されています。また、この試験システムは部分阻害剤を識別でき、最大阻害レベルが25%から90%の間で示されます(データは示されていません)。これらの分類方法については表 5に詳細が記載されています。
図8:DIO1–SKアッセイの用量反応挙動は阻害剤と非阻害剤を区別する。 用量反応曲線は、(A)参照阻害剤6-PTU、(B)代表的な阻害剤(タンニン酸)、(C)代表的な非阻害剤(ジブチルフタル酸)のlog10濃度(M)に対してヨウ化物放出活性(IRAを%単位で)プロットしたことを示しています。IRA値は背景差し引き後に計算され、溶媒制御に正規化されました。記号は1つの独立した実験からの平均 ± SD(n = 3)を表し、各実験ごとに3回の技術的再現(井戸)を用いて実施されます。曲線は4パラメータロジスティック(「可変傾き」)モデル(阻害剤対応答)を用いた非線形回帰でフィッティングされました。IRA値が0%未満の場合は、結果解釈において0%(基準値)と同等とみなされます。これらのデータは、アッセイが参照阻害剤のシグモイド阻害プロファイルを示し、標準化された条件下で濃度応答曲線が阻害性か非阻害性かを確認できることを示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
有効なアッセイランでは、溶媒制御(SC)が完全に抑制された基準条件(6-PTU、RI-C8)から21分 のΔODシグナル分離が明確に示されます。例のデータセット(10回の独立ラン)では、各プレートにはSCおよび完全抑制参照(10−3 Mでの6-PTU)の技術的重複がn=9回含まれていました。プレート全体で、プレート平均SC ΔOD21分 値は1.383から1.819(平均±SD:1.565±0.114)の範囲でした。一方、阻害状態の6-PTU状態のプレート平均ΔOD21分 値は0.258から0.771(平均±SD:0.473±0.087)でした。このアッセイでのΔODの計算はOD0min とOD21minの差に基づいており、アッセイの有効性は一般的にz′因子閾値>0.5によって支持されます。
10回の独立したアッセイランで、6-PTUはIC50 値が1.20E-06 Mから5.02E-06 M(平均±差:2.74E-06 M ±1.13E-06 M)のシグモイド濃度応答曲線を生成しました。1.00E-06から1.00E-05の基準範囲におけるIC50 値の受け入れ基準は、過去の検証研究のデータに基づいています。しかし、IC50 値は使用される特定のマイクロソームバッチによって大きく影響を受け、かなりの変動を示すことがあります。それでも、これらの変動は同じ桁違いの範囲内にとどまると予想されます。
アッセイ品質はz′因子を用いて要約でき、これは信号ウィンドウとコントロールの変動性の両方を反映しています。記載されたデータセットでは、6つの参照曲線が0.544から0.774(平均±標準差0.658±0.062)のz′因子に関連付けられており、一般的に用いられる受容目標のz′>0.5と一致しています。
実際には、最適でないランはアッセイバックグラウンドの逸脱や、あらかじめ定められた受け入れ基準の不履行によって識別されます。例えば、サンデル・コルトホフ反応における高いバックグラウンドは、純粋なdiH₂OブランクのΔOD >0.3を示し、検査が必要であることを示します(例:試薬汚染や水質問題)。このような背景増加はアッセイのダイナミックレンジを減少させ、制御の変動性を高めるため、z′因子が0.5未満になるなど、受け入れ基準の失敗に寄与します。明らかな技術的異常(例:沈殿や異常な変色)を示す井戸は、評価の外れ値として除外されます。ボックスプロットの外れ値検定によって決定された外れ値も除外します。外れ値除去後に受理基準を満たさない場合、アッセイランは無効とみなされ、再実施が必要です。
| 試薬/バッファー | 準備情報 |
| 酸性アンモニウムセリウム溶液(40 mM (NH4)4Ce(SO4)4×2H2O、0.5 M H2SO4)(250 mL) | 250 mLのボリュームフラスコに6.32 gの(NH4)4Ce(SO4)4*2H2Oと125 mLのDiH2Oを加えます。125 mL 1 M H2SO4を加え、最終体積250 mLにします。室温で最大6ヶ月保存してください。 |
| DTT(1 Mのアリコート) | 準備または供給された1 M DTT溶液を水2Oに0.5 mLのアリコートとして1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに入れ、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。 |
| HEPES(50 mM)/EDTA(2.16 mM)バッファー(pH 7.0) | 250 mLの容量フラスコを使い、12.5 mL 1 M HEPES溶液、201 mgのエチレンジアミネテトラアセティック酸(EDTA)を加え、最大250 mLまで二氫酸(diH2O)を充填します。4°Cで最大3ヶ月保存してください。 |
| rT3溶液(「基質ミックスチューブ」) | rT3をDMSOに溶解して最終濃度6 mMにし、15 mL遠心分離機チューブで10 μLの分量に分割し、-20°Cで最大6か月間保存します。 |
| ナトリウムヒ素溶液(25 mM NaAsO2、0.8 M NaCl、0.5 M H2SO4)(250 ml) | 250 mLの容量フラスコに、NaAsO2 0.81g、NaCl 11.7 g、DiH2O 125 mLを加えます。125 mL 1 M H2SO4を加え、最終体積250 mLにします。室温で最大6ヶ月保存してください。 |
表1:バッファーおよび試薬の調製。 この表は、HEPES/EDTAバッファー、DTT、rT3溶液、酸性アンモニウムセリウム溶液、ヒ素ナトリウム溶液を含む、DIO1 SKアッセイで使用されるすべてのバッファーおよびストック溶液の調製手順と保存手順を詳述しています。
| 参照項目希釈の名称 | 参照項目希釈濃度[M] | 10% DMSO [μL] | 参考文献 | アッセイにおける基準値の最終濃度 [M] |
| RI-C8 | 1.00E-02 | 450 | 10-1Mの基準品50 μL ストック溶液 | 1.00E-03 |
| RI-C7 | 1.00E-03 | 450 | 50μLのRI-C8 | 1.00E-04 |
| RI-C6 | 1.00E-04 | 450 | 50μLのRI-C7 | 1.00E-05 |
| RI-C5 | 3.16E-05 | 342 | 158μLのRI-C6 | 3.16E-06 |
| RI-C4 | 1.00E-05 | 450 | 50μLのRI-C6 | 1.00E-06 |
| RI-C3 | 3.16E-06 | 450 | 50μLのRI-C5 | 3.16E-07 |
| RI-C2 | 1.00E-06 | 450 | 50μLのRI-C4 | 1.00E-07 |
| RI-C1 | 1.00E-07 | 450 | 50 μL のRI-C2 | 1.00E-08 |
表2:参照項目希釈の調製。 この表は、参照項目(6-PTU)の連続希釈の調製過程をまとめており、濃度、DMSOの体積、最終濃度を含みます。
| ミクロソームは1井あたり[μg] | diH2O [μL] | 微量体希釈[μL] | アッセイ中の最終酵素濃度[μg/mL] |
| 20 | 780 | 20 μL 20 mg/mL マイクロソームのストック溶液 | 200 |
| 10 | 400 | 20μgマイクロソーム400μLをウェル希釈ごとに | 100 |
| 5 | 400 | 1ウェル希釈あたり400μLの10μgマイクロソーム | 50 |
| 2.5 | 400 | 5μgマイクロソーム400μLを1ウェル希釈ごとに | 25 |
| 1.25 | 400 | 2.5μgマイクロソーム400μLを1ウェル希釈につく | 12.5 |
| 0.68 | 400 | 1ウェル希釈あたり400μLの1.25μgマイクロソーム | 6.8 |
表3:マイクロソーム希釈の調製。 この表は、最終的なアッセイの微粒体タンパク質濃度を達成するために必要なdiH₂Oおよびマイクロソームストック溶液の量を含む、1ウェルあたりの微粒体タンパク質希釈スキームを示しています。
| 受け入れ基準 | 推奨カットオフ値 |
| 数値 | |
| 参照項目[M]のIC50 | 1*10-05 - 1*10-06 |
| ログのCV IC50 参照項目推定 [%] | < 3 |
| IRAネガティブコントロール [%] | 80 - 120 |
| IRAポジティブコントロール [%] | < 20 |
| z'ファクター | > 0.5 |
| バイナリ | |
| 基準項目の形状(シグモイド型?) | はい |
| 参照項目の最終的な濃度-応答曲線は、3回の重複から最低6つの濃度で構成されます | はい |
| テスト項目の最終的な濃度-応答曲線は、3回の重複から最低6回の濃度で構成されます | はい |
表4:DIO1 SKアッセイの受容基準。この表は、IC₅₀の範囲、変動係数、制御のIRA値、z'因子、濃度応答曲線の要件など、アッセイ有効性の受け入れ基準を一覧にしています。受容ウィンドウは、以前に報告されたDIO1-SK検証研究6から導き出され、5つの独立した実行に基づく再現性評価も含まれ、参照IC₅₀ウィンドウを決定しました。10回の独立実行の例のデータセットでは、z′ファクター性能は0.544から0.774(平均±標準差:0.658±0.062)の範囲で、ここで用いるz′受容閾値を支持しています。
| カテゴリー(効力による) | サブカテゴリ(効力による) | 阻害活性 | しきい値 |
| カテゴリー1:完全阻害剤 | A: 強力なフルインヒビター | 参照項目6-PTUと同等の濃度でDIO1活性を完全に阻害します | 最大阻害は6-PTUの上限IC50以下で90%以上、IC50は上位範囲IC50以下です |
| B:弱いフルインヒビター | 参照項目6-PTUよりも高濃度ではDIO1活性を完全に阻害します | 最大阻害率は90%以上、IC50は6-PTUの上位範囲IC50を上回ります | |
| カテゴリー2:部分阻害剤 | - | 完全な抑制はありませんが、負の抑制や溶媒制御以上の効果があります | 最大抑制値は25%から90%の間です |
| カテゴリー3:阻害剤でない | - | DIO1を阻害しない(負および溶媒制御と同じ) | 最大抑制は25%未満 |
表5:DIO1阻害効果および有効性に基づく試験項目の分類。 試験項目は、DIO1活性の最大阻害力に基づいて、完全、部分、非阻害薬の3つの有効性グループに分類されます。完全な阻害剤は、IC₅₀(基準項目6-PTU)に対する有効性によってさらに細分分類されます。
ディスカッション
DIO1-SKアッセイは、放射性標識アッセイや質量分析法などの従来のDIO1活性評価方法に代わる非放射性でコスト効率が高く、スケーラブルな代替手段を提供します。ヒト肝臓マイクロソームの事前検証と、甲状腺ホルモンレベルのSPE-LC-MS/MS測定との強い整合性は、その信頼性と規制上の関連性を裏付けており、OECD検査ガイドライン作業計画に含まれていることからも明らかです。サンデル・コルトフ(SK)反応の簡便さにより、高度な機器がなくても実験室でも利用可能です。
本プロトコルでは、従来のDIO1-SK手順と比較して、ルーチンな96ウェル形式での堅牢性と再現性をさらに強化するために、いくつかの実用的側面がより詳細に規定されています。これらの説明は、制御概念(溶媒、負対照、正対照)の根拠、既に鋳造されたプレートを再利用するのではなく新たに準備されたイオン交換樹脂板を使用する決定、そして多層ウェルプレート測定における取り扱いの堅牢性を向上させるSK反応条件に焦点を当てており、生物学的解釈は以前の標準化作業と整合性を保つ6,7。
強みがあるにもかかわらず、DIO1媒介によるrT3からT2への変換時に放出されるヨウ化物を正確に定量化するためには、いくつかの重要なステップに取り組む必要があります。これはサンデル・コルトフ反応によって実現され、再現性を確保するために正確なタイミングと一貫した試薬取り扱いが必要です。SK反応は、ヨウ化物がヒ素によって黄色セリウム(IV)を無色セリウム(III)に還元する加速する急速触媒過程です。色の変化速度はヨウ化物濃度に比例します。ヒ素溶液を加えると反応が速く進行するため、測定を遅滞なく開始することが不可欠です。96井板形式では、ヒ素溶液の添加が遅いまたは不均一になると井戸間で大きな変動が生じる可能性があります。したがって、すべてのウェルで試薬の均一かつ迅速な添加を確保するために、マルチチャネルピペットや自動ディスペンサーの使用が強く推奨されます。
ウェル間およびプレート間での比較可能性を最大化するために、SK反応における試薬添加順序は記載されたワークフローと一貫して保つべきです。すなわち、クロモジェニック基質としてセリウムが存在し、反応はヒ素添加によって開始されるため、開始時間が定まるため、迅速かつ同期したディスペンシングが必要です。このセットアップでは代替試薬添加命令は評価されませんでした。したがって、プロトコルを再現する際に順序を変更することは推奨されません。さらに、セリウム濃度はSK表示の実用的な性能特性(例:信号ウィンドウや堅牢性)にも影響を及ぼします。25 mMセリウムは以前のアッセイ標準化時に検証済みの標準条件として定義されていましたが、40 mMのような高濃度濃度は、IC50 値や生物学的解釈に影響を与えることなくシグナルウィンドウとz′因子を増加させることが示されており、これは前述の研究6で既に述べられています。このプロトコルでは、40 mMセリウムを用いて、アッセイ条件下での完全かつ迅速なヨウ化物複合化を確保し、通常のプレートベース測定における堅牢性と信号安定性を向上させます。受容基準(例:z′因子、参照阻害剤のIC50 値)は、過去の検証研究で観察された過去の性能に基づいており、定期的なアッセイ性能チェックを意図しています。
ヒト肝マイクロソームの使用は生物学的変動をもたらし、ミクロソームのバッチ特異的ヨウ化物放出活性の標準化が不可欠となります。イオン交換樹脂充填フィルタープレートの慎重な準備が必要で、フィルタープレート全体に樹脂の不均一な分布を防ぎ、ヨウ化物が干渉物質から完全に分離されることを保証します。樹脂のワークフローに関しては、樹脂の飽和、ヨウ化物やタンパク質の残留による追加の変動リスクや再使用時の結合効率低下のリスクを最小限に抑えるために、新たに鋳造されたイオン交換樹脂充填フィルタープレートが選ばれました。樹脂やフィルタープレートの再利用は技術的には可能ですが、本研究で体系的に評価されていないリスクを抱えている可能性があります。樹脂結合能力が低下したり、前回のランで樹脂床に残留するマトリックス成分が残ると、バッチ間ドリフトが発生する可能性があります。リサイクルを検討している検査機関にとっては、実用的な推奨として、再利用後の樹脂性能を検証し(例:背景および標準曲線の挙動を監視し、ヨウ化物の一貫した捕捉を確保する)、背景の増加、ダイナミックレンジの低下、または分離の不均一が観察された場合は再利用を中止することです。このプロトコルは、その方法に基づいて特別に開発されたため、単回使用には樹脂充填のフィルタープレートを使用することが推奨されています。
さらに、各試験項目の溶解度は適切な載体で測定される必要があり、最大濃度は溶解度によって制限されます(通常1% DMSOで最大1 mMまで)。すべての試験化合物が溶媒としてDMSOに適用されるため、溶媒制御はアッセイ関連条件下でのベースラインDIO1活性を定義し、正規化および比較の最も適切な参照条件となります。これに対し、1-チオβ-D-グルコースナトリウム塩は、正対照のオーロチオグルコース(ATG)と構造的に類似しているものの、ヨードチロニン脱ヨウ化に関して化学的に不活性であり、微小体酸化還元系やDIO1触媒活性を妨げないため、陰性対照群として含まれました。この導入により、真のDIO1特異的効果と、化合物付加、取り扱い、またはアッセイマトリックス相互作用に関連する非特異的効果を区別することができます。無処理・無車両制御は、すべての化合物処理井戸でDMSOが存在する実際のアッセイ環境を反映しないため、主要な基準条件として使用されませんでした。したがって、溶媒制御はアッセイ解釈の基準となります。
トラブルシューティングはSK反応における干渉の特定に焦点を当てています。ヨウ素を含む、キレート作用のある、または強く酸化する物質は、比色計表示に人工的に影響を与えることがあります 14,17,18。これに対処するため、プロトコルにはミクロソームを使わない干渉検査が含まれています。さらに、補因子としてジチオスレイトール(DTT)を使用することで、特定の試験物質から非酵素性ヨウ化物が放出されることがあります。そのような場合、SPE-LC-MS/MSのような直交法がDIO1阻害の確認に推奨されます。一般的な変性効果(例:界面活性剤)による非特異的干渉は偽陽性を生むため、インシリコツールや統合テスト手法を用いた頻繁なヒット物を特定する一般的な戦略は有用です。
このアッセイにはいくつかの制限があります。これは、試験物質がアッセイ成分と反応したり、DIO1活性とは独立してヨウ化物を放出したりする干渉を受けやすいです。このアッセイでは、DIO1の特異的阻害と酵素機能や構造の完全性に対する非特異的干渉を区別しません。特異性を高めるために、追加の微粒体酵素の阻害を並行して解析し、異なる酵素アッセイ間で阻害性強力を比較することでさらなる証拠が得られる可能性があります。
アーティファクトを特定するためのさらなる戦略として、細胞ベースの in vitro アッセイで一般的に行われる完全性試験や生存可能性試験を取り入れ、最大検査濃度を定義する方法があります。DIO1-SKアッセイには直接的な完全性試験がありませんが、 in vitro 試験バッテリー内での使用により、他の細胞ベースのアッセイからの細胞毒性データを統合し、濃度選択に役立てることができます。そのようなクロスアッセイ情報が得られない場合、DIO1-SKアッセイの上位濃度は溶解度によって制限され、関連する生体内曝露を反映しない場合があります。しかし、トキシコキネティック手法により、in vitro検査の濃度をより正確に定義・解釈することができます。
DIO1-SKアッセイは、毒物学的スクリーニングおよび内分泌撹乱の機構的研究において特に価値があります。甲状腺ホルモン恒常性における重要な出来事に対応し、体外検査のバッテリーに統合可能です。その堅牢性、再現性、そして異なる実験室環境やスループットのニーズに適応できる点から、化学物質の安全性評価や規制検証において貴重なツールとなっています。このアッセイは標準化された条件下でのDIO1阻害の堅牢なin vitro測定を提供し、よく特徴づけられた参照阻害剤(6-PTU)と比較して試験物質の分類を支援します。しかし、DIO1阻害に関するin vivoデータは乏しく、in vitro DIO1阻害とin vivo効果の直接的な相関は現時点でin vivo予測性の推定には適用できません。したがって、アッセイ結果は甲状腺ホルモン代謝における主要なイベントの一つの妨害の機構的証拠として解釈され、必要に応じて他の甲状腺MoAアッセイや直交測定などの追加の証拠と統合されるべきです。重要なのは、DIO1–SKアッセイが複数の検証志向の研究(最適化/標準化、予測性評価、ロバストネス/正確性分析)で評価されており、OECD導入に向けた手法の進展に伴い、本記事は追加の研究室間での移転と一貫した実装を促進するための段階的な手順の詳細を提供している点である。
開示事項
著者のK.S.、N.H.、D.F.-W.、R.L.は化学企業BASF SEの従業員であり、将来的にDIO1アッセイを商業製品の開発・登録に活用する可能性があります。
謝辞
著者らは、DIO1-SKアッセイの初期確立におけるアンドレアス・ウェーバー博士の働きに感謝の意を表します。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1-チオ&ベータ;-D-グルコースナトリウム塩 | シグマ・オルドリッチ | T6375-1G | CAS 10593-29-0 |
| 3,3',5'-トリイオドチロニン(rT3) | サンタクルーズ・バイオテクノロジー | SC-209692 | CAS 5817-39-0 |
| 6-プロピル-2-チオウラシル(6PTU) | スペルコ | P3755-10G | CAS 51-52-5 |
| 酢酸 | サーモ・フィッシャー | 9526-33 | CAS 64-19-7 |
| 分析的均衡 | NA | NA | 0.1mgの可読性で最大30gまで正確に重く機能します |
| ヒ素酸化ナトリウム(NaAsO2) | サーモ・フィッシャー | 041533.AP | CAS 7784-46-5 |
| アッセイプレート(96ウェルフォーマット) | メルク | Z707902-108EA | 例:組織培養プレート、96ウェルプレート、フラットボトム、ポリスチレン、0.34 cm2、無菌、108/cs、TPP |
| オーロチオグルコース(ATG) | シグマ・オルドリッチ | A0606-5MG | CAS 12192-57-3 |
| 遠心分離機チューブ15および50 mL | メルク | Z707724-800EA、Z707716-320EA | 例:TPP遠心分離機チューブ、容量15および50 mL、ポリプロピレン、およびnbsp; |
| マイクロタイタープレート用のスイングアウトローターを持つ遠心分離機 | NA | NA | 高さは96深ウェルプレートと、その上に96インチのフィルタープレート(少なくとも約6cmの高さ)を取り付けるのに十分な高さであるべきです。 |
| セリウム(IV)硫酸アンモニウム(Ce(NH4)4(SO4)4) | シグマ・オルドリッチ | 22269-100G-F | CAS 10378-47-9 |
| CO2インキュベーター | NA | NA | 37度の温度を維持可能;C、5%のCO2およびその他;湿度90% |
| ディープウェルプレート(96ウェル形式) | スペルコ | 575653-U | 例:SPE 96-深み四角井戸集積板、井戸容量2 mL、ポリプロピレン |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | AppliChem | A3672,0250 | CAS 67-68-5 |
| ジチオスレイトール(DTT) | シグマ・オルドリッチ | D9779-1G | CAS 3483-12-3 |
| エチレンジアミネテトラアセティック酸(EDTA)およびnbsp; | シグマ・オルドリッチ | APO456787707-500G | CAS 6381-92-6 |
| フィルタープレート(96ウェルフォーマット) | メルク | WHA77002810 | 例:マイクロプレート、96ウェル、透明ポリスチレン、800およびマイクロ;L、DNA結合、ワットマン |
| ガス密閉プレートシーラー | サーモ・フィッシャー | 232698 | 例:シーリングテープ、ポリエステル、滅菌テープ、ポリエステル、滅菌、Nunc |
| ヘペス | パン・バイオテック | P05-01100 | CAS 7365-45-9 |
| ヒト肝臓マイクロソーム | バイオビット | X008070 | 例:INVITROCYP 150-ドナープールされたヒト肝臓マイクロソーム |
| ヨウ化物(IC規格) | スペルコ | 41271-100ML | 例:IC用のヨウ化物標準、水に1000 mg/L、シグマ・オルドリッチ |
| Dowex 50WX2のようなイオン交換樹脂 | ロス | 334.4 | CAS 12612-37-2;メッシュ100-200 |
| マイクロ遠心分離機チューブ1.5 mL | メルク | EP0030120086-1PAK | 例:エッペンドルフ&レグ;セーフロックマイクロ遠心分離機チューブ、容量1.5mL、天然製 |
| マルチチャンネルディスペンサーは50から300まで供給可能です。µ1歩あたりLです | NA | NA | NA |
| 10から100まで供給可能なマルチチャネルピペット;µ1歩あたりLです | NA | NA | NA |
| pHメーターと電極および校正バッファー | NA | NA | +/- 0.1 pH単位を読み取ることができます |
| 吸収測定用のフォトメーター | テカン・トレーディングAG | NA | 例:サンライズ吸収リーダー、INSTSUN-3 |
| 1から10までを供給できるピペット;µL | NA | NA | NA |
| 10から100までを供給可能なピペット;µL | NA | NA | NA |
| 100から1000まで供給可能なピペット;µL | NA | NA | NA |
| 大容量用のピペット | NA | NA | 血清学的ピペット(例:10、25、50 mL) |
| プレートシェーカー | サーモ・フィッシャー | NA | 例:サーモサイエンティフィックH+Pモノシェイク渦分板マイクロタイタープレート、直接制御 |
| リピーターピペット | NA | NA | NA |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | シグマ・オルドリッチ | S9888-25G | CAS: 7647-14-5、例:塩化ナトリウム、ACS試薬など;99.0 % |
| 統計ソフトウェア | NA | NA | アッセイ特性を反映した回帰解析を行い、阻害濃度の計算も可能(例:GraphPad Prims 8、GraphPad |
| 硫酸(H2SO4)およびnbsp; | スペルコ | 1007311000 | CAS 7664-93-9 |
| ボリューメトリックフラスコ | NA | NA | 定体積認証 |
参考文献
- Kabir, E. R., Rahman, M. S., Rahman, I. A review on endocrine disruptors and their possible impacts on human health. Environ Toxicol Pharmacol. 40 (1), 241-258 (2015).
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