方法論記事

関節リウマチ患者からの原発線維芽細胞様滑膜細胞の単離および同定

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DOI：

10.3791/70116

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2026年2月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

この記事について

サマリー

本プロトコルは、リウマチ性関節炎患者の滑膜組織から高純度の一次線維芽細胞様滑膜球(FLS)を単離し、信頼性の高い疾患モデリングおよび薬物スクリーニングを行う方法を説明しています。

要約

関節リウマチ(RA)は、滑膜過形成と進行性関節破壊を主な病理学的特徴とする慢性自己免疫性炎症性疾患です。線維芽細胞様滑球(FLS)はRAの病因における重要な細胞構成要素として認識されており、その攻撃的で腫瘍様な行動が軟骨や骨の破壊を媒介する特徴があります。関節リウマチ性線維芽細胞様滑球(RA-FLS)の単離および精製は、疾患のメカニズムの調査や治療薬の評価において重要なツールです。ここでは、関節リウマ症患者の膝関節置換術で採取された切除された滑膜組織サンプルから、原発ヒトRA-FLSを分離、培養、機能的に検証するための包括的なプロトコルを提示します。この方法は新鮮な滑膜組織を利用し、トリプシンおよびコラーゲンナーゼII型を用いた逐次酵素的消化プロセスを用いて、組織マトリックスからRA-FLSの分離を最大化します。最後に、ビメンチン免疫蛍光法とフローサイトメトリーを用いて細胞同定を行い、TNF α誘発増殖の機能的評価を補完します。このプロトコルにより、特定の表現型特性と炎症応答性を持つ高純度のRA-FLS培養を取得でき、薬物スクリーニング、機構研究、組織工学的応用に適した短期培養患者由来のRA-FLSを信頼性の高い方法で取得できます。

概要

関節リウマチ(RA)は、末梢関節の対称性多発性関節炎を特徴とする慢性自己免疫炎症性疾患であり、世界的に推定有病率は0.5%〜1%であり、全身および関節外のさまざまな合併症を引き起こす可能性があります 1,2,3,4,5。RAの主要な病理的特徴は自己免疫反応を媒介する慢性滑膜炎であり、これがさらに浸潤性パンヌス組織の形成を引き起こし、関節軟骨および軟骨下骨を侵食します。その中で、滑膜炎はRAの最も初期かつ中心的な病理的特徴を示しています。線維芽細胞様滑液球(FLS)は滑膜の主要な居住細胞として存在し、滑膜炎症と骨破壊の両方を指揮する上で重要な役割を果たします。RAにおける滑膜炎症反応の際、リウマチ性関節炎線維芽細胞様滑膜球(RA-FLS)は通常の「調節的」表現型を失い、「炎症促進型」のプロファイルを示します10。この変化により炎症性サイトカインが大量に産生され、関連するエネルギー代謝経路を活性化して細胞増殖を促進し、滑膜炎症カスケード11,12,13をさらに増幅させる可能性があります。同時に、RA-FLSはマクロファージ、T細胞、B細胞など他の免疫細胞と相互作用し、持続的な慢性炎症状態を維持します(14,15)。さらに、RA-FLSはがん様の特徴を示し、移動能力の向上、侵襲性、制御不能な増殖、アポトーシス耐性などを示し、軟骨および骨の侵食過程にも積極的に関与しています16。

近年、FLSは関節リウマチなどの関節炎疾患の研究におけるin vitroモデルとして広く利用されており、これは現在の第一選択薬剤治療の限界に部分的に起因しています 17,18,19。これらは2D培養、3Dモデル、臓器オンチップシステムに用いられ、疾患メカニズムの調査、治療標的の検証、薬物スクリーニング20、21、22、23の実施に用いられます。さらに、RAFLSはDMARDsの応答を予測するための患者由来滑膜オルガノイドなど、高度な応用の基盤としても機能します。RAの進行における遺伝子機能を研究するためのCRISPR/Cas9による遺伝子編集;また、機能的滑膜組織移植片の工学的細胞源として24、25、26を活用しています。

リウマチ患者の滑膜組織から短期培養RA-FLSを得ることは、多くの実験の初期段階となります。FLS細胞株と比較して、短期培養された患者由来のRA-FLSは患者間異質性や疾患特異的特性を保持し、疾患関連転写因子や経路調節の違いをより正確に表現することを可能にします。その結果、細胞の収率、成長速度、機能的パフォーマンスは、年齢、疾患期間、用薬歴、疾患活動など患者特有の要因によって影響を受け、バッチ間で一定のばらつきが生じます。したがって、研究者は使用前に組織源の臨床的背景を評価し、細胞の表現型安定性を維持するために初期通路(P3-P7)内で実験を行うべきです。

本研究は、膝滑膜組織からRA-FLSを抽出し同定するための簡潔なプロトコルを詳述しています。この方法は、連続的な酵素消化(トリプシンの後にタイプIIコラーゲン酵素)と穏やかな機械的解離を組み合わせて用いています。証拠によれば、このような最適化された多段階の酵素戦略は、単一酵素や非連続的な混合酵素治療よりも一般的に優れており、細胞の生存率や表現型を損なう可能性があります。比較すると、本プロトコルは高生存率・高純度のRA-FLSのより効率的かつ穏やかな分離を可能にし、細胞損傷や表現型喪失を最小限に抑え、下流の機能アッセイに適しています。

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プロトコル

本研究は、中国日友愛病院で関節置換手術を受けた関節リウマチ患者の滑膜組織を収集しました。すべての患者は手術前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。収集された情報と生物サンプルは、患者のプライバシーとデータセキュリティを確保するために厳格な措置のもとで取り扱われました。残った滑膜組織標本はバイオセーフティ規則に従って処分されました。本研究におけるリウマチ患者の膝関節滑膜組織の使用は、中日友好病院倫理委員会により承認されました(承認番号:2025-KY-223)。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 滑膜組織の取得と準備

注意:手術中に得られた滑液組織は、手術室からバイオセーフティキャビネットへの移送中の汚染を防ぐため、0.9%生理食塩水またはPBSを充填した滅菌容器に入れてください。エタノール浸漬後、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液で洗浄することは、細菌や真菌による汚染を防ぐ重要なステップであり、その後の実験の成功を保証します。

  1. 新鮮な滑膜組織をPBSを含む50mL遠心分離機チューブに浸し、バイオセーフティキャビネットに移します。
  2. 滑液組織を75%エタノール入りのペトリ皿に移し、30秒浸して消毒します。
  3. 無菌の外科用ハサミと鉗子を使って滑膜組織から脂肪と骨組織を除去し、残った組織を新しい培養皿に移します。
  4. 得られた滑膜組織を10%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むPBSで3回洗浄します。

2. 滑膜組織の消化

注意:トリプシンを用いて滑膜組織内の細胞接合部や細胞外マトリックスを破壊し、その後の分離を行います。タイプIIコラーゲンを適用して細胞外マトリックス構造を選択的に分解し、細胞がマトリックスから解離しやすくします。滑膜組織剥離に必要な外科用はさみ、鉗子、細胞ストレーナーは使用前にオートクレーブ消毒してください。消化後、組織の断片は緩み、ほつれた縁を帯び、培地がやや濁った状態になることがあります。消化されていない組織は、緻密で不透明なままです。

  1. 組織をハサミで繰り返し1mm×1mmの断片に刻みます。
  2. 組織に0.25%のトリプシンを加え、37°Cの定温シェイカー(100〜150rpm)または細胞培養盤で30分間消化します。
  3. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて10%胎児用牛血清(FBS)溶液を準備します。
  4. 組織を15mLまたは50mLの遠心分離機チューブに移し、10%胎児用牛血清(FBS)を含むPBSで中和・消化します。
  5. 遠心分離機(4°C、500 × g、5分)、その後上清液を捨て、ペレットを保持します。
  6. ペレットをPBSで再懸浮させてください。
  7. 遠心分離機(4°C、500 × g、5分)、その後上清液を捨て、ペレットを保持します。
  8. 50mLのDMEM培地に100mgのタイプIIコラーゲン酵素を加え、2 mg/mLのタイプIIコラーゲンゼ溶液を準備します。
  9. 準備済みのタイプIIコラーゲンナーゼ溶液を0.22μmの膜に通して滅菌します。
  10. 2 mg/mLのタイプIIコラーゲン酵素を加え、37°Cの定温シェイカー(100-150 rpm)または細胞培養箱で4時間消化します。

3. 線維芽細胞様滑膜球の単離および培養

注意:すべての細胞培養手順はバイオセーフティキャビネット上で無菌条件下で実施し、汚染防止のため滅菌手袋を着用してください。

  1. DMEMベース培地に10%胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを補足して完全なDMEM培地を準備します。
  2. 100メッシュの細胞ストレーナーを無菌のペトリ皿に置き、消化した滑膜組織と液体をストレーナーに注ぎます。
  3. 残留組織を含む細胞ストレーナーを別の無菌のペトリ皿に移します。
  4. 20mLの滅菌シリンジプランジャーロッドの先端で、残った組織をストレーナー上で粉砕し、白色の繊維状の残留物だけが残り、細胞懸濁液が発現できなくなるまで続けます。
  5. 適切な量の完全なDMEM培地でこしをすすぎます。
  6. すべてのろ過液を集め、遠心分離機(4°C、500 × g、5分)、上清液を廃棄します。
  7. ペレットをPBSで再懸浮し、遠心分離機(4°C、500 × g、5分)で再懸浮させ、上清液を廃棄します。
  8. 細胞を完全なDMEM培地に再懸浮させます。
  9. 細胞計数を行い、細胞を培養フラスコに移します。
  10. フラスコを細胞培養インキュベーター(37°C、5% CO₂)で培養します。
  11. 48時間後にミディウムを交換してください。
  12. 細胞が完全に結合した時点でトリプシンとパセジを1:3の比率で消化します。

4. ビメンチン免疫蛍光染色によるRA-FLSの同定

注意:細胞洗浄用のPBS溶液は、37°Cの水浴で予温してください。 本節で指定されたすべての試薬体積は、48ウェルプレート形式向けに標準化されています。異なるフォーマットのプレートを使用する場合、体積は成長面積に比例してスケールする必要があります。

  1. トリプシンで細胞を消化し、採取した細胞を再懸浮させ、完全なDMEM培地で×10〜104 cells/Lに希釈します。
  2. RA-FLSを48ウェルプレートに200μLでシードします。
  3. 細胞培養インキュベーター(37°C、CO₂5%)に入れて24時間培養します。
  4. 培地を捨て、事前に温めたPBSでセルを3回洗います。
  5. 細胞固定のために4%のパラホルムアルデヒドを加えて10分間固定し、固定剤を捨ててPBSで3回洗います。
  6. 1ウェルあたりPBSで0.1%のトリトンX-100溶液150μLを準備します。使用前にボルテックスや穏やかな反転で完全な混合を確実にしてください。
  7. ウェルに0.1%のトリトンX-100溶液を加え、細胞を透過させるために10分間培養します。
  8. 0.1%のTriton X-100溶液は捨て、PBSで3回洗います。
  9. 1ウェルあたり150μLの動物性不使用ブロッキング溶液を加え、室温で1時間培養します。
  10. ブロッキングの解決策は捨てましょう。各ウェルに150μLのビメンチン一次抗体作動液(抗体希釈剤で1:200を希釈)を加えます。
  11. 一次抗体と共に4°Cで一晩培養します。
  12. 一次抗体は捨て、細胞をPBSで5回洗浄します。
  13. 1ウェルあたり150μLのAlexaフルオフル488結合抗ウサギIgG二次抗体(ユニバーサル抗体希釈剤で1:50希釈)を加え、37°Cで1時間光を遮断して培養します。
  14. 二次抗体は廃棄し、細胞をPBSで3回洗浄します。
  15. 各井戸にDAPI含有のアンチフェードメディウムを1滴加え、暗闇で10分間乾燥させます。
  16. 20×対物レンズとDAPIおよびFITC/GFP用の適切なフィルターセットを備えた逆形蛍光顕微鏡を用いて画像を観察・撮影します。
    注意:細胞をPBSで洗浄するには、ウェル全体をフルに充填し、5分間培養し、その後PBSを除去してください。この手順は1回の洗浄サイクルに相当します。

5. RA-FLSを定量し、フローサイトメトリーを用いて純度を評価する

注意:RA-FLSを識別する際にはビメンチンとCD90を陽性マーカーとして使用し、免疫細胞汚染を除外するために陰性対照としてCD68、CD14、CD11bを適用してください。ビメンチンは主にRA-FLSの細胞質に局在する細胞内特異的中間フィラメントタンパク質として機能します。CD90はRA-FLS上で高発現する重要な表面マーカーとして機能し、免疫細胞との区別を可能にします。CD68、CD14、CD11bはマクロファージ、単球、骨髄細胞に特異的に発現しますが、免疫細胞の汚染を排除するための陰性マーカーとして用いられます。結合特異性に基づいて細胞表面マーカーに蛍光色素を割り当て、蛍光チャネルの重複を避けます。例えば、この実験ではCD90とCD68が同じフルオロクロームを共有しています。したがって、同じ遠心分離機チューブにそれらを加えないでください。ビメンチン抗体でインキュベーションする前に、細胞膜を破壊するために固定剤と透過剤を加えます。フローサイトメーターに十分な蛍光チャネルがあれば、CD90やCD68などのマーカーを異なるチャンネルに割り当てて多色同時解析を行い、検出効率と情報量の向上をさらに図ることができます。

  1. EDTAフリートリプシンを用いて第三世代RA-FLSを消化します。
  2. 完全なDMEM培地で消化を終了し、遠心分離機(4°C、500 × g、5分)で処理し、上清液を廃棄します。
  3. ペレットをPBSで再懸浮させ、細胞計数を行い、PBSを用いて細胞濃度を1×10⁶ cell/mLに調整します。
  4. 細胞を3本の遠心分離機管に分散させ、それぞれの管に200μLの細胞懸濁液を加えます。
  5. 最終体積100μLでCD11b抗体(万能抗体希釈剤で1:100を希釈)をチューブ1に加えます。渦を混ぜる。
    1. 15分間の培養後、チューブ1に1mLの固定・透過剤を加え、渦を混ぜて30分間光を遮って培養します。
    2. チューブ1に1mLの固定/透過緩衝液を加えて透過化を終了させ、渦を混ぜて遠心分離機(4°C、500 × g、5分)、上清液を廃棄します。
    3. ビメンチン100μLとCD68抗体カクテル(それぞれ1:100のユニバーサル抗体希釈剤で希釈)を準備し、チューブ1に加え、渦を混ぜて30分間光を遮って培養します。
    4. チューブ1に1 mLの固定/透過緩衝液を加え、渦を混ぜて遠心分離機(4°C、500 × g、5分)し、上澄液を捨てます。
    5. チューブ1にAlexa Fluor 488結合抗ウサギIgG二次抗体(ユニバーサル抗体希釈剤で1:50希釈)を100 μL添加します。渦を混ぜて30分間、光を遮って孵化させます。
    6. チューブ1にバッファー1 mLを加え、渦を混ぜて遠心分離機(4°C、500 × g、5分)、上清液を捨てます。
    7. チューブ1にバッファー300μLを加え、ボルテックスでローディングサンプルとして混合します。
  6. CD90およびCD14抗体(それぞれ万能抗体希釈剤で1:100希釈)をチューブ2に追加し、最終体積は100μLにします。チューブ3は抗体を残してネガティブコントロールとして残します。
    1. 15分の培養後、チューブ2と3に1mLのPBSを追加します。
    2. 遠心分離機チューブ2および3(4°C、500 × g、5分)で上清液を捨て、バッファー300 μLを加え、ボルテックスでローディングサンプル用に混合します。
  7. 準備されたサンプルのフローサイトメトリー取得を行います。
  8. フローサイトメトリーデータを解析し、互換性のあるソフトウェアを使って統計を行います。

6. MTSアッセイを用いたTNF-α誘発RA-FLS増殖の測定

  1. EDTAフリートリプシンを用いて第三世代RA-FLSを消化します。
  2. 完全なDMEM培地で消化を終了し、遠心分離機(4°C、500 × g、5分)で処理し、上清液を廃棄します。
  3. ペレットを完全なDMEM培地に再懸浮させ、セルカウントを行い、1×10⁵セル/Lに希釈します。
  4. 再懸浮セルを1ウェルあたり100μLの96ウェルプレートにシーディングします。
  5. 細胞培養インキュベーターで培養皿を培養し、細胞接着が起こるまで培養し、その後ブランクコントロール群と介入群に分けます。
  6. 介入群に10 ng/mLのTNF-αを追加し、ブランク対照群に同量のPBSを加えます。
  7. 24時間の介入後、各ウェルに10μLのMTS試薬を加え、細胞培養インキュベーターでの培養を続けます。
  8. 1時間の培養後、マイクロプレートリーダーを使って490 nmの吸収(OD)を測定します。
  9. 各ウェルのOD値に基づいて細胞増殖の生存率を計算します。

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結果

このプロトコルを用いて、短期培養された患者由来のRA-FLSを成功裏に単離しました。手続きワークフローの概略図(図1)が示されています。光学顕微鏡下では、RA-FLSは紡錘形かつ不規則な多角形細胞という主に形態的表現型を示しました。細胞は広範な細胞質の拡散と細長い突起を示しました。細胞同士の接触や重なりのある領域では、細胞境界がやや曖昧に見えました。大多数の細胞は、分極した伸長を持つ比較的透明な細胞質を示しました。核は主に楕円形または細長く、細胞内の中心または偏心に位置していました(図2A)。

Vimentinの免疫蛍光染色により、単離されたRA-FLSの>98%が強い陽性発現を示し、特徴的な線維状細胞骨格分布を示しました(図2B-D)。さらに、フローサイトメトリクス解析...

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ディスカッション

このプロトコルは、高い細胞生存率、特徴的な表現型、特異的マーカー発現、炎症刺激に対する機能的応答性など、高い細胞生存率、特異的マーカー発現、炎症刺激に対する機能的応答性などを挙げ、RA-FLSを単離し、短期培養するための再現可能な方法を確立します。

重要なステップと技術的考慮事項
この方法の信頼性は、いくつかの重要なステップにかかっています。まず、新鮮な滑膜組織は獲得後4〜6時間以内に酵素による消化を受けるべきです。組織は一時的に-80°Cで保存できますが、最適な滑膜細胞の生存率を確保するために保存期間を長引かせてはいけません31。次に、初期の組織処理時には、脂肪細胞や骨芽細胞による汚染を防ぐために、脂肪組織や骨組織の綿密な除去が極めて重要です。なぜなら、そのような汚染は後の細胞培養の特性を変化させる可能性があるからです。第三に、トリプシンおよびコラーゲンナーゼII型を用いた連続的な酵素的消化は、細胞の生存能力を維持しつつ効果的...

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開示事項

著者らは本研究に利益相反はないと報告し、 Figdrawによる図1 の生成がプラットフォームのライセンス条件に準拠していることを確認しています。

謝辞

この研究は中国国家自然科学基金(第82074223号および第8207141673号)および中央政府レベルの主要プロジェクト「価値ある中国医学資源の持続可能な利用確立(第2060302号)」の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Alexa fluor 488結合抗ウサギIgG中山景橋バイオテクノロジーZF-0511
0.25% トリプシン-EDTA(1倍)ギブコ25200-072
4% パラホルマルデヒドソーラービオP1110
アレクサ・フルーム674 反人間 CD68バイオレジェンド562111
動物フリーブロッキングソリューション細胞シグナル伝達技術15019
APC対ヒューマンCD90バイオレジェンド559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BDバイオサイエンス657925
BD LSRFortessaBDバイオサイエンス647177
BV605 抗ヒトCD11bビデゲンド563015
CellTiter 96 AQueous One Solution 細胞増殖アッセイ(MTS)プロメガG358A
コラーゲンIIソーラービオC8150
DAPI含有蛍光マウント培地中山景橋バイオテクノロジーZLI-9556
DAPI含有蛍光マウント培地中山景橋バイオテクノロジーZLI-9556
ダルベッコ修正イーグルミディウム(DMEM)、高グルコースハイクローンSH30022.01
胎児用牛血清-スーパーファイン(FBS)上海中橋新丹バイオテクノロジー有限公司ZQ0500
FITC抗ヒトCD14バイオレジェンド325604
PBS、1×(pH 7.4)リン酸塩緩衝生理食塩水サービスバイオG4202
ペニシリン-ストレプトマイシン混合液(二重抗生物質)100回;上海中橋新丹バイオテクノロジー有限公司CSP006
QuickBlock ユニバーサルプロテインブロッキングおよび抗体希釈バッファービヨタイムP0270-500ml
組換えヒトTNF-&α;ペプロテック300-01A
転写因子染色バフeバイオサイエンス00-5523-00
トライトン X-100ソーラービオT8200
トリプシン溶液(EDTAフリー)北京・ラブギック科技有限公司BL526A

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