ドップラー心エコーを用いて、排気率が保持された心不全マウスモデルにおける冠動脈流量予備の評価

サマリー

本プロトコルは、射出率(HFpEF)が保存された心不全のマウスモデルにおいて冠動脈微小血管機能障害を評価する迅速かつ非侵襲的なアプローチを記述しています。冠動脈流量予備(CFR)は、ドップラー超音波ガイドによる左冠動脈の局在によって決定され、高血と基準冠動脈流速の比率として計算されます。

要約

射出率が保たれる心不全(HFpEF)は、効果的な治療法が存在しないため、世界的に大きな負担であり、臨床上の大きな課題となっています。また、その基礎となる病態生理は依然として不明です。HFpEF患者に非常に多い冠動脈微小血管機能障害(CMD)は、左心室拡張期および収縮期の両方の機能に障害をもたらす心筋虚血を引き起こします。微小血管機能障害がHFpEFの中心的特徴であることから、CMDは現在、その病因に重要な要因と考えられています。冠状動脈流量予備(CFR)は、最大高吸血期と安静時血流速度の比率として定義され、心筋虚血の非常に価値のあるマーカーです。さらに、冠動脈血管運動障害の包括的な指標としても機能し、心外膜外膜および微小血管冠動脈の血行動態が心筋灌流に与える複合的な影響を測定します。このプロトコルは、ドップラー心エコーを用いてマウスのHFpEFモデルにおけるCFRの変化を評価することに重点を置いています。本研究では、対照マウスはイソフルラン誘発血管拡張で冠動脈血流のピーク速度が安静時値と比べて2倍以上増加した一方、HFpEFマウスではこの反応が有意に減弱されました。HFpEFでは、低下したCFRが副作用を予測し、基礎となる微小血管機能障害を反映することで、疾患進行の研究や患者選択の指標となる重要なツールとなっています。

概要

心不全(HF)で駆出率が保たれている(HFpEF)は、心不全の主要な形態であり、予後が悪いと関連しています。しかし、関連する罹患率や死亡率を減らすための証明された治療法は存在しません^1,2。高齢、高血圧、糖尿病、脂質異常、肥満など複数のリスク要因の存在がHFpEF3の複雑さと異質性の根底にあります。近年、冠動脈微小血管機能障害(CMD)がHFpEFの併存症ではなく、独立かつ直接的なリスク因子であることが蓄積^{されています。}機能的および構造的異常を伴う冠動脈微小血管機能障害は、HFpEF ^7,8における心内膜下虚血、びまん性間質線維症、左心室機能障害の基礎となっています。心血管疾患におけるCMDの病理的役割については広範な研究が行われ^{ています。}臨床研究では、微小血管機能障害(CFR<2.0の障害)が左心室拡張期機能の悪化と直接関連し、HFpEF¹¹における有望な治療標的となる可能性が示されました。心不全における射出率保持における微小血管機能障害の有病率に関する心エコー評価(PROMIS-HFpEF研究)では、左冠動脈のCFR測定に基づき、HFpEF患者の75%がCMDであることが明らか^{になりました。}さらに、異常なCMDは有害な結果のリスク増加と相関し、死亡リスクも有意に増加しました^13,14。したがって、動物モデルにおけるCMDを主要なバイオマーカーとして用いることは、HFpEFの病態生理の調査を大いに容易にし、疾患表現型の成功した再現性の検証に寄与します。

現在、陽電子放出断層撮影(PET)、心血管磁気共鳴(CMR)、分数流量予備(FFR)、微小循環抵抗指数(IMR)などの冠動脈微小血管機能評価方法は、動物の小型化と専用の画像機器の利用可能性の限りから齧歯類研究に適用が困難です。冠状動脈フローリザーブ(CFR)は、冠動脈生理学を調査するための国際ガイドラインで推奨されています^15,16。さらに、CFRは心臓虚血の信頼できるマーカーであり、冠動脈機能障害の指標であり、心血管リスクの貴重な予後指標としても機能します¹⁷。CFR評価のためのドップラー心エコーは、前臨床の齧歯類モデルにおける冠動脈全体の機能を評価するための検証済みかつ再現性のある方法です。これまでの研究では、心筋虚血再灌流損傷のマウス/ラットモデルでCFRの使用が報告^{されていますが、}HFpEFの動物モデルでは一度も適用されたことがありません。さらに、本研究で述べたCFR評価法は、カラードップラー心エコーを用いてLCAを迅速に特定するものであり、糖尿病性心筋症、高血圧性心疾患、慢性炎症性または自己免疫疾患の動物モデルにも拡張可能です。本研究では、マウスモデルに心外膜冠動脈狭窄症が認められないことから、冠動脈流量予備(CFR)の減少は主に冠動脈微小血管機能障害を反映しており、心外膜と微小血管の複合的な寄与とは異なる。したがって、CFRはこのHFpEFモデルにおいてCMDの信頼できる代理マーカーとして機能します。

プロトコル

すべての手技は南京ドラムタワー病院の倫理委員会が承認したプロトコル(承認番号20011141)に準拠し、動物実験:生 体内 実験報告(ARRIVE)ガイドラインに準拠^{していました。}本研究では、HFpEFモデルが生後6〜8週のオスC57BL/6Jマウス(BW、~25g)で確立されました。実験期間中、マウスは特定の病原体フリー(SPF)室に置かれ、温度(23 ± 1°C)、湿度(65%–70%)、12時間の明暗サイクルという制御された条件下で飼育されました。すべての動物は自由に食べ物と水にアクセスできました。研究後、マウスは1.5%イソフルランで麻酔され、頸椎脱臼によって安楽死させられました。使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

1. HFpEFマウスモデルの確立

1. マウスをランダムに2つのグループに分けます:コントロール(CTRL)グループとHFpEFグループで、それぞれ8匹のマウスを配置します。
2. 確立されたプロトコル21,22,23,24,25を用いて、HFpEFマウスモデルを誘導します。
   1. 生後6〜8週のマウスには高脂肪食(HFD、脂肪60%)を与え、飲料水に溶かした0.5 g/L N-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L-NAME)を8週間提供します。
      注意:L-NAMEの飲料水は茶色いボトルで準備し、光に当たらないようにし、2〜3日ごとに補充してください。
3. 年齢に合ったマウスには標準的な通常の食事を与え、対照群と同じ期間定期的に水を飲みます。

2. 心エコーによる冠動脈流量予備の評価

1. 心エコー評価に先立ち、麻酔チャンバー内で1.5〜2.0 L/minの蒸気イソフルランを吸入し、100%のO₂流量で投与して麻酔します。
   注意:イソフルランは揮発性麻酔薬です。運転中は十分な換気を確保してください。液体イソフルランをベポライザーに加える際は、皮膚との接触を避けるためにニトリル手袋を着用してください。
2. 皮膚のつまみや足の指や尾の刺激に反応がないことを確認し、動物を画像プラットフォームに仰向けに配置します。
3. ガス麻酔装置をチャンバーからマスク投与に切り替え、処置中は麻酔濃度を1.5%に保ちます。
4. 画像プラットフォームの銅板(ECG電極)に導電性ジェルを塗布し、4本の足をテープで貼り付けて生理学的データ(心電図と呼吸)を取得します。
   注意:イソフルランは維持のために1.5%に保ち、内蔵の温かみプラットフォームを使って体温を37°C近くに保ってください。画像検査中の生理的安定性を確保するために、目標呼吸率は1分間に100〜140回の呼吸を維持してください。
5. 綿先端のアプリケーターで除毛クリームを塗布して胸毛を除去します。
6. 余分なクリームや緩んだ毛を水に浸したガーゼで拭き取り、画像撮影の準備をしてください。
   注意:皮膚の刺激や毒性を避けるために、残留した除毛クリームは完全に除去してください。
7. 両目に無菌潤滑眼軟膏を塗布し、強膜乾燥を防ぎます。
8. 超音波透過ゲルを前方心臓部に塗布し、画像プラットフォームを水平に対しておおよそ30°〜45°の角度で位置させます。
   注意:超音波ジェル内の気泡は避けてください。
9. 高周波超音波トランスデューサーを胸骨傍線にゆっくりと置き、胸部と平行に整列させることで、左心室の調整後副胸骨長軸(PLAX)ビューが得られます(図1A)。
10. プローブを胸壁に軽く接触させ、圧迫を防いでください。
11. ブライトモードボタンを押すと明るさモードのイメージングに切り替えられます。
12. プローブと画像プラットフォームの角度を調整し、左冠動脈(LCA)の位置を特定します。
    注意:声響窓内で左心室(LV)、左心房(LA)、左心室前壁(LVAW)、左心室後壁(LVPW)、心室間隔(IVS)、大動脈(AO)、肺動脈(PA)、肺静脈(PV)、僧帽弁(MV)、乳頭筋を特定します。
13. タッチスクリーンのカラー ドップラー ボタンを押してカラードップラーモードを起動します。リアルタイム表示では、大動脈弁からプローブ方向へ流れる流れが赤色で表示されます。
14. プローブの角度と位置を調整し、肺静脈流の干渉を最小限に抑えつ、大動脈洞から遠位支部までの完全なLCAを可視化します。
15. パルス波ドップラー(PW)モードを起動。PW測定ウィンドウをLCAの血流方向に平行に配置します(図1B,C)。
    注意:インソネーション角を60°未満に保ち、ドップラーカーソルを冠動脈の流れに平行に合わせてリアルタイム角度補正を適用してください。
16. 「 クリップを保存 」を選択して、LCAのベースライン流量波形をキャプチャします。
17. イソフルラン濃度を3%に上げると、冠動脈の流速が徐々に増加するのを観察します。
18. 3%イソフルランに45秒連続曝露した後、高血性冠動脈流速をキャプチャするために 「クリップ保存 」を選択してください。
    注意:LCAの血流を継続的にモニタリングしてください。呼吸や心臓の動きによってPWサンプルの体積がずれた場合は、取得を一時停止し、カラードップラーモードに戻ってLCAを再識別し、PWゲートを再配置してからPWモードを再開します。
19. 終了後はイソフルラン吸入を中止し、超音波ゲルを除去してください。ネズミを完全に回復させるまで温熱パッドの上に置き、その後ケージに戻します。

3. 統計解析

1. 解析ソフトウェアで3回連続した心臓周期の平均測定値を追跡し、基準およびピークLCA流量速度を算出しました。CFRは高吸血期拡張期冠動脈流速と基線拡張期冠動脈流速(CFV)の比率として計算します。
2. 実験者とデータアナリストの間で二重盲検設計を実施します。シャピロ–ウィルク検定を用いて正常性を評価します。正規分布データを二側無ペアの学生t検定を用いて解析します。Mann–Whitney U検定を用いて正規分布でないデータを解析します。

結果

本研究では16匹のマウス(HFpEF、n = 8;CTRL、n = 8)が使用されました。左冠動脈は、パラ胸骨長軸(PLAX)ビューでカラードップラー誘導のもとで特定され、冠動脈流速度はパルス波(PW)ドップラーを用いて測定されました。各マウスから1.5%(ベースライン)および3%(高血)イソフルラン濃度の両方で十分かつ再現可能な画像を取得した後、少なくとも3回連続した心周期の平均値を用いて²⁶ CFRが決定されました。代表的な結果は図2に示されています。同じ画像診断セッション中に、マウス1匹あたり1回の充血刺激のみが行われました。

初期評価では、冠動脈微小血管機能障害の評価前に、頂端4室視野心エコーを用いてHFpEFマウスモデルの成功した再現を確認しました。所見ではHFpEF群においてE/A比およびE/e'比の両方に有意な増加が見られ、拡張期機能障害の存在が示されました (図3A,B)。

ディスカッション

本研究は、非侵襲的で簡易かつ再現性の高い方法を用いてHFpEF動物モデルにおける大血管および微小血管機能障害を評価するプロトコルを提示します。冠状動脈フロー予備の評価のためのドップラー心エコーは、欧州循環器学会により検証済みかつ再現性のある方法として認められています¹⁵。C57BL/6Jマウスの通常の生理的条件下では、冠状動脈流量予備は≥2.0と予想されます。本研究では、CTRL群と比較してHFpEFマウスでCFRが有意に減少し、冠動脈微小循環の障害を示唆^{しました。}

リアルタイム同時Bモードおよびパルス波ドップラーイメージングは、小容器評価に有用なツールです。しかし、パルス繰り返し周波数(PRF)の制限により、速度定量はリアルタイムの低速度フロー領域に制限されています。オペレーターは...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
動物生理モニター	富士フイルム	VEVO 3100	心拍数、呼吸数、体温をモニターしてください
C57マウス	ジェムファーマテック株式会社
カメラ	カノン、日本	EOS R50	画像診断プラットフォームと超音波プローブの位置を記録する
除毛クリーム	ヴェート、フランス語		脱毛
ガーゼ	キュリティ	CAR-6339-PK	無菌
イソフルラン	報酬	R510-22-10	麻酔
N-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L-NAME)	シグマ・オルドリッチ	N5751	HFpEFマウスモデルの導入
研究食法、60%脂肪	リサーチ・ダイエッツ社	D12492	高脂肪食
外科用サーモスタット加熱パッド	グロバレビオ、中国	GE0-20W	温度制御
超音波ジェル	パーカー研究所	W60698L	超音波伝達ジェル
Vevo 3100前臨床イメージングプラットフォーン	富士フイルム	VEVO 3100	心エコー
VevoLABソフトウェア	富士フイルム	VevoLAB 3.2.6	心エコーデータ解析