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研究記事

インビボ マウス毛包周期中の毛幹、メラニン、コラーゲンの動的変化の非侵襲的観察

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DOI:

10.3791/70144

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2026年7月28日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

† These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究は、非侵襲的かつ生 体内 で二光子顕微鏡と第二調和生成顕微鏡を用いて、マウスの毛包周期全体にわたる毛幹形態、メラニン動態、皮膚コラーゲン密度を縦方向にモニタリングし、脱毛治療研究のための堅牢な方法論的枠組みを提供します。

要約

毛包周期の従来の評価は侵襲的な組織学的手法に依存しており、連続的な縦断観察は制限されています。非侵襲的な光学イメージング、特に二光子励起蛍光(TPEF)および二次高調波生成(SHG)が、複数の毛包サイクルにわたる毛幹、メラニン、コラーゲンの生 体内 動態変化を正確に追跡・定量化できると仮説が立てられました。C57BL/6マウスの毛幹は、アナゲン期、カタージェン期、休止期の各段階で、皮膚鏡、写真撮影、電子顕微鏡を用いて生 体内 でモニタリングされました。具体的には、800nm励起下でのTPEFと画像化を用いてメラニン動態を定量し、950nm励起下でのSHGを用いて濾胞間コラーゲンの変化を観察しました。正確性を確保するために、 生体内 での光学測定は相互検証されました。メラニン動態は皮膚写真撮影で組織全体の外観を確認し、ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色による毛球発現を評価し、コラーゲン変化はリリウスレッド染色切片の液晶偏光イメージングシステムを用いて繊維密度と向きを評価して検証しました。観察結果は、アナゲン期において毛の柄の直径とメラニン生成が徐々に増加し、毛包間コラーゲン密度の著しい減少を伴うことを示しました。カタゲン期および休止期にはメラニンレベルが徐々に低下し、コラーゲン密度は徐々に基準レベルに回復しました。本プロジェクトは、毛包の包括的な動態を評価するための検証済みの非侵襲的な in vivo 方法論を確立し、脱毛治療のための有効薬の前臨床評価のための堅牢な実験的枠組みを提供します。

概要

C57BL/6マウスの毛包は同期性と規則性を示し、実験的な利便性を提供し、皮膚疾患の研究における一般的な動物モデルとなっています1,2。毛包はC57BL/6マウス3の出生後7週目に第2休止期に入ります。人工的介入がない場合、この休止期は出生後12週まで維持されます。この長い休止期は、毛包の成長サイクル5を同期させるために研究でよく使われる時間点です。マウスの人工脱毛後、毛包はすぐにアナゲンフェーズ6に入り始めます。

成長期に入ると、膨らみ領域の幹細胞は増殖し、外根鞘に分化して下向きに成長して濾胞の長さを増加させます。毛根は毛根が深くなるにつれて上方に伸びます。球根内の幹細胞は継続的に毛幹と内根鞘へと分化します。皮膚内のコラーゲンとメラニンの分泌もアナゲン期10で急速に変化し、毛包の発生に重要な役割を果たします11,12。脱毛関連の研究では、メラニン分泌は一般的に肌の色によって評価されており、正確な定量化はできません。これまでのところ、コラーゲンの研究は主に発生と老化に焦点を当てており、定量化の周期的なダイナミクスにはあまり焦点が当てられていません。

現在、毛包サイクルと再生療法の評価における大きな制約は、破壊的な組織学的終点に依存していることであり、そのため特定の時点で異なる動物集団の安楽死が必要となります。これにより、同じ濾胞微小環境を複数サイクルにわたって連続的かつ縦断的に追跡することが防げます。さらに、皮膚科検査のような従来の非侵襲的手法では、深部毛胞の変化を可視化するには十分な組織浸透ができず、巨視的観察ではメラニンを正確に定量化できず、後退期および安静期においてクラブ毛のメラニン欠乏根を検出しにくくしています(16,17)。また、縦方向の生体内観察技術が進歩しており、例えばコラーゲン繊維を評価する液晶偏光法20,21、色素沈着観察のための皮膚共焦点顕微鏡22,24、皮膚厚さ測定のための光学コヒーレンス断層撮影技術25,26,27などがあります多光子顕微鏡は、独自に魅力的な解決策を提供します。二光子励起蛍光(TPEF)と二次高調波生成(SHG)の組み合わせにより、明確な利点があります。これは、真皮深部へのラベルフリーの高解像度光学切断を可能にし、外因性染料を使わずにメラニン自己蛍光およびコラーゲン繊維構造の同時生体内定量化を可能にします28,29.本研究では、非侵襲的なTPEF/SHG画像診断が、侵襲的組織学的ゴールドスタンダードと同等の精度でこれらの構造変化を動的かつ正確に定量化できると仮説を立てています。この重要な科学的問題に取り組むことで、本研究は脱毛症の治療薬の非侵襲的評価を支援する堅牢な縦断的なin vivo画像フレームワークを確立することを目指します。

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プロトコル

脊椎動物を対象としたすべての方法は、機関のガイドラインに従って実施されました。すべての動物実験手技は中国医学科学院実験研究センターの動物管理・利用委員会(プロトコルコード:ERCCACMS11-2210-03)によって承認されました。本研究で使用されるすべての材料は 材料表に記載されています。

動物の調製と巨視的観察
生後6〜7週、体重20 ± 2 gの雄C57BL/6マウスを商業供給者から入手しました。マウスは組織学的分析コホート(n = 39)と連続 生体内 画像コホート(n = 3)に分けられました。すべてのマウスの背側毛は毛包周期を同期させるために脱毛されました。脱毛後2日目から26日目まで、発毛の発生状況を隔日で検査しました。イメージングコホートのマウスの背中は、26日目までカメラで隔日撮影されました。焦点距離は15cmに固定され、マクロな変化を正確に記録するために、一定の標準的な実験室の環境照明条件が確保されました。

生体内 でTPEFおよびSHGイメージング
画像検査は脱毛後2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、12日目、14日目、16日目、18日目、20日目、22日目、24日目、26日目に実施されました。マウスはイソフルランで麻酔されました。呼吸数を観察し、足の反射を優しくつまんで確かめることで、完全な意識喪失を確実にした。麻酔されたマウスは二光子顕微鏡のステージに固定されました。メラニンのTPEFイメージングには、25倍の水浸式対物レンズ(数値口径=1.05)が搭載され、励起波長は800 nmに設定されていました。メラニンの自己蛍光のZスタックスキャンを行い、総走査深度は45μmに達しました。ステップサイズは2μm、画像解像度は1,024ピクセル×1,024ピクセル、取得速度は4μs/ピクセルに設定されました。コラーゲン繊維のSHGイメージングでは、同じ25倍の水浸け物レンズを用いて励起波長を950 nmに調整しました。真皮の上表面から45μmの総走査深度までのZスタックスキャンを開始し、ステップサイズ2μm、画像解像度1,024×1,024ピクセル、取得速度4μs/ピクセルを維持しました。画像診断の後、マウスは慎重に顕微鏡から取り出され、イソフルランは中止され、意識が完全に回復するまで温めパッドの上に置かれ、その後ケージに戻されました。

組織採取と組織学的処理
組織学グループの別々の3匹のマウスコホートが、機関のガイドラインに従い2日目から26日目まで隔日で安楽死させられ、縦断組織サンプリングにマウスが再利用されないようにしました。各マウスの背中の水平・垂直中軸の交差点に正確に中央にある2 cm ×2 cmの全厚背側皮膚組織サンプルを外科的に切除しました。切除した皮膚組織はエッジのカールを防ぐために硬いカードの上に平らに置かれ、直ちに4%パラホルマルデヒドを含む試験管に浸されました。固定組織は脱水され、6μm厚さのパラフィン断片を準備するために埋め込まれました。脱ワックス前に、パラフィン部分はスライドウォーマーで120分間加熱されました。セクションは製造元の指示に従い、標準の染色キットを使ってヘマトキシリンとエオシン(HE)およびシリウスレッドで染色されました。切片は中性樹脂で取り付けられ、逆立顕微鏡で観察されました。液晶偏光イメージングでは、脱ワックスとシリウスレッド染色した部分を偏光光学顕微鏡で撮影しました。偏光器と分析器を正確に90°で交差させることで、最大暗い背景(消光状態)を得ることで統一偏光角が確立され、この特定の角度はその後のすべての画像撮影で一貫して固定されました。

生体内 皮膚鏡検査および毛髪の電子顕微鏡
抜毛前に、20倍倍の臨床皮膚鏡を用いて背側毛の成長領域をin vivo で評価しました。毛髪再生は、毛幹の出現と密度に基づく標準的な0–3スコアリングシステム(0=露出毛なし、1=まばらな毛髪出現、2=中程度の毛密度、3=濃密で完全な毛被覆)を用いて定量化されました。偏りのないサンプリングを確保するため、各マウスの背側脱毛領域は視覚的に4つの等しい象限に分割されました。乱数生成器を用いてマウスごとに2つの象限を選び、各選択した象限から新しく生えた5本の毛の柄を無菌鉗子でしっかりと抜きました。抜いた毛の柄は直ちに浸され、2.5%グルターアルデヒドを0.1 Mリン酸バッファー(pH 7.4)に4時間、4°Cで固定して超細構造を保存しました。固定された毛柄は0.1 Mリン酸塩バッファーで3回洗浄され、各濃度で15分間段階エタノール(50%、70%、80%、90%、100%)で順次脱水され、その後液体CO2で臨界点乾燥を行った。乾燥した髪の柄は、アルミのスタブに取り付けられた導電性の両面カーボンテープに水平に取り付けられました。試料は真空スパッターコーターを用いて60秒間、10nmの金層でスパッターコーティングされ、電子の充電を防ぎました。被覆された試料は走査型電子顕微鏡に挿入され、5.0 kVの加速電圧で毛束を観察しました。超顕微鏡的な形態変化は、500倍および1,000倍倍の画像を撮影することで体系的に評価され、特に毛幹の直径や表皮鱗の構造的完全性と配置を記録しました。

データと統計分析
画像パラメータは汎用画像解析ソフトウェアを用いて測定・定量化されました。すべての統計解析およびグラフィカル表示は標準的な統計解析ソフトウェアを使用して実施されました。同じ動物から複数の時間点にわたって取得された連続 的な生体内 モニタリングデータについては、分散の反復測定解析(RM-ANOVA)を用いて統計的有意性を決定し、その後ボンフェローニの 事後 検定を行った。独立した動物サンプルを含む組織学的データについては、通常の一方向ANOVAに続いてTukeyの 事後 検定を用いて統計的差異を評価しました。すべての結果は平均±標準偏差(SD)として表されました。差は統計的に有意で、*p < 0.05、 p < 0.01、***p < 0.001と評価されました。

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結果

マウスの毛観察
マウスの毛髪成長の写真観察は 図1Aに示されています。皮膚表面からの毛の出現は10日目から始まり、12日目から16日目までも発生が維持されました(p < 0.05)。その後、髪の毛の被覆率は18日目から26日目にかけて横ばいとなりました(p > 0.05)(図1B)。さらに、皮膚鏡検査は非侵襲的な 生体内 毛髪成長動態の観察を可能にしました。2日目には、皮膚が均一にピンク色で無毛に見えました。8日目には毛幹が表皮のすぐ下に見え、10日目には皮膚表面から露出しているのが観察されました。毛の柄は10日目から16日目にかけて徐々に太くなり、16日目に最大直径に達しました。26日目には皮膚がピンク色で無毛の状態に戻りました(図1A)。

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ディスカッション

C57BL/6マウスモデルは、第2休止期が7週から12週まで安定して続くため選ばれました。26日間の観察期間は完全にこの静的段階に含まれているため、観察される深い動的変化は脱毛による周期進行によって明確に駆動されており、自然な加齢に伴う変動は完全に除外されています。脱毛が休止期に行われると、毛包はすぐにアナゲン期に入ります。著者の知る限り、本研究は二光子と二次調和生成イメージングを用いて、マウスの毛包サイクルを観察する新しい非侵襲的なin vivo法を提示しています(32,33)。毛包は6日目にアナゲンIII期、10日目にアナゲンVI期であることが観察されました。彼らは18日目にカタゲンIII段階、20日目にカタゲンV段階、24日目に休止期に入りました。これらの所見は、従来の組織病理学的セクションから得られたものと非常に一致しています。さらに、この非侵襲的アプローチによりエンドポイントの動...

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開示事項

著者らは、本論文で報告された研究に影響を与えた可能性のある競合する財政的利害関係や個人的な関係は知られていないと述べています。この記事のプレプリントは、BioRxivの公開リポジトリにある以下の参考文献42で入手可能です。

謝辞

この研究は、中国医学科学院イノベーション基金(ID: CI2025C001)、中国医学科学院の科学技術イノベーションプロジェクト(助成金番号)の支援を受けました。NLTS2025004)、および中央公共福祉研究所のための基礎研究基金(助成金番号)JJPY2025002)。

著者の貢献: コンセプチュアライゼーション、ゲイイング・ホーとイー・ワン;調査では、劉孟華、王小雨、王鳳龍が担当しました。データキュレーション、劉孟華、執筆—原稿準備、劉孟華;資金調達、イーワン。すべての著者は原稿の出版版を読み、同意しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C57BL/6マウス北京バイタルリバー実験動物技術SCXK（京）2021-0006動物モデルに使用
デジタル一眼レフカメラキヤノンEOS 80Dマウスの背面の写真撮影に使用
H&E染色キットLtdSolarbio Science & Technology Co.G1120組織切片の染色に使用
倒立顕微鏡オリンパスBX51写真撮影に使用
イソフルランRWDライフサイエンスコ.R510-22-16動物の麻酔に使用
Mai Tai DeepSeeSpectraPhysicsMai Tai HPTPEFとSHGのin vivoイメージングに使用
医療用電子皮膚鏡中国創宏医科技術有限公司CH-DSIS-2000皮膚色のin vivoイメージングに使用
偏光顕微鏡オリンパスBX51-Pシリウスレッド染色のイメージングに使用
走査型電子顕微鏡（SEM）日立ハイテク株式会社SU8010毛幹の超微細構造観察に
シリウスレッド染色キットSolarbioG1472コラーゲン繊維染色に
小動物麻酔機RWDライフサイエンスコ.R500動物の麻酔に使用

参考文献

  1. Müller-Röver S, et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. J Invest Dermatol. 2001;117(1):3-15.
  2. Lin X, Zhu L, He J. Morphogenesis, Growth Cycle and Molecular Regulation of Hair Follicles. Front Cell Dev Biol. 2022;10:899095.
  3. Wang WH, et al. Studying Hair Growth Cycle and Its Effects on Mouse Skin. J Invest Dermatol. 2023;143(9):1638-1645.
  4. Stenn KS, Paus R. Controls of hair follicle cycling. Physiol Rev. 2001;81(1):449-494.
  5. Paus R, Cotsarelis G. The biology of hair follicles. N Engl J Med. 1999;341(7):491-7.
  6. Pineda CM, et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nat Protoc. 2015;10(7):1116-30.
  7. Hu XM, et al. A systematic summary of survival and death signaling during the life of hair follicle stem cells. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):453.
  8. Greco V, et al. A two-step mechanism for stem cell activation during hair regeneration. Cell Stem Cell. 2009;4(2):155-69.
  9. Hsu YC, Li L, Fuchs E. Transit-amplifying cells orchestrate stem cell activity and tissue regeneration. Cell. 2014;157(4):935-49.
  10. Xing YZ, Guo HY, Xiang F, Li YH. Recent progress in hair follicle stem cell markers and their regulatory roles. World J Stem Cells. 2024;16(2):126-136.
  11. Raja E, Clarin MTRDC, Yanagisawa H. Matricellular Proteins in the Homeostasis, Regeneration, and Aging of Skin. Int J Mol Sci. 2023;24(18):14274.
  12. Ojeh N, et al. In vitro. skin models to study epithelial regeneration from the hair follicle. PLoS One. 2017;12(3):e0174389.
  13. Wang F, et al. Pilose antler extracts promotes hair growth in androgenetic alopecia mice by activating hair follicle stem cells via the AKT and Wnt pathways. Front Pharmacol. 2024;15:1410810.
  14. Schneider MR, Schmidt-Ullrich R, Paus R. The hair follicle as a dynamic miniorgan. Curr Biol. 2009;19(3):R132-42.
  15. Bardou D, Bouaziz H, Lv L, Zhang T. Hair removal in dermoscopy images using variational autoencoders. Skin Res Technol. 2022;28(3):445-454.
  16. Navarrete-Dechent C, Jaimes N, Marchetti MA. Unveiling melanomagenesis through the dermatoscope. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2021;35(5):1038-1039.
  17. Liatsopoulou A, et al. Handheld dermatoscope versus digital camera for hair counts in laser facial hair removal. J Cosmet Laser Ther. 2023;25(1-4):38-44.
  18. Bromage TG, et al. Circularly polarized light standards for investigations of collagen fiber orientation in bone. Anat Rec B New Anat. 2003;274(1):157-68.
  19. López De Padilla CM, et al. Picrosirius Red Staining: Revisiting Its Application to the Qualitative and Quantitative Assessment of Collagen Type I and Type III in Tendon. J Histochem Cytochem. 2021;69(10):633-643.
  20. Feng F, Mao H, Wang A, Chen L. Two-Photon Fluorescence Imaging. Adv Exp Med Biol. 2021;3233:45-61.
  21. Fernández-Domper L, Ballesteros-Redondo M, Vañó-Galván S. Trichoscopy: An Update. Actas Dermosifiliogr. 2023;114(4):T327-T333.
  22. Zhai X, Vyas S, Yeh JA, Luo Y. Two-photon fluorescence imaging of subsurface tissue structures with volume holographic microscopy. J Biomed Opt. 2020;25(12):123705.
  23. Dulebo A, et al. Second harmonic atomic force microscopy imaging of live and fixed mammalian cells. Ultramicroscopy. 2009;109(8):1056-60.
  24. Zuhayri H, et al. In Vivo. Quantification of the Effectiveness of Topical Low-Dose Photodynamic Therapy in Wound Healing Using Two-Photon Microscopy. Pharmaceutics. 2022;14(2):287.
  25. Gerger A, Hofmann-Wellenhof R, Samonigg H, Smolle J. In vivo. confocal laser scanning microscopy in the diagnosis of melanocytic skin tumors. Br J Dermatol. 2009;160(3):475-81.
  26. Ilie MA, et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncol Lett. 2019;17(5):4102-4111.
  27. Al-Chaer RN, Bouazzi D, Jemec G, Mogensen M. Confocal microscopy and optical coherence tomography of inflammatory skin diseases in hairs and pilosebaceous units: A systematic review. Exp Dermatol. 2023;32(7):945-954.
  28. Graf BW, Boppart SA. Multimodal In Vivo. Skin Imaging with Integrated Optical Coherence and Multiphoton Microscopy. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 2012;18(4):1280-1286.
  29. Urban G, et al. Combining Deep Learning With Optical Coherence Tomography Imaging to Determine Scalp Hair and Follicle Counts. Lasers Surg Med. 2021;53(1):171-178.
  30. Sagawa N, et al. Role of increased vascular permeability in chemotherapy-induced alopecia: In vivo. imaging of the hair follicular microenvironment in mice. Cancer Sci. 2020;111(6):2146-2155.
  31. Duverger O, Morasso MI. Epidermal patterning and induction of different hair types during mouse embryonic development. Birth Defects Res C Embryo Today. 2009;87(3):263-72.
  32. Liu M, et al. Pilose antler extract promotes hair growth in androgenic alopecia mice by promoting the initial anagen phase. Biomed Pharmacother. 2024;174:116503.
  33. He G, et al. Non-invasive assessment of hair regeneration in androgenetic alopecia mice in vivo .using two-photon and second harmonic generation imaging. Biomed Opt Express. 2023;14(11):5870-5885.
  34. Chu X, et al. Functional regeneration strategies of hair follicles: advances and challenges. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):77.
  35. Fu D, et al. Dihydrotestosterone-induced hair regrowth inhibition by activating the androgen receptor in C57BL6 mice simulates androgenetic alopecia. Biomed Pharmacother. 2021;137:111247.
  36. Köhler C, et al. Mouse Cutaneous Melanoma Induced by Mutant BRaf Arises from Expansion and Dedifferentiation of Mature Pigmented Melanocytes. Cell Stem Cell. 2017;21(5):679-693.e6.
  37. Nishimura EK, Granter SR, Fisher DE. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science. 2005;307(5710):720-4.
  38. Driskell RR, et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 2013;504(7479):277-281.
  39. Matsumura H, et al. Hair follicle aging is driven by transepidermal elimination of stem cells via COL17A1 proteolysis. Science. 2016;351(6273):aad4395.
  40. Sayama A, et al. Morphological and Biochemical Changes During Aging and Photoaging of the Skin of C57BL/6J Mice. J Toxicol Pathol. 2010;23(3):133-9.
  41. Lynch B, et al. How aging impacts skin biomechanics: a multiscale study in mice. Sci Rep. 2017;7(1):13750.
  42. Liu M, He G, Wang F, Wang Y. In vivo. non-invasive observation of dynamic changes in hair shaft, melanin, and collagen during the C57BL/6 follicle cycle [preprint]. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.09.15.676351.

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