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方法論記事

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

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DOI:

10.3791/70151

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2026年2月24日

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1Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Orthopedics, the Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Department of Sports Medicine of the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

この記事について

サマリー

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。

要約

超分解能顕微鏡(SRM)は従来の光顕微鏡の回折限界を克服し、細胞内構造のナノスケールの可視化を可能にします。しかし、刺激放出消滅顕微鏡(STED)、光活性化局在顕微鏡(PALM)/確率光学再構成顕微鏡(STORM)、構造化照明顕微鏡(SIM)などの技術の広範な採用は、高い光毒性、特殊な試料調製、複雑な操作などの要因によって妨げられることがあります。ここでは、レーザースキャン共焦点プラットフォームとマルチプレックスされた超分解能検出器を活用した包括的なプロトコルを紹介します。このシステムは計算処理と組み合わせることで、同じワークフロー内で共焦点イメージングと超解像度イメージングのスムーズな移行を可能にします。このプロトコルは、高速で高解像度かつ低光毒性のイメージングを実現するためのユーザーフレンドリーなアプローチを提供します。詳細な手法には、多色蛍光、差分干渉コントラスト(DIC)、三次元Zスタック再構築、タイムラプスライブセルイメージング、大面積タイル張り、多重アレイ検出器が提供する様々な超分解能モードなど、マルチモーダルイメージング機能が含まれています。体系的な比較により、超分解能モードは約120 nmの横分解能を達成し、従来の広視野顕微鏡の回折限界より約2倍の向上し、同一プラットフォーム上の標準的な共焦点操作と比べて解像度と信号対雑音比(4〜8倍)が大幅に向上していることが示されています。また、この技術の持続可能な運用を支援するために不可欠な共有資源管理モデルの重要なポイントも議論しています。この統合ガイドは、生命科学研究においてこのアクセスしやすい先端イメージング技術を活用し、最大限に活用したい新規・経験豊富な研究者や施設管理者にとって貴重なリソースとなります。

概要

動的な細胞内構造の可視化は、生命科学研究の進展に不可欠です。しかし、従来の光学顕微鏡の解像度は回折によって横方向約200 nmに制限されており、動的な細胞内プロセスの分解能を制限しています。この障壁を克服するために、さまざまな超分解能技術が開発されています。しかし、STED顕微鏡、PALM/STORM、SIMなどの技術は、高い光毒性、特殊な蛍光色素や試料調製の必要性、複雑なアライメント手順、集中的な計算処理など、複数ユーザー環境での普及に障壁となることが多いです。

この文脈で、多重アレイ検出器を備えた共焦点顕微鏡システムは、多重化素検出と計算再割り当てによる超解像度イメージングを可能にする強力な代替手段を提供し、技術的な閾値4を大幅に下げます。この手法は、32元素のガリウムヒ素リン化物(GaAsP)検出器アレイを活用し、各走査点からより多くの光子を収集します。その後のインテリジェントなデコンボリューションアルゴリズムはこの情報を再割り当てし、検出ボリュームを効果的に減少させます。このプロセスは横方向で約120 nm、軸方向で約350 nmの空間分解能を達成し、広視野顕微鏡の回折限界を約2倍に向上させ、同じ機器の標準共焦点モードと比べて信号対雑音比を4〜8倍向上させます。この高解像度、優れた信号品質、一般的な蛍光ラベルやプロトコルとの互換性という独自の組み合わせが、広範な応用における主な利点となっています。

その結果、このアクセス可能な超解像度顕微鏡は生命科学研究に広く応用され、細胞小器官の形態、細胞骨格動態、ウイルスと宿主の相互作用、分子共局在の詳細な研究が可能となりました。固定細胞および生細胞の両方で7,8。その比較的穏やかなため、ライブサンプルの長時間のタイムラプス観察に特に適しています。

このような先進的なシステムをコア施設に統合することはアクセスの民主化に不可欠ですが、持続可能で効果的な運用には独自の課題があります。浙江大学医学院のような機関の中核施設では、最適なパフォーマンスとインパクトは三つの柱に大きく依存しています:(1) 標準化され再現可能な画像診断プロトコル、(2) 厳格な定期メンテナンス、(3) 共有アクセスのための効果的な管理フレームワーク。初期システム9のイメージング手法や一般的な施設管理原則10,11など、特定の側面には貴重なリソースがありますが、現代の多重アレイ検出器プラットフォーム向けに詳細で再現可能なプロトコルと実証済みの共有リソース管理モデルを統合した包括的なガイドは現時点で不足しています。本プロトコル記事は、このギャップを埋めることを目的としています。

全体的な目標は、共有リソース環境下で多重アレイ検出器を用いた共焦点システムを効果的に実装・活用するための包括的なステップバイステップガイドを提供することです。It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical;施設管理者はそのようなサービスを確立または最適化しています。ここでは、システム構成、マルチモーダルイメージングプロトコル(多色、3D、ライブセル、タイル、超分解能モードをカバー)、そして実証済みの共有管理モデルを体系的に詳細に説明します。この統合ガイドは、この強力な画像診断手法の可能性とアクセス可能性を最大化するためのリソースとして機能します。

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プロトコル

生物学的サンプルを含むすべての実験は、浙江大学医学院コア施設の指針と規則に従って実施され、機関バイオセーフティ委員会(承認証明書番号)によって承認されました。BSL20235710079)。

注意:細胞培養に関わるすべての手技は、特に指定がない限り、クラスII生物安全キャビネット内の無菌条件下で行われなければなりません。このプロトコルは顕微鏡システムが設置され、レーザー出力が校正されていることを前提としています。主要な試薬、消耗品、機器(例:イメージングアンテナ、カバーガラス、マウント媒体)に関する詳細な仕様と推奨ベンダーは材料 表に記載されています。

1. サンプルの調製

注:超分解能イメージングの成功は最適なサンプル準備から始まります。高品質な厚さ1.5mm(0.17mm)のカバーガラス製イメージングアンテナの使用は、高NA油浸水対物レンズの補正カラーに合わせ、球面収差を防ぐために不可欠です。すべての遠心分離工程は、特に記載がない限り300× g で5分間行うべきです。

  1. 多色超分解能イメージング(例:COS7セル)のための固定セルサンプル準備
    注:このプロトコルは、図1に示すように、4',6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール(DAPI)核染色を用いた微小管(Alexa Fluor 568)およびミトコンドリア(Alexa Fluor 488)の免疫染色を説明しています。
    1. 5%CO2加湿インキュベーターで、5%CO2 加湿インキュベーターで10%胎児用牛血清(FBS)を37°Cで添加したDulbecco's改変Eagle培地(DMEM)でCOS7細胞を培養します。
    2. 35mmガラス底イメージングアンテナに1.0 ×105 セル/ディ皿のプレートセルを装填します。細胞が付着し、60〜70%のコンフルーシティ(通常は24時間)まで成長させてください。
    3. 培養培地を吸引し、事前に温めた(37°C)リン酸塩緩衝生食塩水(PBS)で細胞を優しく洗浄します。細胞を固定し、PBSに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を1mL加え、室温(RT)で15分間培養します。
    4. PFA溶液を吸引し(有害廃棄物として処理)細胞を2mLのPBSで3回洗い、1回の洗浄で5分間ゆっくりとゆっくりと抱卵します。
    5. 透過化およびブロッキング:細胞をRTで30分間、1mLの透過化・ブロッキングバッファー(0.1% v/v)トリトンX-100、1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)をPBSで30分間培養します。
    6. 一次抗体培養:抗体希釈バッファー(PBS中の1%BSA)を抗体希釈バッファー(PBS中の1%)で4°Cで1〜2時間(RTで1〜2時間)に基づき、α-チューブリン(マウスモノクローナル)とTOMM20(ウサギ多クローナル)の一次抗体の混合物で細胞をインキュベートします。ガラス面を覆うために、1皿あたり300μLを使いましょう。
    7. 洗浄:一次抗体溶液を慎重に吸引します。細胞を0.05%トゥイーン-20(PBST)を含む2 mLのPBSで3回、1回5分間洗浄します。
    8. 二次抗体および核染色:蛍光二次抗体とDAPIを抗体希釈バッファー(1% BSA/PBS)に混合し、光から保護します。
      1. Alexa Fluor 568に結合したロバ抗マウスIgG(1:500)とAlexa Fluor 488に結合したロバ抗ウサギIgG(1:500)を使用してください。
      2. 核染色には最終濃度1 μg/mLのDAPIを含みます。この混合物を300μL細胞に塗布し、暗闇でRTで1時間培養します。
    9. 最終洗浄:染色液を吸引し、細胞を2mLのPBSで3回洗い、1回5分洗います。
    10. マウント培地を塗る:イメージング皿からPBSを慎重に吸引し、サンプルをわずかに湿らせておきます。すぐに、硬化したフェード防止マウンティングメディウム(例:ProLong Gold)をガラス底部に直接少量(~20 μL)塗布します。
    11. カバーと硬化:#1.5の高精度カバーグラスを泡を避けながら、滴の上に優しく下ろします。マウントをRTで暗闇の中、またはより速い乾燥が必要な場合は37°Cで2〜4時間硬化させます。
  2. タイムラプスイメージングのための生細胞サンプル調製(例:蛍光タンパク質タグを発現するHep3B細胞)。
    注:このプロトコルは、ミトコンドリアを標的とした蛍光タンパク質(例:EGFP)を安定的に発現するHep3B細胞の画像診断を記述しています。
    1. 10%FBSを補足した最小必須培地(MEM)でHep3B細胞を培養します。プレートセルを35mmガラス底のイメージングアンテナ(1.5枚のカバーガラス)に、密度0.8 × 10⁵セル/皿で配置します。最適な健康と画像密度(通常18〜24時間)を得るために、細胞を約70〜80%の合流率まで成長させてください。
    2. 画像診断準備:画像検査当日、標準培養培地を2mLの前平衡(37°C、5%CO2 、少なくとも30分間)、フェノール赤色フリー、低蛍光イメージング培地に10%FBSおよび必要に応じて25 mM HEPESバッファーを補足し、CO2 インキュベーター外でpH安定化を行います。これにより背景蛍光が最小限に抑えられ、画像撮影中の生理的なpHが維持されます。
      注意:環境チャンバー内の予温め顕微鏡ステージで少なくとも30〜45分間、アンテナを順応させてからタイムラプス取得を開始し、温度、焦点、細胞の健康状態の安定化を確保してください。

2. 顕微鏡システムの起動、初期化、基本アライメント

  1. 顕微鏡メインユニット、レーザー発射モジュール(405、488、561、640nmの固体レーザーを含む)、LED光源、制御コンピュータに電源を入れます。
    1. レーザーを温めて安定させて少なくとも15〜20分待ちましょう。これは特に定量的またはタイムラプス実験において、安定したレーザー出力に不可欠です。
  2. 顕微鏡のオペレーティングソフトウェアを起動してください。
  3. メインインターフェースから「Microscope」>「Initialize」を選択するか、ソフトウェアの起動ウィザードに従ってください。
  4. ソフトウェア内で「取得」パネルに移動します。対物レンズのドロップダウンメニューから「Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Oil 」または実験に適した対物レンズを選択してください。
  5. 対物レンズの前面に浸漬油(屈折率=1.518)を直接滴します。気泡の導入は避けてください。
  6. ライブセルイメージングの場合は、撮影の少なくとも45〜60分前に環境チャンバーとアクティブフォーカス安定化システム(例:「Definite Focus」>)を作動させます。温度は37°C、CO2 は5%、湿度は>60%に設定します。システムが安定するまで待ってください。チャンバーセンサーで安定性を確認してください。
  7. システムはこれでサンプルのローディングとイメージングパラメータの設定が完了しました。

3. 多色蛍光イメージング

  1. 準備済みのサンプルを顕微鏡ステージに置きます。ステージを慎重に持ち上げ、カバーガラスが浸漬油に触れるまで行います。
  2. 取得ソフトウェアで「取得」タブを操作し、「 新しい実験を作成」を選択します。
  3. 使用される蛍光色素に対応する複数のイメージングトラック(チャネル)を追加します。 図1の例では、次のように構成します:
    1. トラック1(DAPI):励起405nm、検出410-480nm。
    2. トラック2(Alexa Fluor 488):励起488 nm、検出495-550 nm。
    3. トラック3(Alexa Fluor 568):励起561 nm、検出570-620 nm。
  4. 各トラックについて、共焦点ピンホール直径を 1エアリー単位(1 AU)に設定します。
  5. 以下の反復プロセスを用いて各チャネルのレーザー出力と検出器利得を最適化します:
    1. 最初のチャンネル(例:DAPI)を選択します。「ライブ」スキャンモードに切り替えてください。
    2. 初期レーザー出力を低く設定します(例:0.1〜0.5%)。 検出器利得 を線形範囲内で適度なレベル(例:GaAsP PMTの場合は700 V)に設定します。
    3. レーザー出力を徐々に上げ、ライブ画像の背景の上にターゲット構造がはっきり見えるまで続けます。
    4. ヒストグラム表示を開いてください。ピクセル彩度がないことを確認してください(ヒストグラムが右端に重なっていないこと)。必要ならレーザー出力を下げてください。
    5. 検出器利得を調整して明るく低ノイズの画像を実現します。過度なノイズを防ぐために850V以上のゲインは避けてください。
    6. 残りの蛍光チャネルに対して3.5.1-3.5.5の手順を繰り返します。
      注意:レーザー出力、利得、ピクセル滞留時間をバランスよく調整し、信号対雑音比を最大化しつつ光損傷を最小限に抑えましょう。ライブセルの場合は、低消費電力と短い滞留時間を優先してください。
  6. 画像フォーマット(画素数)とピクセル停留時間を設定します。
    1. ピクセルサイズをナイキスト基準(ピクセルサイズ≤(解像度 / 2.3)を満たすように設定します。標準的な共焦点イメージング(横方向解像度~250 nm)では、ピクセルサイズ≤108 nm)を設定します。
    2. ソフトウェアの「ナイキスト 」サンプリングボタンを使って、もし可能であれば自動的に計算してください。
    3. ピクセル停留時間を設定してください。より高い信号対雑音比を得るには、より長い滞留時間(例:1.0〜2.0μs)を、より速いイメージングのためには短く(例:0.5〜1.0μs)を用いましょう。
  7. クロストークを最小限に抑えるために、トラック間で「シーケンシャルスキャン」モードを選択してください。
  8. 「スタート」をクリックすると、単一の画像を取得します。関連するメタデータとともに画像を保存してください。

4. 微分干渉コントラスト(DIC)イメージング

  1. 取得ソフトウェアの「取得」タブで「新しいチャンネルを追加 」を選択し、透過光検出の設定を行います。
  2. ソフトウェア内で適切な透過光検出器(しばしばT-PMT(透過光増倍管)またはESID(外部システムインターフェース検出器)と呼ばれる)を選択します。
  3. DICプリズムおよび偏光子構成:
    1. ハードウェアコントロールパネルまたはソフトウェアインターフェースから、目的合わせのDICプリズムを選択します(例:63倍対物レンズは「DIC III」)。
    2. 選択したプリズムを光の経路に挿入します。
  4. 最適なコントラストを得るために偏光フィルターとDICスライダーを調整してください:
    1. アナライザー(偏光フィルター)を回転させ、ライブ画像の背景が暗く見えるか非常に暗くなるまで調整します。
    2. ライブ映像を観察しながら、DICスライダーの位置を少しずつゆっくり調整してください。
    3. 細胞の特徴(例:膜や核)が、中立的な灰色の背景に対して明確な影の投影や疑似三次元的なレリーフで現れるまで最適化します。
  5. DICの照明波長を可視光範囲(例:488 nmまたは546 nm)に設定します。
  6. 透過光チャネルの透過強度(レーザーまたはランプの出力)と検出器ゲインを調整し、飽和のない鮮明な画像を実現します。
  7. DIC画像を取得しろ。

5. 三次元再構築のためのZスタック取得

注意:Zスタックを定義する前に、すべてのイメージングパラメータ(レーザー出力、利得、ピンホール、ピクセルサイズ)をセクション3で説明した単一の最適な焦点面上で設定してください。これにより、すべての光学セクションで一貫した設定が確保されます。

  1. 「取得」タブで「Zスタック」モードを選択します。
  2. 関心の量を定義します:
    1. 高速ライブスキャンを使い、関心のある最上部の構造物に注目してください。
    2. 「最初に設定」(または「トップ」)をクリックしてください。
    3. 関心のある最も下の構造に注意深く焦点を合わせてください。
    4. 「最後に設定」(または「ボトム」)をクリックしてください。ソフトウェアは総深度を表示します。
  3. Zステップサイズを軸方向のナイキストサンプリング基準を満たすように設定します。(通常はdr/2.3、ここでdr は軸方向分解能です)。63倍/1.4 NAのオイル対物レンズなら0.3〜0.4 μmを使います。
  4. あるいは、ソフトウェアの「最適」または「ナイキスト」ボタンを使ってステップサイズを自動的に計算することもできます。
  5. 各チャンネルに対して、第3節で説明したようにイメージングパラメータ(レーザー出力、利得、ピンホール=1 AU)を設定します。弱い信号については、単一の2D画像と比べてレーザー出力や利得をわずかに上げることを検討してください。
  6. 画像スタック全体を収集するために取得を開始します。
    注:総取得時間 = (1スライスからのフレーム時間) × (スライス数)
    特にライブサンプルの場合は、それに合わせて計画を立ててください。
  7. 3D再構築と可視化:
    1. ソフトウェアの「Processing」モジュール(例:3D投影機能)を使うか、ImageJ/Fijiのような専用ソフトで画像スタックを開くことができます。
    2. すべてのピントが合った信号を単一の2D画像で表示するために、最大強度投影(MIP)を生成します。
    3. 真の3D表現にはボリュームレンダリングを適用してください。明るさ、不透明度、照明は必要に応じて調整してください。
    4. 直交視点(XZおよびYZ断面図)を生成し、軸方向の広がりとレジストレーションを検査します。

6. 生細胞のタイムラプスイメージング

  1. 1.2節に記載された生細胞を準備します。そして、環境チャンバー内の予熱された顕微鏡ステージにアンテナを取り付けます。
  2. サンプルを少なくとも45〜60分間順応させ、セクション2.6に記載されているように安定化を確保してください。
  3. 健康で間隔の良いセルがある視野角に移動し、セクション3.5で最適化されたパラメータで高品質なスナップショットを単一取得します。
  4. アクティブフォーカス安定化システム(例: Definite Focus や類似)を作動させます。これは熱漂流を補うための長期実験において絶対に譲れません。
  5. 「取得」タブで「時系列」モードを選択してください。
  6. 速度、解像度、光毒性のバランスに基づいて適切なイメージングモードを選択します。
    1. 動的でないプロセスで最大の空間分解能を得るには、「SR」(スーパーレゾリューション)モードを選択してください。
    2. 多くの細胞小器官の力学に適したバランスを求めるには、「SR 2 Y 」または「SR 4 Y 」(加速超分解能モード)を選択してください。
    3. 超高解像度なしで非常に高速なイメージングを望む場合は、「Confocal」または「Co 2 Y」モードを選択してください。
  7. 実験タイムラインを定義する:実験の総時間と連続するフレーム間の時間間隔(Δt)を設定します。(例:ミトコンドリア運動性は5〜30秒)
  8. 光損傷を最小限に抑えるためのイメージングパラメータの最適化:
    1. 検出可能な信号が得られる最も低いレーザー出力から始めましょう。
    2. 検出器の利得を線形範囲(600-850 V)内で調整し、レーザー出力増加よりも利得を優先して実用的な信号レベルにします。
    3. 画質要件に適合する最速のスキャン速度(最短ピクセル滞留時間)を選びましょう。
  9. タイムラプスの取得を始めてください。最初の数フレームはフォーカスの安定性やセルの健康状態を監視してください。

7. 大面積タイルスキャンイメージング

  1. 「取得」タブで「タイルスキャン」モードを選択してください。
  2. tilingRegionを定義するには、以下の2つの方法のいずれかがあります。
    1. レイアウトベース:X方向とY方向のタイル数を指定します(例:3×3)。
    2. ROIベース:「ライブ」画像の上に手動で長方形を描き、関心のある領域を定義します。ソフトウェアは自動的に必要なタイルの数を計算します。
  3. 隣接するタイル同士の重なりを10〜15%に設定します。
    注:この重複は、ソフトウェアのステッチングアルゴリズムがシームレスな合成画像を作成するのに十分な情報を提供します。
  4. 静止画像と同様に、単一のタイルに対してレーザー出力、利得、解像度などの画像パラメータを設定してください。
    注意:非常に大きなタイル部分の場合は、総取得時間を実用的に保ち、光漂白を最小限に抑えるために、より高速なスキャンモード(例:『Co 2 Y』)の使用を検討してください。
  5. タイルの取得を開始しましょう。ソフトウェアが自動的にタイルを取得し、縫い付けます。
  6. 取得後は、特にタイルの境界付近で縫い付けた画像を注意深く調べて、アーティファクトがないか確認してください。必要ならソフトウェアの手動縫い調整ツールを使ってください。

8. 多重アレイ検出器を用いた超分解能イメージング

  1. 「取得」タブでモードセレクターに移動し、「スマートセットアップ」 をクリックして「Airyscan」モードを選択してください。次に、多重アレイ検出器の動作モードとして「スーパーレゾリューション」を選択します。
  2. 実験の優先順位に基づいて特定の取得モードを選択してください:
    1. 「SR」モード:可能な限り高い空間分解能(~120 nmの横方向)を実現します。固定サンプルに使用。
    2. 「SR 2 Y」モード:解像度と速度のバランスを提供します。
    3. 「SR 4 Y」モード:最高速の超分解能モード(理論上最大~25fpsの線速度)、ライブセルイメージングに最適化され光線量を最小限に抑えられています。
    4. 「Co 2 Y」モード:超分解能が不要な場合でも、共焦点に近い撮影速度と信号対雑音比の向上を提供します。
      注:分解能値(例:120 nm)は理想条件12におけるシステム仕様です。実際の分解能は試料準備、信号対雑音比、適切な処理に依存します。
  3. イメージングパラメータ(レーザー出力、検出器利得)を設定します。
    1. ライブセルイメージングでは、光損傷を減らすために共焦点モードよりも低いレーザー出力から始めてください。
    2. 暗く固定されたサンプルの場合、十分な信号対雑音比を得るためにより高いレーザー出力や利得が必要になることがあります。
    3. 「ライブ」モードでクリーンで高コントラストの画像を生成できる最小レーザー出力を見つけてください。
  4. ピクセルサイズと滞留時間を設定します。
    1. 拡張解像度をキャプチャするには、ピクセルサイズをナイキスト基準を満たすように設定します。ピクセルサイズ≤(希望解像度 / 2.3)。SRモード(ターゲット120 nm)では、ピクセルサイズを≤~52 nmに設定します。
    2. ソフトウェアの「最適」または「ナイキスト」ボタンを使って、利用可能な場合は自動的に計算してください。
  5. 画像を入手してください。生データは多重化された信号を含み、まだスーパーリゾリューションされていません。
  6. 取得したデータを処理して超分解能を達成する:
    1. ソフトウェアの処理モジュールに進みます。
    2. データセットを選択し、「SuperResolution Processing」機能を選択してください。
    3. まずは「自動」設定から始めましょう。低SNRデータの場合は、アーティファクトを生まずにシャープネスを高めるために「強度」と「ノイズフィルター」を手動で調整してください。
    4. (任意)特に3Dスタックで最高の忠実度を得るために、追加のジョイントデコンボリューション(jDCV)ステップを適用してください。
    5. 処理を実行してください。処理済みと未処理の映像を比較し、実際の詳細の強化を確認しましょう。
  7. (任意)モード間の信号対雑音比(SNR)の定量的比較のために:
    1. 同じサンプルを異なるモードで画像取得します。
    2. 解析ソフトウェアでは、均一な構造上に関心領域(ROI)を定義し、平均信号強度を測定します。
    3. 背景ROIを定義し、背景強度の標準偏差を測定します。
    4. SNR = (平均信号) / (背景の標準偏差)を計算します。
  8. (任意)蛍光ビーズを用いた経験的システム分解能測定:
    1. 100nm蛍光ビーズのサンプルを準備します。
    2. ナイキストサンプリングを用いてSRモードで孤立ビーズのZスタックを取得します。
    3. スタックをスーパーレゾリューション処理と(オプションで)jDCVで処理します。
    4. ソフトウェアの「PSF測定」 ツールを使って3Dガウスをフィッティングし、全幅の半分最大値(FWHM)を記録します。

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結果

多色蛍光イメージング
固定されたCOS7細胞の多色蛍光イメージングはセクション3で説明した通り実施されました。αチューブリン(微小管)およびTOMM20(ミトコンドリア)に対する抗体をDAPI核染色と共に使用しました。 図1に示すように、核(青)、ミトコンドリア(緑、Alexa Fluor 488)、微小管(赤、Alexa Fluor 568)が高特異性と最小限のスペクトルクロストークで明確に区分され、逐次走査の有効性と検出設定の最適化が証明されました。

蛍光と差分干渉コントラスト(DIC)の統合
蛍光チャネルとDICイメージング(セクション4)を重ね合わせることで、文脈的な形態情報が得られました。 図2は、蛍光信号と正確に重ね合わせた細胞の特徴の特徴的なシャドウキャストリリーフを持つ高コントラストのDIC画像を示して...

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ディスカッション

ここで提示される統合プロトコルは、多重アレイ超分解能検出器を備えた現代的な共焦点顕微鏡システムの高度なイメージング機能を持続可能な共有資源フレームワークの中で実装するための包括的なロードマップを提供します。このセクションでは、この手法の重要な側面、実用的な実装、そしてバイオイメージング分野におけるその位置を総合的にまとめます。このプロトコルの成功裏の実行は、いくつかの重要なステップにかかっています。まず、綿密なサンプル準備が基本です。高解像度互換基板(例:#1.5カバーガラス)と最適化された免疫染色プロトコルの使用は、超分解能処理に必要な信号の完全性と低い背景を得るために不可欠です。取得時には、ライブフィードバックとナイキストサンプリング基準に基づき、レーザー出力、検出器利得、ピクセル滞留時間の慎重なバランスが重要であり、信号対雑音比を最大化し、光損傷を最小限に抑えるために重要です。これは特にライブセル用途において重要な考慮事項です。最後に、多重化アレイ検出器ベースのモードで...

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開示事項

著者たちは競合する金融的または非財務的利害関係を一切表明していない。著者たちは、この原稿の準備中に言語の磨き上げとフォーマットの支援としてDeepSeekを利用しました。

謝辞

著者らは浙江大学医学院コア施設からの技術支援に感謝し、ヒト肝がんの肝細胞肝細胞Hep3Bサンプルを提供してくれた姚耀中氏に感謝します。この研究は浙江省自然科学基金(LZ25H060002)、浙江大学実験技術プロジェクト(SYBJS202321)、浙江省教育局(Y202351321)、農農農業部動物ウイルス学重点研究所の公開研究プロジェクト(202201)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 COS7セルATCC(または類似)CRL-1651アフリカアオモンキー腎線維芽細胞株。多色超分解能イメージング用の固定セルサンプルの準備に使用。
 ドンキー抗マウスIgG、Alexaフルオ568共役体インビトロジェン(または類似)A10037微小管染色のための二次抗体。1:500希釈で使用されます
 ダルベッコs修正イーグル培地(DMEM)、高血糖Gibco(または類似)11965092COS7細胞の標準培養培地に10%のFBSを補足。
 胎児用牛血清(FBS)、熱不活化Gibco(または類似)10082147血清サプリメントはすべての細胞培養培地で10%(v/v)で使用されます。
 ガラス底イメージングディッシュ(35mm、µ-Dish、#1.5ポリマーカバースリップ、厚さ0.17mm)イビディ(または類似)81156細胞板付けおよび画像処理のための基質。高NA油浸水用対物との互換性に不可欠です。
 画像処理および解析ソフトウェア(ZENモジュール)カールツァイスAGZEN 3.5(青)3D再構築、超分解能処理(例:エアリスカン処理)、PSF測定、SNR解析に使用されます。
 ImageJ / フィジーオープンソース該当なし追加の3D再構成、直交ビューの生成、一般的な画像解析に使用されます。
 浸漬油(屈折率=1.518)カール・ツァイス(または類似)444960-0000-000油浸け物レンズ(例:63x/1.4 NA)での使用。
 多重アレイ検出器を備えたレーザー走査共焦点顕微鏡システム(例:ZEISS LSM 900とAiryscan 2)カールツァイスAGLSM 900(エアリスカン2)プロトコルで記述されたすべての共焦点および超分解能モードに使用される主要なイメージングプラットフォームです。
 アールとの最小限の必須媒体(MEM)塩Gibco(または類似)11095080Hep3B細胞の標準培養培地に10%のFBSを補足しました。
 マウス抗アルファタブリンモノクローナル抗体(クローンDM1A)シグマ・オルドリッチ(または類似)T6199微小管の標識用一次抗体。1:500希釈で使用されます
 パラホルムアルデヒド(PFA)、PBS中の4% ジンパン (または類似の)TBS5083細胞用の固定液。室温で15分間使用してください。適切な予防策を講じて対処してください。
 フェノールレッドフリーイメージング培地Gibco(または類似)21063029低自己蛍光培養地で生細胞イメージングに使用されます。前平衡状態で5%のCO2で37°使用前のC。
 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1X、pH 7.4CellWorld(または類似)C0162-311プロトコル全体を通じて洗浄および希釈緩衝材として使用されました。
 プロロングゴールドアンチフェードマウントインビトロジェン(または類似)P36930固定試料中の蛍光を保存するための硬化マウンティングメディウム。
 トライトン X-100シグマ・オルドリッチ(または類似)T8787細胞透過化のために0.1%(v/v)で使用されます
 トゥイーン-20シグマ・オルドリッチ(または類似)P9416抗体インキュベーション後の洗浄工程にPBS(PBST)で0.05%(v/v)で使用。
牛血清アルブミン(BSA)、フラクションVシグマ・オルドリッチ(または類似)A7906PBS中で1%(w/v)でブロッキングおよび抗体希釈バッファーの成分として使用されます。
DAPI(4フィート、6-ジアミジノ-2-フェニリンドール)シグマ・オルドリッチ(または類似)D9542核のカウンターステイン。最終濃度1 & マイクロで使用されます。g/mLです。
ドンキーアンチウサギIgG、Alexaフルオ488共役インビトロジェン(または類似)A21206ミトコンドリア染色のための二次抗体。1:500希釈で使用されます
蛍光マイクロスフィア(ビーズ)、直径100 nmInvitrogen(例:TetraSpeck&trade)や類似のものT7279システムの経験的測定に用いられる」点拡散関数(PSF)と分解能。
EGFPミトコンドリアを安定的に発現するHep3B細胞イモセルIM-H367ミトコンドリアマトリックスを標的としたEGFPを安定的に発現させるよう設計されたヒト肝腫瘍細胞株。ライブセルのタイムラプスイメージングに使用されます。
HEPESバッファ溶液、1 MGibco(または類似)15630080CO2インキュベーター外でのライブイメージング中のpH安定化のために、最終濃度25 mMのイメージング培地で使用されます。
高精度カバーガラス(#1.5、厚さ0.17mm)マリエンフェルト(または類似)107052固定サンプルの取り付けに使用されます。
顕微鏡オペレーティングソフトウェア(例:ZENブルーエディション)カールツァイスAGZEN 3.5(青)システム制御、画像取得、基本的な処理に使用されます。
対物レンズ:プランアポクロマット 63倍/1.40 NA オイルダイックカールツァイスAG421462-9900-000高解像度イメージングの主な目的。
ウサギ抗TOMM20ポリクローナル抗体Abcam(または類似)ab186735ミトコンドリア標識のための一次抗体。1:1000希釈で使用。

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