方法論記事

in vitro 植物由来分子が従来の殺生物剤に与える増強効果の評価

DOI：

10.3791/70172

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2026年5月8日

 ,  ,  , 
1LEPABE, ALiCE, Faculty of Engineering, University of Porto, 2DEQB-Department of Chemical and Biological Engineering, Faculty of Engineering, University of Porto, 3LAQV/REQUIMTE, BioSIM, Department of Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Porto, 4Department of Chemical Engineering, Faculty of Science and Technology, University of Coimbra

この記事について

サマリー

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本プロトコルは、細菌殺菌活性モデリングと組合せ相互作用アッセイを用いて、微生物制御を改善し全体的な殺菌剤使用量を減らす相乗効果を特定することを目的とした、植物化学物質が従来の殺菌剤の殺菌効果をどのように強化できるかを評価する体系的な枠組みを提供します。

要約

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従来型殺菌剤の抗菌活性を高める革新的かつ効率的なアプローチの開発は、医療用殺菌目的での微生物制御改善に向けた有望な戦略です。この文脈で、植物由来の植物化学物質が合成生物殺菌剤に対する増強効果を評価する詳細なプロトコルを記述します。これらの植物由来製品は、構造的多様性、生物活性、そしてしばしば毒性が低いことから、バイオサイドアジュバントとして魅力的な候補です。ここで説明するワークフローは、最小殺菌濃度(MBC)の決定と、個別に試験された各製品(生物殺滅剤および植物化学物質)およびそれらの二重または三重組み合わせに対する用量反応曲線および時間応答曲線の体系的な生成を可能にします。得られたデータは、分数殺菌濃度指数(FBCI)の算出や、Combenefitというソフトウェアを用いてテスト製品間の相乗効果、加成作用、または抗抗効果の評価を含む高度な数学的モデリングを可能にします。その意味で、有望な天然製品を殺菌剤強化剤として特定し、抗菌効果を最適化し、合成殺菌剤の濃度を低減する可能性のあるより持続可能で安全な消毒戦略を設計することが可能です。これにより微生物の制御が改善され、過剰なバイオサイド使用に伴う環境および公衆衛生リスクを最小限に抑えます。

概要

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医療関連感染症(HAI)は、世界で最も重要かつ憂慮すべき公衆衛生上の課題の一つです。驚くべきことに、これらは多剤耐性(MDR)微生物の拡散や、しばしば不適切なまたは効果のない消毒手法により病院表面に細菌のバイオロードが残留していることと強く関連しています(2,3)。さらに、患者、医療スタッフ、医療機器間の交差汚染がこの問題をさらに悪化させます。例えばヨーロッパでは、約8万人の入院患者が毎日少なくとも1回のHAIに苦しみ、年間約1,600万日の追加入院日数に相当すると推定されています2。COVID-19パンデミックはこの問題をさらに複雑化させ、抗菌剤・消毒剤の過剰使用と入院の増加によりMDR細菌感染の急増に寄与しています(6,7)。拡張スペクトラムβラクタマーゼ(ESBL)産生性大腸菌やメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)などの抗生物質耐性細菌の増加は、世界中で健康および経済的負担を増大させています。実際、これらの株は感染予防と制御のための革新的な解決策開発の緊急性を強調しています1,8,9。

このことを踏まえ、バイオサイドは耐性菌や細菌感染の拡散を制御する重要なツールとなり、病院表面の消毒、機器の滅菌、水道システムの処理、医療機器の汚染防止などに広く使用されました。抗生物質が特定の微生物標的に作用するのに対し、生死剤は膜、酵素、リボソームRNA、代謝経路など複数の細胞構造を同時に破壊します(13,14,15)。この広範囲の行動は当初、耐性のリスクを減らすと考えられていました。しかし、微生物は生物殺菌剤曝露に適応し、耐性、持続性、さらには抗生物質に対する交差耐性につながることを示す証拠があります10,16。例えば、シプロフロキサシンやノボビオシンに耐性を持つベンザルコニウム塩化物への曝露は、排出ポンプの過剰発現によるもの17。同様に、トリクロサンはステノトロフォモナス・マルトフィリアで排出ポンプを活性化することが示されており、クロルヘキシジン曝露はS. aureus18で抗生物質耐性の増加と関連しています。

さらに、四季アンモニウム化合物(QAC)、クロルヘキシジン、ジアミジン、アクリジン、トリクロサンが、いくつかの抗生物質に対する細菌耐性の選択と持続性の原因として示唆されています19,20。qacA/Bやsmrなどの耐性遺伝子はQACに対する耐性を与えることが知られており、汚染されたQAC溶液に保管されたカテーテルに関連する菌血症や、ヨードフォルの内在微生物汚染などの臨床的失敗も報告されています(16,17,21)。これらの発見は、メカニズム的研究や合理的な消毒戦略によって支持される、バイオサイド利用の最適化の緊急性を強調しています。

バイオフィルムは、細胞密度が高く構造が整った細菌群集で、多糖類、タンパク質、核酸の細胞外マトリックスに埋め込まれており、感染制御に対するさらに重大な障害となります22,23。彼らは抗生物質や殺生物剤に対して驚くべき耐性を示し、感染の持続に寄与しています。さらに、バイオフィルムは医療機器、手術器具、病院表面の持続的な汚染ともしばしば関連しています。臨床的重要性にもかかわらず、バイオフィルムが慢性感染症や抗菌薬耐性の主要な要因として認識されるのは近年になってからです。その強靭さは非常に強力で、攻撃的な消毒剤でも根絶できず、感染を再播種できる持続細胞が残ります。したがって、効果的な抗バイオフィルム戦略を見つけることは、HAIの制御とMDR病原体の公衆衛生および経済的負担軽減に不可欠です。27,28。

有望な解決策として、植物から生成・抽出される二次代謝物である植物化学物質は、新規抗菌剤および抗生物質剤のほとんど未開発の資源を代表しています29。しかし、従来の抗生物質に比べて抗菌活性が控えめなため、植物化学物質は抗生物質として使用されません。植物化学物質は、感受性試験により抗菌剤として分類され、最小阻害濃度(MIC)が100〜1000 μg/mLの範囲で、従来の抗生物質よりもはるかに高い値を示しています30,31。重要なのは、植物化学物質が単独または従来の生物殺死剤の増強剤として使用した場合に、すでに抗生物質活性が示されていることです。例えば、ケルセチンはアルギン酸の生成を抑制し、バイオフィルム発生時の接着を低下させる可能性があります 32,33,34。エモディンは、バイオフィルム形成に関与する主要遺伝子の発現を減少させることで、P. aeruginosa、E. coli、S. aureusによるバイオフィルムの発生を抑制しました35。植物化学物質を、従来使用されながら効果が低下している生物殺菌剤と組み合わせることは、抗菌効果を高める有望な戦略です。このような相乗効果は微生物の耐性機構を妨げ、満足のいく消毒に必要な殺虫剤の最低有効濃度を低下させる可能性があります。このアプローチは殺生物性能を最適化し、抵抗性発生のための選択圧を低減し、過剰な殺死剤使用に伴う生態学的および毒性学的影響を軽減します15,20。植物化学物質は構造的に多様で、38,39,40、広く入手可能で、安価で38,39,42、そして合成生物殺菌剤よりも人間や環境への毒性が低いことが多いです。.これらはしばしば再生可能な植物由来の天然産物であり、場合によっては特定の合成生物殺滅剤と比較して環境の持続性が低く、毒性プロファイルが低いと報告されています(43,44,45)。コスト、入手可能性、毒性プロファイルは化合物や抽出プロセスによって異なりますが、いくつかの植物化学物質は従来の生物殺滅剤と比較して安全性や環境特性が良好であることを示しています(46,47)。

このプロトコルは、植物化学物質を個別および従来の殺生物剤と組み合わせて医療用消毒に提供する可能性を評価することを目的としています。簡単に言えば、このプロトコルは広範な濃度範囲にわたる生物殺菌剤と植物化学物質の相互作用を評価します。バイオサイドは当初0.1〜500 mg/L、植物化学物質は50〜10,000 mg/Lで試験され、最小殺菌濃度(MBC)を決定しました(表1)。二重組み合わせでは、亜殺菌濃度が選ばれました:塩化ベンザルコニウム(BAC)は0.1、0.5、0.75 mg/L、過無糖酸(PAA)は0.1、0.3、0.5 mg/Lで、サリチル酸(SAL)は50、100、250 mg/Lで、そしてユーゲノール(EUG)は100、250、750 mg/L(表1)。三重組み合わせは、BAC(0.75 mg/L)またはPAA(0.5 mg/L)とSAL(100または250 mg/L)およびEUG(250または750 mg/L)を組み合わせて実施されました(表1)。1〜90分間の時間反応アッセイを実施し、その後24時間の細菌再増殖評価を行いました。抗菌薬相互作用は、殺菌成分指数(FBCI)を用いて定量化し、Combeneソフトウェアで解析されます。一方、消毒動力学はChick-WatsonモデルおよびWeibullモデルを用いて濃度依存性および不活化動態を特徴付けています。

この革新は、植物化学物質とバイオサイドの安定した二重および三重相互作用を合理的に設計し、従来のバイオサイドの使用減少による毒性や環境負荷を最小限に抑えつつ、消毒活動を最適化することにあります。また、微生物制御における植物化学物質と生物殺除剤の相互作用を定量化するために、FBCIの計算やシナジー評価などの数学的手法も用いられました。FBCIは特定の濃度の組み合わせにおける相互作用(シナジー、アンタゴニズム、または無関心)をカテゴリー的に解釈するのに対し、Combeneはより広範な濃度範囲にわたる相互作用パターンの反応面に基づくより包括的で評価を可能にします。これにより、単点指数では捉えられない濃度依存的な相互作用効果の可視化と定量化が可能になります(48,49)。さらに、消毒速度論はChick-Watson(線量応答)およびWeibull(時間応答)モデル50を用いてモデル化されています。これらのモデルは微生物の不活化の動態学的モデリングを提供し、消毒率や生存曲線挙動を表す定量的パラメータを提供します。これらは殺菌が対数線形動力学に従うか非線形的かを特徴づけ、FBCI51,52の記述を超えた治療効果のより機構論的な解釈を可能にします。

このプロトコルは、有望な植物化学・生物殺除剤の組み合わせの体系的な同定と、効率的で持続可能な医療用消毒戦略の開発を保証します。静的なエンドポイント測定を提供する従来のMICやチェッカーボードアッセイとは異なり、このプロトコルは動的殺菌モデリングと相互作用解析を統合し、増強の大きさと動態を捉えます。古典的なチェッカーボードアッセイはMICエンドポイントに基づく抑制相互作用に関する貴重な情報を提供しますが、成長測定や単一相互作用指標に限定されています。ここで述べるプロトコルは、増殖抑制ではなく殺菌活性を定量化し、治療後の再成長を評価して持続的な抗菌効果を評価し、二重および三重の生物殺菌剤・植物化学物質の組み合わせを評価し、Chick-WatsonおよびWeibull手法による消毒動態のモデリングを行い、Combenefitを用いた濃度反応面解析を適用します。この多次元戦略により、生物殺菌剤と植物化学物質の増強効果のより堅牢かつ予測可能な評価が可能になります。

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プロトコル

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注:提案された方法論は、欧州標準EN 127653から適用されています。

1. 培養調製

  1. 検査された細菌株である大 腸菌株(Escherichia coli CECT 434)および 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus CECT 976)は、グリセロール30%(v/v)を-80°Cのクライオビアルに保存することで凍結保存します。
  2. 回復のためには、プレートカウント寒天(PCA)プレートで細菌を培養し、25°Cで24時間培養して培養させます。
  3. 研究対象株の一晩培養培養を、トリプティック大豆ブロス(TSB)に縞模様の入ったプレートから細菌コロニーを接種し、指数関数的な成長段階に到達させ(次のステップで得られた校正曲線に従い)、振動インキュベーターで100rpm、25°Cで培養します。
  4. 分光光度計を用いて、前述の培養条件下で各細菌株の600 nm(OD600)におけるコロニー形成単位(CFU)/mLの比較曲線を取得します。
    1. TSBで25°Cで攪拌(100rpm)で一晩細菌培養を行います。
    2. 無菌生理食塩水(0.85% w/v NaCl)で10倍の連続希釈液を準備します。
    3. 分光光度計で各希釈のOD600 を測定します。
    4. PCAでは適切な希釈をプレートで行ってください。プレートは25°Cで24時間培養します。
    5. 10から100コロニーのプレートを選び、対応するCFU/mL値を決定します。
    6. CFU/mL値を線形範囲(0.04–0.8)内のOD600 の値と照らしてプロットします。
    7. 少なくとも2回の独立したアッセイを行い、少なくとも2回のレプリケートを行ってください。校正式を求めるために線形回帰解析を行います。
    8. 得られた方程式を使って、その後の実験で細菌濃度を推定します。
  5. 接種を3772 x g で10分間遠心分離し、リン酸緩衝生塩水(PBS)(NaCl 8 g/L、KCl 0.2 g/L 、Na2HPO4 1.44 g/L、KH2PO4 0.24 g/L で洗浄します)。
  6. 分光光度計を用いて、PBSで接種点のOD600 を1 x 108 コロニー形成単位(CFU)/mLに調整します。

2. 分子溶液の調製と制御

  1. 検査分子の選択、研究、調製は以下の通りです:2種類の生物殺菌剤(BACとPAA(15%(w/v))と2種類の植物化学物質(SALおよびEUG 99%)を使用します。
    注:BACは、膜破壊を通じて細菌に対して効果的である広く使われているQACであるため、本研究で選ばれました。過酢酸は広域の酸化性消毒剤であり、医療器具の滅菌にますます利用されている56,57。サリチル酸は、抗菌および抗生物質膜活性を示し、細菌の病原性や抗生物質耐性機構に影響を与えるため、消毒や微生物制御に関与する可能性を示唆するフェノール化合物として注目されています(58,59)。ユージノールは天然のテルペノイド/フェノール芳香族化合物であり、抗菌特性が認められており、合成消毒剤のより安全で環境に優しい代替として機能します60,61。
  2. 超純水で新鮮なBACとPAAを準備します。
  3. 溶解したEUGとSALはジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解され、細胞がDMSO濃度5%を超えないよう保証されました。
  4. 表1に基づき、BAC、PAA、EUG、SALの濃度を調製してください。
  5. 15 mL遠心分離機管で、ストック溶液の体積と細胞懸濁液を調整して、最終的な分子濃度と細胞密度を得て試験濃度を準備します。
  6. 以降のすべてのアッセイでは、2つのネガティブコントロールを含める:(i) 処理なしの細菌、(ii) 5% DMSO曝露された細菌(これはアッセイ全体で細胞が曝露される最大DMSO濃度)。

3. 生物殺菌剤または植物化学物質への細菌曝露

  1. 細胞懸濁液1mLを超純水1mLに加え、2分間待ちます。
  2. 次に、8mLのバイオサイドまたは植物化学溶液(超純水または5% DMSOで)を加え、振動インキュベーターで100rpm、25°Cで30分間培養します。
  3. 化合物を細胞と混合させて渦を巻きます。

4. 中和、連続希釈、メッキ

  1. 各濃度に対して、希釈中和法およびユニバーサル中和剤(ポリソルベート80、サポニン30g/L、L-ヒスチジン1g/L、レシチン3g/L、チオ硫酸ナトリウム5g/L)を0.0025 Mリン酸バッファーに中和します。
  2. 中和されるサンプル1 mLを8 mLのユニバーサル中和剤と1 mLの超純水53を加えます。
  3. 特定の希釈物100μLを滅菌生理食塩水900μLに加えて次の希釈を行う(希釈10-1 から希釈10-7まで繰り返し)。中和サンプル上の生存細胞をドロッププレート法62に従ってPCAに10μLずつメッキして決定します。
  4. 細胞数のために25°Cで攪拌せずに24時間培養します。
  5. CFUは10個以上または100個未満のコロニーを含むプレートの目視でカウントされ、培養性が完全に低下する濃度はMBCとして記録されました。 式(1)に従い、 CFU/mLを計算します。 ここでn は計上されたCFUの数、 SV はメッキされた試料体積(0.01 mL)、 Dil はCFUがカウントされた希釈量です。
    CFU/mL = n/(SV Dil)( 1)
  6. 式(2)に従って対数還元、対数還元を評価します。ここでX0とXは、未処理細菌(対照群)と処理済み細菌のCFU/mLです。
    log reduction = log (X0) - log (X) = log (X0/X) (2)

5. 二重および三重の組み合わせ評価

  1. 上記の方法論を適用して、1つのバイオサイドと1つの植物化学物質(デュアル組み合わせの場合)または2つの植物化学物質(三重組み合わせの場合)のすべての二重および三重組み合わせの活性を評価し、増強や相乗効果の可能性を探します。
  2. 以下の濃度の選択を考えてみましょう。二重の組み合わせでは、BACの濃度が0.1、0.5、0.75 mg/Lでした。PAAは0.1、0.3、0.5 mg/Lでした。SALは50、100、250 mg/Lでした。EUGは100、250、750 mg/Lでした(表1)。三重組語について、BACの濃度は0.75 mg/Lでした。PAAは0.5 mg/Lでした。SALは100mg/Lと250 mg/Lでした。EUGは250mg/Lと750mg/Lでした(表1)。
  3. 濃度を選択し、非殺菌効果をもたらす個々の分子の用量反応アッセイで評価された濃度を選びます。

6. 細菌の再増殖評価

  1. 細菌の再増殖能力を評価するために、処理と中和後に微生物細胞を液体培地で25°C、100rpmでさらに24時間増殖させます。
  2. 同じ技術と条件を用いて、10倍の連続希釈、メッティング、PCAプレートのインキュベーション、CFU/mLの定量を行います。

7. 組合せ結果の解釈 – フラクショナル・バクテリア濃度指数(FBCI)

  1. 組合せ分析の結果を次のように解釈します。
    1. 二重結合の場合、FBCI = FBC(A) + FBC(B)となり、ここでAの殺菌成分(FBC(A)は、Aの二重結合時のMBCとA単独のMBCの比率(MBCAの組み合わせ/MBCA単独)であり、FBC(B)はB単独のMBCとB単独(MBCBの組み合わせ/MBCB単独)の比率を示します(式3)。
    2. 三重組み合わせの場合、FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C)。ここでFBC(A)は、三重組み合わせのAのMBCとA単独のMBC(MBCAの組み合わせ/MBCA単独)の比率、FBC(B)は三重の組み合わせBのMBCとB単独のMBCの比率(MBCBの組み合わせ/MBCB単独)です。 FBC(C)は、三重組み合わせ時のCのMBCとC単独のMBCの比率(MBCCの組み合わせ/MBCC単独)です(式4)。
    3. Fernandesらが提案した分類を適用すると、FBCI≤0.5は相乗効果、0.54.00はアンタゴニシムみなされます。
      FBC(A) + FBC(B) = (MBC デュアルコンビネーション/MBCA単独) + (MBCB デュアルコンビネーション/MBCB単独) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (MBCA トリプルコンビネーション/MBCA 単独) + (MBCB トリプルコンビネーション/MBCB 単独) + (MBCC トリプルコンビネーション/MBCC 単独) (4)

8. 時間応答アッセイの手順

  1. 前述の成長条件(セクション1)に従って、 E. coli CECT 434および S. aureus CECT 976の夜間培養を準備します。
  2. 細胞懸濁液1mLを超純水1mLに加え、2分間待ちます。この時点で、各分子の所定濃度(1/4×MBCおよびMBC)および細菌懸濁液(OD調整による)を100rpm・25°Cで、8mLの殺菌剤/植物化学溶液(超純水または5% DMSOで)を加えます。 分子と細胞を渦巻きで混ぜます。
  3. 曝露時間は1、3、5、15、30、45、60、90分の評価です。
  4. 第4節で述べたように、対数(CFU/mL)減少をlog (X/X0)として計算して抗菌活性を評価します。
  5. 各濃度・時間ペアに対して、希釈中和法およびユニバーサル中和剤(シリアル希釈・メッティング)を用いて生死または植物化学的中和を行います。これは前述の第4節で述べたものです。

9. Combeneというソフトウェアを用いた組合せデータの解析

  1. 提供されたファイル「REPLICATE_TEMPLATE.xls」を https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/ で開いて、正しい構造とフォーマットを確認してください。
  2. 補 足表1 に従って、データをマトリックスに整理します。ここで:
    1. 製品Aの濃度を上から下へ(最も低い行から高い行へ)増加させます。製品Aには少なくとも3つの異なる濃度を含めること。
    2. 製品Bの濃度を左から右へ(番号付きカラムの下から大きい順に増やす):製品Bには少なくとも3つの異なる濃度を含める。
    3. 上段(0 mg/L 製品A)を単剤製品Bを表します。
    4. 最初のカラム(0 mg/L 製品B)を単剤製品Aを表します。
    5. (0,0)セルを未処理コントロールと同じように表します。
    6. 各ケースで使用される値を正規化します。式 (5)を用いて、 treat_0h は特定の処理のログ(CFU/mL)で、曝露直後(0h)に適用されます。 treat_24h は、曝露後24時間(再発)後の特定の治療のログ(CFU/mL)です。 control_0h 、対応する対照群(5% DMSO曝露された細胞のみ)のログ(CFU/mL)で、曝露直後(0時間)です。 control_24h は、曝露(再増殖)から24時間後の対応対照群(細胞または5% DMSO曝露細胞のみ)のログ(CFU/mL)です。
    7. すべての場合において、PCA上で24時間のプレート培養後にCFU列挙を行います。
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h)100 (5)
      注:100%の生存可能性を定義する対照群/未治療状態と、最大阻害を定義する陽性対照(任意)を含めること;数値のみを使用し、数式は使わず;レプリケートごとに同じ数の行と列を使用します。小数点には「.」を使いましょう。
  3. ファイルを.xlsまたは.xlsxとして保存してください。
  4. 各レプリケートごとに、前述および 補足表1と同様にExcelファイルを作成し、すべてのファイルを同じフォルダに追加します。
  5. ソフトウェアCombenefit(Cancer Research UK ケンブリッジ研究所、ケンブリッジ、バージョン2.021、https://sourceforge.net/projects/combenefit/ で利用可能)を起動してください。
  6. そのフォルダをCombenefitにアップロードしてください。
    1. ソフトウェアを開いてCombenefitを開いてください
    2. プロジェクトフォルダ選択ボタンを押して、正しいフォルダを選択してください。
    3. 参照モデルの選択:両方の生成物の正確なメカニズムを仮定するローヴェ加法;独立した行動を仮定する至福独立性、すなわちHASは保守的なモデル(最良の単一エージェントと組み合わせを比較)です。最良の方法は、少なくとも2つのモデルを使い、最良のモデルを選ぶことです。
    4. この場合、テスト分子の作用機序を考慮してブリスモデルが選ばれました。
    5. Synergy分布のために少なくとももう一つ選ぶ必要があることを知りつつ、希望するグラフィック出力を選択してください。
    6. プレスラン分析(補足図1)。ヒント:分析中の保存を選択してください。すべてのグラフィック出力を元のフォルダに保存するために「Everything」を選択してください。

10. チック・ワトソンモデルとワイブルモデルを線量および時間反応データに適用

  1. インポート前にExcelまたはCSVでデータセットをフォーマットしてデータを準備してください:用量反応については、A列が用量(濃度、mg/L)、列Bがログ(X/X₀)に対応します。時間応答データでは、A列が時間(分)、B列がログ(X/X₀)に対応します。
  2. ファイルを「.csv」に保存するか、Prismに直接コピー&ペーストしてください。
  3. Open GraphPad Prism(使用バージョン:Windows 11用9.0;アメリカ合衆国カリフォルニア州ラホヤ)。
  4. 新しいテーブルとグラフでXYを選択し、データテーブルで「新しいテーブルにデータを入力またはインポートします」(補足図2参照)。
  5. オプションでXを選択し、Yを選択し「並列のサブカラムに複製値を入力」を選び、「作成(補足図2)」を押してください。
  6. Xに線量・時間データを入力し、Yに生存データをログ入力します。
  7. 分析の非線形回帰(曲線適合)に行き、解析したいデータセットを選択してOKボタンを押してください(補足図2参照)。
  8. 「新作」を選択してから「新しい方程式を作成」とします。
  9. 方程式の方程式タイプとして、明示的な方程式を選びます:Y = Xとパラメータの関数;名前にはChick-Watson Model/Weibull Modelと書いてください。定義ではY = -a*x^(n)*30 Chick-Watsonモデル(補足図3)と書く。Y = -1/(2.303)*(x/a)^(b) Weibullモデル(補足図4)を記入する。
    注:チック・ワトソンモデルは式6で表されます。ここでX0とXは未処理細菌(対照群)と処理済み細菌のCFU/mL、Cは濃度(用量)、kdisは不活化率係数、Cは濃度(用量)、nは濃度指数、tは曝露時間(この場合は 30分)50分。チック・ワトソンモデルを用いて、用量反応を観察し、消毒剤濃度と微生物還元との関係を特徴づけました。
    log (X/X₀) = -kdis ·Cⁿ ·t (6)
    注:ワイブルモデルは式7で表されます。ここでX0とXは未処理細菌(対照)と処理済み細菌のCFU/mL、tは時間、αはスケールパラメータ(特性時間)、βは形状パラメータ50です。ワイブルモデルは時間反応の観察と生存曲線の形状の特徴付けに適用されました。スケールパラメータは不活性化の特性時間を表し、形状パラメータは対数線形挙動からの逸脱を示します(β = 1対数線形;β<1尾部;β>肩が1つ)。
    log (X/X0) = -1/2.303 (t/α)^β (7)
  10. 初期値の役割では、すべてのパラメータの初期値を0、(適合すべき初期値)をルールとして選びます(補足図5参照)。
  11. 他の設定はデフォルトにしてOKボタンを押します。
  12. フィットを実行し、推定されたパラメータを調べます。

11. 生物学的複製

  1. すべてのアッセイに対して、少なくとも2つの独立した実験を行い、少なくとも2つの重複を行ってください。

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結果

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本研究では、BAC、PAA、SAL、EUGの4つの化合物の殺菌活性を大腸菌CECT 434およびS. aureus CECT 976に対して評価しました。図1および図2に示されているように、BAC、PAA、SAL、EUGは培養性に濃度依存的な効果を示しました。表2は、曝露後および曝露後24時間(再生能力評価)の検査分子のMBC値を示しています。BACでは、大腸菌および黄色酵母の両方で3 mg/L≈ CFU低下(6 log CFU/mL減少)は認められませんでした。PAAは両細菌に対して1 mg/Lの完全不活化を達成しました。植物化学物質の中で、SALは500 mg/Lで大腸菌および黄色酵母に対して完全な殺菌活性を示したのに対し、EUGは同様の結果を得るためにそれぞれ1000 mg/Lと1700 mg/Lを必要とし...

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ディスカッション

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本研究で提示されたプロトコルは、一般的に使われる2種類の生物殺滅剤であるBACとPAA、および有望な植物化学物質であるEUGとSALの殺菌活性を、個別および組み合わせ(二重および三重組み合わせ)で、大腸菌および黄色酵母に対して評価するための統合的な枠組みを提供します。このプロトコル内のいくつかのステップは、抗菌相互作用の再現性と正確な解釈を確保するために特に重要です。これには、細菌接種物の標準化、バイオサイドおよび植物化学溶液の精密な調製と取り扱い、曝露時間と温度の厳格な管理、そして下流の動態モデリングおよび相乗解析のための正確なCFU列挙が含まれます。このフレームワークは、従来の殺菌アッセイと再成長評価、組み合わせ試験、キネティックモデリングを組み合わせることで、即時および長期の抗菌効果の包括的かつ定量的な特性評価を可能にします。しかし、このプロトコルの正確かつ効率的な使用を確保するために、いくつかの側面を考慮することがあります。まず、細菌接種物の標準化と試験分子の溶液の慎重に調製することが再現性に不可欠です。BACはポリマリック実験器具やマイクロプラスチック表面に非...

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開示事項

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著者たちは、本記事の執筆において競合する金銭的利益や利益相反はなく、開示すべき情報もないと宣言しています。

謝辞

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この研究は、欧州委員会が資金提供したProject InnovAntiBiofilm(参照101157363、Horizon-Widera 2023- Acess-02/Horizon-CSA)によって支援されました。プロジェクト・ムルタンチバイオフィルム(参考文献:COMPETE2030-FEDER00852000;番号17121)およびHCAI_Disinfect(参照番号COMPETE2030-FEDER-00752300;第16360号)は、運用プログラム競争力要因(COMPETE)および科学技術財団(FCT)による国家資金で資金提供されています。LEPABE, UID/00511/2025(https://doi.org/10.54499/UID/00511/2025 年)およびUID/PRR/00511/2025(https://doi.org/10.54499/UID/PRR/00511/2025 年)およびALiCE, LA/P/0045/2020(https://doi.org/10.54499/LA/P/0045/2020 年)は、FCT/MCTES(PIDDAC)を通じて国家資金によって資金提供されています。リスボン(ポルトガル)もまた発表しました。マリアナ・スーザの博士課程奨学金(2023.00337.BD 年;https://doi.org/10.54499/2023.00337.BD 年)はFCTによって提供されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
塩化ベンザルコニウム メルク、スペイン8.14363.0100バイオサイド
遠心分離メガスター600RVWR、アメリカVWR メガスター600R-
Combenefit - バージョン 2.021がん研究英国ケンブリッジ研究所、ケンブリッジ、イギリス-シナジズム評価のためのソフトウェア
キュベットVWR、ドイツVWRI634-0678光学密度調整用の1.5 mLキューベット
デスティラテッド・ウォーター--メディア準備のために
ジメチル硫酸塩(DMSO)VWR、フランス23500.322有機溶媒
使い捨て接種ループVWR、イタリアVWRI612-935710 & mu;L接種ループ
エッペンドルフ管VWR、中国VWRI525-11641.5 mL エッペンドルフ安全ロックチューブ 
<エム>大腸菌スペイン語タイプ文化コレクション(CECT)434本研究で使用された基準株
エタノールVWR、フランス83813.36作業、材料、手の分解のために
ユージノール 99%シグマ・オルドリッチ、アメリカ163333植物化学
ファルコンチューブVWR、アメリカVWRI525-108515 mLファルコンチューブ
ファルコンチューブVWR、ベルギーVWRI525-110950 mL ファルコンチューブ
GraphPad Prism 9.0 for Windows 11アメリカ合衆国カリフォルニア州ラホヤ-数学的および統計解析のためのソフトウェア
レシチンアルファ・アーサール、ドイツQ04A010-
L-ヒスチジンメルク、アメリカ1.04351.0025-
オービタルインキュベーターVWR、アメリカVWR 5000I インキュベーティングシェーカー 230V-
過酢酸 15%AppliChem、ドイツ143495-1211バイオサイド
ペトリ皿VWR、イタリアVWRI391-0582-
ピペット1 - 10 mLVWR、アメリカ-
ピペット100 - 1000 & μ;LVWR、アメリカ-
ピペットの先端は100 - 1000 & mu;Lフリラボ、ポルトガル1-202-50-0-
ピペット20 - 200 & ミュー;LVWR、アメリカ-
ピペットチップ 1 - 10 mLVWR、ベルギーVWRI613-7094-
ピペットの先端2 - 200 & mu;LメキシコのVWRVWRI613-6418-
プレートカウントアガーVWR、ベルギー84608-0500微生物の分離と培養
ポリソルベート80VWR、アメリカ20E2756726-
塩化カリウム - KCl VWR、ベルギー11D110008-
二水素リン酸カリウム - KH2PO4VWR、ドイツ26931.263-
サキシン酸シグマ・オルドリッチ、アメリカ84210-500G植物化学
サポニンVWR、ドイツ21A124103-
塩化ナトリウム - NaClVWR、ベルギー27788.297-
リン酸ナトリウム - Na2HPO4VWR、ベルギー28026.26-
チオ硫酸ナトリウム - ナ<サブ>2S<サブ>2O<サブ>3VWR、アメリカ18D2056589-
分光光度計VWR、アメリカUV-1600PC分光光度計光学密度調整
黄色ブドウ球菌スペイン語タイプ文化コレクション(CECT)976本研究で使用された基準株
トリプティック大豆ブロス メルク、ドイツ1.05459.0500微生物の分離と培養
超純水--サンプル調製のために

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