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方法論記事

マウスおよびラットの背側大動脈および腸系膜抵抗動脈のワイヤー筋学

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DOI:

10.3791/70186

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2026年2月27日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

マウスおよびラットから分離された導管動脈と抵抗動脈の血管反応性を評価するためのサイドバイサイドワイヤーミオグラフィーの詳細なプロトコルを提供します。

要約

ワイヤーミオグラフィーは、孤立した動脈の血管機能を定量的に評価するために広く用いられている 生外 法です。大きな導管動脈と小さな抵抗動脈は構造や生理学的役割が根本的に異なるため、同じマウスやラットから採取した動脈を用いて両血管クラスを並行して分析することで、動物間変動を減らし、血管特異的な機能変化を明らかにするペア比較が可能になります。本記事では、アイソメトリックワイヤーミオグラフィーを用いて、孤立したマウス導管および抵抗動脈における血管反応性を評価するためのステップバイステッププロトコルを提示します。新鮮で酸素を含んだ生理的緩衝剤の調製について説明します。動脈の区画の慎重な解剖、洗浄、取り付け;そして、能動的な力発生に最適な船長に近い船長を正規化する。標準的な血管収縮剤および血管拡張剤に対する累積濃度-応答曲線を生成するためのトラブルシューティングガイドと実験シーケンスの例を提供しています。このプロトコルにより、内皮筋および平滑筋の機能の両方を定量的に測定でき、高血圧などの血管疾患に関連する血管反応性の血管特異的変化の検出を促進します。

概要

高血圧は血管反応性の変化を特徴とし、例えば内皮機能障害や血管平滑筋の血管収縮症に対する過剰反応を示します。これらの機能的変化は、微小血管の再構築や希薄化と相まって、組織灌流の障害と血圧調節障害に寄与しています2,3,4。分離血管の体外アッセイは、血管の微小環境を正確に制御し、平滑筋および内皮シグナル伝達経路の選択的薬理学的操作を可能にするため、健康と疾患における血管張力を制御する細胞および分子メカニズムを解明する強力なツールです。

孤立した動脈における血管反応性は、ワイヤー筋伝学と圧迫筋学という2つの補完的な生前外技術を用いて一般的に評価されます5,6。ワイヤーミオグラフィーでは、血管リングやセグメントがピンやワイヤーに取り付けられ、等角力は7,8を記録します。圧力ミオグラフィーでは、完全な血管区画をカヌレーションし、定義された腔内圧力に加圧し、血管径はビデオ顕微鏡で追跡されます。ワイヤーマイオグラフィーとは異なり、圧力ミオグラフィーは壁内圧および光内流の制御を可能にします。したがって、抵抗動脈の生体内血行動態環境をより正確に再現し、筋形成性トーン、流動介質反応、血管構造的または力学的特性の研究に一般的に用いられます9,10。逆に、ワイヤーマイオグラフィーは技術的には実装が容易で(カニュレーションやビデオ顕微鏡検査なし)、商用マルチチェンバーシステムによる高スループットを支持し、数十から数百マイクロメートルの直径の小動脈から中動脈で再現可能な薬理学的濃度応答曲線を生成するのに適しています 5,6.したがって、マウスやラットから分離された導管および抵抗性動脈における血管反応性の薬理学的プロファイリングには、ワイヤーミオグラフィーがしばしば好まれます。

導管(大きな弾性)と抵抗(小さな筋)動脈は構造と機能が根本的に異なり、これらの違いは異なる実験的考慮点と終点を生み出します。導管動脈(例:下行胸大動脈)は大量の弾性組織とかなりの平滑筋を含みます。抵抗動脈(例:腸間膜動脈)は比較的大きな滑らか筋と内腔の比率を持ち、末梢抵抗や局所的な自己調節の主要な決定因子です(11,12)。同じ作動薬がこれらの血管床で異なる分子応答を活性化できるため、同じ動物の導管管と抵抗性血管の並べ比較は有益な補完情報を提供します。例えば、導管動脈では、内皮由来の一酸化窒素放出がアセチルコリン(ACh)による血管弛緩誘導の主な弛緩経路です13,14。対照的に、小さな抵抗動脈では、ACは一酸化窒素、プロスタサイクリン、そして重要なことに内皮由来の過分極因子(EDHF)を介して弛緩を誘導します15,16。したがって、同じマウスまたはラットから採取した導管動脈と抵抗性動脈の並列ワイヤーミオグラフィー測定は、血管特異的な機能変化の検出を容易にしつつ、動物間変動を低減するペア比較を可能にします。

ワイヤーミオグラフィーデータの正確な解釈は、生理的塩溶液(PSS)の組成と酸素供給、組織の取り扱いと解剖、マウント技術、最適な安静時のプレテンション(正規化)、浴槽温度、適切な薬理学的コントロールの選択など、一連の技術的変数への注意が必要です.正規化とは、船舶の機械的作動点を設定し、能動力の発生を最適化し、生理的な運用条件を近似する技術的な手順を指します。実際には、大動脈環では固定プレテンション(固定プレテンション)が一般的であり、過剰膨張を防ぎつつ安定した応答を与えるために経験的に決定されます。小さな抵抗動脈の場合、まず等価の壁経圧力100 mmHg(IC100)に対応する内部周囲を決定することで正規化が行われます。その後、血管はこの値の定められた割合に設定され、正規化された内部周囲長(IC1)を確立します。実際には、多くのプロトコルではラットMRAではIC1×0.9付近、マウスMRAではIC100×約1.0に設定されていますが、これらの値は血管タイプ、種、実験目標に応じて調整されることがあります(5,17)。

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プロトコル

以下のプロトコルは、トレド大学健康科学キャンパス動物ケア・利用委員会によって承認されたガイドラインに準拠しています。

注意 始める前に、必ず施設動物ケア・利用委員会(IACUC)および機関バイオセーフティ委員会(IBC)のガイドラインに必ず従ってください。適切な個人用防護具(PPE)の使用;外科用器具やその他の鋭利器具を使用する際の運動ケア;化学物質や生物組織の取り扱いに関しては、関連する安全データシート(SDS)を参照し遵守すること;承認されたレギュレーターと安全な保管を用いて、加圧ガスシリンダーとしてカルボジェンを取り扱います。そして、生物廃棄物および化学廃棄物の処分は、制度的な手続きに従って行われます。

1. PSS/改質クレブス重炭酸塩(Krebs)緩衝液の調製

注:クレブス緩衝成分(最終濃度、pH 7.4):130 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.17 mM MgSO4、1.18 mM KH2PO4、1.6 mM CaCl2、25 mM NaHCO3、5.5 mM グルコース、0.03 mM EDTA。

  1. 大量ストックを準備する:NaHCO3、 グルコース、CaCl2 を除くすべての成分を二重蒸留水に溶かしてストックを作ります。このストックは4°Cで保存してください。
  2. 実験当日、必要なストックの体積(例:1リットル)を分割し、順にNaHCO3、グルコース、CaCl2を加え、炭化物(95% O2/5%CO2)で継続的に酸素供給します。
    注意:カルシウム塩の沈殿を最小限に抑えるために、1 M CaCl2 のストックを4°Cで準備・保存し、必要な量を緩やかに緩衝液に加え、NaHCO3 が完全に溶けた後に連続的にかき混ぜます。CaCl2 添加時(ステップ1.3参照)には炭酸カルシウムの生成を減らすために炭酸塩の泡立ちを維持してください。もし目に見える降水があれば、捨てて新しいバッファーを用意してください。
  3. pH平衡のために、バッファーにカルボゲンを少なくとも20分間バブルさせ、その後pHを測定し、必要に応じてpH 7.4に調整します。
    注:典型的なプレバブルpH≈7.7;継続的な泡立ちはpHを生理的な≈7.4に低下させます。
  4. 新たに調製したクレブスバッファーを充填してマイオグラフチャンバーを準備し、炭酸素で優しく泡立ち始めます。激しい攪拌なしに十分なガス交換を確保するために、泡立ち速度を調整してください。
  5. 新鮮に準備された酸素入りのクレブスバッファーを1つ取っておき、組織解剖用に氷で冷やしてください。残りの酸素緩衝材を37°Cまで温め(炭酸を継続的に泡立てながら)、実験で使用する。

2. 下行胸大動脈および腸間膜アーケードの解離

  1. IACUCのガイドラインに従って動物を安楽死させてください。動物の安楽死と組織採取のタイミングを2時間以内に標準化し、概日リズムの影響を最小限に抑えましょう。
  2. すぐに胸腔と腹腔を正中切開で開き、胸壁を横方向に反射させて心臓と大血管を露出させます。
    注意:標準的な条件下での全身灌流は、誤って内皮損傷を引き起こす可能性があるため避けてください。さらに、腸系膜血管内に血液が保持されることで、動脈と静脈の視覚的識別が強化され、動脈の完全性の評価が容易になります。しかし、一部の病理モデル(例:血栓性疾患)では、閉塞性血栓を除去し内皮損傷を最小限に抑えるために、ヘパリン化された氷のように冷たい生理的緩衝剤を用いた穏やかで低圧の灌流が推奨されることがあります。
  3. 下行胸大動脈を切除しろ。解剖を容易にするために、視覚化を改善するために肺と食道を切除してください。降行胸大動脈を直接掴まないでください。代わりに、大動脈弓や腹周脂肪を優しく持ち上げ、大動脈の下から肋間支動脈を慎重に切断します。下行胸部大動脈が横隔膜を通過する直前に切断し、氷のように冷たい酸素入りクレブス緩衝剤を含むシルガルドコーティングされたペトリ皿に入れます。
    注意:自発的な音色を最小限に抑え、生存性を保つために低温を維持してください。ブラックシルガードは血管解剖のコントラストを増加させます。
  4. 腸系膜アーケード全体を切除しろ。腸間膜アーケードを優しく持ち上げて、腹大動脈から横隔膜に分岐する上腸間膜動脈を見つけます。上腸間膜動脈を近位部で切断し、直接的な血管操作なしで腸間膜アーケードを周囲の結合組織から解放します。腸間膜アーケードを、氷のように冷たい酸素入りクレブス緩衝液を含むシルガードコーティングされたペトリ皿に置きます。

3. ピン筋造影による大動脈環の分離および取り付け

  1. 下行胸大動脈の近位端と遠位端を解離ピンで固定し、血管をまっすぐにします。機械的な損傷を防ぐために、過度の伸ばしは避けてください。
    注意:損傷を最小限に抑えるために、血管壁を通さず、腹周脂肪にピンを置くようにしてください。
  2. 外部光源付きの立体顕微鏡で、細かいヴァンナスハサミと鉗子を使って肺周脂肪と結合組織を慎重に除去します。血管壁の損傷を避けてください。
    注:血管周の腹膜組織が血管緊張の調節に果たす役割を研究することを目的としない限り、肺周脂肪を除去するのが一般的です。
  3. 2mmの大動脈リングを切り、きれいで直角に切開します。穴が開いたり目に見えて損傷しているリングは捨てましょう。可能な限り、動物間で比較可能な場所をサンプリングして変動を最小限に抑えましょう。
  4. 酸素入りクレブスバッファーを含むチャンバー1つをマイオグラフィー装置から切り離し、慎重に立体顕微鏡へ運びます。
    注意:チャンバーを揺らすとトランスデューサーに影響が出る可能性があり、結果が変わる可能性があるため、チャンバーを慎重に持って優しく置いてください。
  5. 立体顕微鏡の下で、マイクロメーターを使って筋図のピンを合わせ、大動脈リングをピンにスライドさせて、腔内表面の操作を最小限に抑えます。
  6. リングを完全に緩めたときのマイクロメーターの読み取り値に注目してください。組織を固定するために軽く伸ばして輸送します。
  7. チャンバーを機器に接続し、容器を元のマイクロメーター測定値に戻します。
  8. すべてのリングが取り付けられた後、チャンバーを37°Cまで加熱し、付属のプローブで温度を監視します(通常37°Cに達するまで20〜30分)。
  9. ユーザーインターフェースで力の読み取り値をゼロにし、データ取得ソフトウェアを起動して記録を開始します。
  10. マイクロメーターを用いて、動脈環に血管に適した固定値に段階的にプレテンションをかけます。
    注:マウス大動脈輪の典型的なプレテンション値は5ミリニュートン(mN)5です。ラット大動脈環のプレテンション値は研究ごとに異なりますが、事前最適化によりこのプロトコルでは10 mNのプレテンションが支持されています18。
  11. 選択したプレテンションで45〜60分間平衡大動脈リングを使い、37°Cクレブスを用いてバッファーを繰り返し変えます。
    注意:大動脈環は部分的に張力が失われることがあり、そのため張力が安定する前にマイクロメーターでプレテンションを何度も微細に再調整する必要があります。
  12. 実験プロトコルを始める前にユーザーインターフェースの力の読み取り値をゼロにしてください。

4. ワイヤー筋写真へのMRAの分離およびマウント

  1. 腸間膜の枝を時計回りにピンで留めて、腸間膜の枝をまっすぐにします。まず盲腸を固定し、小腸を時計回りに連続してピンで固定して、腸系膜の血管を過度に伸ばさずに優しく緊張させます。必要に応じて新しいクレブスに交換して血やゴミを除去してください。
  2. アーケードが放射状に伸びる部位の中央にある上腸間膜動脈を特定します。
  3. 適切なMRAを選んで隔離すること;典型的なターゲット:内径200〜250μm(正規化時に後に決定)。
    注:成体の実験動物では、マウスでは一般的に2次枝、ラットでは3次から4次枝に相当します。枝の順序は上腸間膜動脈からの連続的な分岐によって定義されます。1目枝は上腸間膜動脈から直接発生し、2目目枝は1目目枝から生じ、以下同様に続きます。
  4. 立体顕微鏡下で、付随する静脈を剥離し、ヴァンナスハサミと細かい鉗子を使って肺周脂肪と結合組織を除去します。
    注:MRAは壁が厚く、腔が小さいことで静脈と区別でき、残留した腔内血液の存在によって容易に確認できます。
  5. 動脈を切除する前に、選択した血管に隣接する腸壁を伸ばしている近くの腸ピンを緩めて血管の反動を防ぎます。
  6. 選定されたMRAの全長(> mm)を切除し、きれいで垂直な切断を行います。細かい鉗子を使って動脈の一端を掴み、氷のように冷たいクレブスバッファーを入れたきれいなペトリ皿に移します(通常のシルガルドコーティングされていない皿はその後の取り付けを容易にします)。動脈の損傷を調べてください。腔内血液の存在は、完全性の視覚的評価を容易にします。
  7. 損傷のない部分から約2mmのセグメントを切除します。輸送中に扱った部分や目に見える損傷のある部分は捨ててください。
    注:透明でシルガードコーティングされていない皿を使うことで、皿の下に定規を置いて器の長さを正確に測ることができます。
  8. 取り付け用に2.5cmの40μmステンレスワイヤーを2本用意します。
  9. 細かい鉗子を使い、ワイヤーを一本ずつルーメン内に慎重に通し、両端から十分なワイヤーが突出するようにします。内皮損傷を最小限に抑えましょう。両方のワイヤーを挿入した後、正規化手順で使用するために定規で正確な長さを記録します(ステップ5.2参照)。
    注:これはプロトコルの中でも最も技術的に難しく時間のかかるステップの一つであり、内皮損傷を最小限に抑えるためには忍耐と繰り返しの練習が必要です。最初のワイヤーを挿入した後は、両方のワイヤーをクランプして容器内に進める方が簡単であることが多いです。
  10. 酸素入りクレブスバッファーを含むチャンバー1つをマイオグラフィー装置から切り離し、慎重に立体顕微鏡へ運びます。
  11. 立体顕微鏡の下で、MRA(両端にワイヤーを保持しているもの)を筋写室に移します。マイクロメーターを使って、マイオグラフの顎を合わせてワイヤーの端を顎の間に挟み、動脈が自由に両者の間に浮かぶようにします。
    注意:この段階では、ワイヤーを重ね合わせるようにクランプで固定することが推奨されます。これによりワイヤーが固定され、ねじれを防ぐことができます。
  12. 上部のワイヤーは、ほぼマイクロメートル側の取り付けネジの下に、端を時計回りに巻きつけて固定します。トランスデューサー側の2本目の線も同じことを繰り返します。
    注意:ネジは優しく、しかししっかりと締めてください。ネジが緩すぎると、容器が滑ることがあります。締めすぎるとワイヤーやトランスデューサーが損傷することがあります。最初の端を留めた後、マイオグラフの顎の間の隙間を少し開けてから反対側の端を固定し、ワイヤーの張りが均一になるようにします。
  13. 顎を少し離し、ワイヤーを平行かつ同一平面に整列させ、ほぼ接触するようにします。
    注意:損傷を最小限に抑えるため、すべての配線調整は搭載された船から離れた場所で行ってください。
  14. すべてのMRAに対して繰り返し取り付け。
  15. チャンバーを37°Cまで加熱し、温度(通常20〜30分)を監視します。
  16. 正規化手順を開始する前に、ユーザーインターフェースで力の読み取り値をゼロにしてください。

5. MRAの正規化手順

注意:大動脈リングは固定されたあらかじめ定められたプレテンションで取り付けられます。したがって、別の正規化ステップは実施されません。

  1. データ取得ソフトウェアで正規化パラメータを設定してください: アイピースキャリブレーション=1;ターゲット圧力=13.3 kPa(≈ 100 mmHg);正規化内部周囲(IC1)=ラットMRAで0.9、マウスMRAで1.0;平均時間=2秒;遅延=60秒。
  2. 容器固有のパラメータを正規化モジュールに以下のように入力します:
    1. 組織エンドポイント(mm)については、 a1 = 0 、 a2 = mrimeter (切除時に記録された正確な長さ)を測定した長さを mlimeter と設定します。
    2. 線 径は40μmです。
    3. マイクロメーターの読み取り:容器を装着し完全にリラックスさせた状態で記録した基準マイクロメートル値を入力します。
  3. 正規化手順は、装着済みMRAを50μmずつ段階的に伸ばすことから開始します。伸ばすたびに新しいマイクロメーターの読み取り値を正規化モジュールに入力し、インクリメントの間に60秒待ちます。
    注意:マイクロメートル調整後の急激な張力低下は通常、血管の滑りを示します。取り付けネジは優しく、しかししっかりと締めてください。
  4. 正規化モジュールが静止壁張力(mN/mm)と内周(μm)をプロットし、指数関数的な曲線をフィッティングするのを待ちます。マイクロメーターを使い、張力円周曲線が100 mmHgの等隔線と交わるまで段階的に伸ばし続けます。交差部付近では、血管の過度伸展を避けるためにステップサイズを10〜30μmに減らします。
  5. 曲線が100 mmHgの等隔線と交差する際、ソフトウェアで計算された内部周囲長に注目し、マイクロメーターをモジュールが計算した対応値に合わせて、準備液が目標の正規化された内部周囲長(IC₁)に固定されるようにします。
    注意:曲線フィッティング不良は、組織の長さ、ワイヤー直径、マイクロメートルの読み取り値など、ソフトウェアに誤ったパラメータを入力していることを示すことが多いです。
  6. すべての搭載MRAで正規化手順を繰り返し、37°Cクレブスを用いてバッファーを繰り返し変えて30〜45分間平衡させます。
  7. 実験を始める直前にユーザーインターフェースの力の読み取り値をゼロにしてください。
    注:マウスとラットの主なパラメータの違いは 表1にまとめられています。
パラメータマウスラット
大動脈環の偽価値5 mN10 mN
MRAのターゲットIC1 比率10.9
200-250μm内径における典型的なMRAの分岐順序第2選挙区3位〜4位

表1:マウスとラットの主なパラメータの違い。

6. 実験プロトコル(例示シーケンス)

  1. 生存可能性チェック:脱分極性高K⁺チャレンジ(例:120 mM KCl)で収縮性反応を誘発します。
    注:高K⁺バッファー(KPSS)は、浸透圧を維持するために標準K⁺バッファーからNaClとKClを等モル置換して製製され、95% O2/5%CO2で連続的に酸素供給されます。使用前にKPSSを37°Cまで温めて冷ショックを避けるため、KPSSバッファー組成(最終濃度、pH 7.4):120 mM KCl、14.7 mM NaCl、1.17 mM MgSO4、1.18 mM KH2PO₄、1.6 mM CaCl2、25 mM NaHCO3、5.5 mM グルコース、0.03 mM EDTA。
  2. 安定した受動的基底張力が回復するまで、新鮮な37°Cの酸素付きクレブス緩衝剤で少なくとも3回連続洗浄を行います。
    注:すべての洗浄工程は、浸潤液を完全に除去し、新鮮な37°Cの酸素付きクレブスバッファーに置き換えることで行われます。市販の筋写儀には、筋撮影室を排水する洗浄機能が内蔵されていることが多いです。
  3. フェニレフリン(PE)への累積濃度応答曲線(CRC)を生成し、濃度を増加させる(例:10⁻9 から10⁻4 Mの範囲)。各濃度が停滞するまで待ってから次の濃度を加え、安定した最大濃度に達するまで続けます。
  4. 安定した受動的基底張力が回復するまで、新鮮な37°Cの酸素付きクレブス緩衝剤で少なくとも3回連続洗浄を行います。
  5. 内皮機能の評価:PEを最大濃度以下で前収縮し、反応が安定するのを待ってから、AChによる内皮依存性の緩和(例:10⁻⁹から10⁻⁵ Mの範囲)を評価する。各濃度が停滞するまで待ってから次の濃度を加え、安定した最大緩和が得られるまで続けます。収縮前音に対する緩和率を記録します(ステップ7.4参照)。<70%の緩和を示す調製は除外されます。
    注:高血圧などの血管壁疾患は、内皮機能障害と一般的に関連しており、AC19に対する内皮依存性血管弛緩応答の障害を引き起こすことが多いです。このような条件下では、<70%の緩和を示す調剤を自動的に除外すべきではありません。これは技術的な失敗ではなく、真の疾患関連の内皮機能障害を示す可能性があります。
  6. 安定した受動的基底張力が回復するまで、新鮮な37°Cの酸素付きクレブス緩衝剤で少なくとも3回連続洗浄を行います。
  7. 実験の質問に従い、経路特異阻害剤の有無にかかわらず他の血管活性剤を試験してください。
  8. 実験終了時に、すべての搭載容器を取り外し、8%酢酸ですべてのチャンバーを洗浄し、その後3回の水洗浄を行い、最後にガスタンクと機械の電源を切ります。
  9. 生物廃棄物および化学廃棄物は制度的手続きに従って処分すること。

7. データ分析と報告

  1. 基準定義と記録。血管収縮症の開始直前(例:高K・カウンテン、血管収縮性CRC、または血管拡張剤CRC前の収縮期)の開始直前に基準張力を記録してください。
    注:後続解析では、過去の刺激を十分に洗浄した後、血管収縮症の開始直前(すなわち基準張力=0表示)直前にユーザーインターフェース上の力の読み取り値をゼロにする方が実質的に簡単です。
  2. ハイK⁺チャレンジ。 能動力は次のように計算します:KCl後の最大力 - 基準張力(単位:mN)。能動力を、固定動脈区間の単位長(mN/mm)または断面積(mN/mm 2)に正規化して表します。断面積の測定には、壁厚を決定するために取り付けられた動脈区間の組織学的解析が必要です。
    注意:大動脈環はしばしば停滞しない反応を示すため、すべての調製物で事前指定された時間(例:10分)以内に最大高K⁺応答を測定し、変動を最小限に抑えてください。MRAでは、刺激後数秒以内に最大の高K⁺反応が達成されることが多いです。
  3. 収縮性CRC。 収縮性累積CRC(例:PE)における各濃度について、能動力を次のように計算します。各濃度での能動力を、高K⁺チャレンジによって引き起こされる応答の割合として表します。これらの%値は収縮性CRCのフィッティングに用いてください(ステップ7.5参照)。
    有効力 = 薬剤適用後の最大トーン - 基準張力(単位:mN)
    注:特定の条件により、調製物ごとに最大高K⁺応答にばらつきが生じることがあります(例:平滑筋量の変化や病理による分化状態)。このような状況下で、各濃度での有効力を、装着した動脈区間の単位長(mN/mm)または断面積(mN/mm2)に正規化して表します。
  4. リラクサントCRC。サブマキシマム前収縮(前収縮トーン)後の緩和CRCについては、各濃度でのパーセンテージ緩和を次のように計算します。これらの%値を用いてリラクゼーションCRCのフィッティングを行います(ステップ7.5参照)。
    弛緩=(収縮前音 - 薬剤投与後の音) / (収縮前音 - 基準緊張)× 100。
  5. 曲線フィッティング。 収縮性または弛緩剤累積CRCについては、x軸にlog(作動薬濃度)、y軸に正規化反応をプロットします。非線形回帰を用いて4パラメータのロジスティックモデルでプロットした曲線をフィッティングします。統計的比較のためにEmax (最大効果)とpEC50 (−logEC50)を抽出し、EC50 はEmaxの50%を生成する作動薬濃度を表します。
  6. データ提示:正規化されたCRCを提示してください。曲線上の各データ点に対して、グループ平均±平均標準誤差(SEM)または標準偏差(SD)を用います。代表的な元のトレースを含め、Emax 値とpEC50 値(SEMまたはSD平均)をまとめたパラメータ表±提供してください。
  7. 統計分析:
    1. 実験群間のCRCを、適切な事後検定(例:ボンフェローニ)と二方向重複分散分析(ANOVA)を用いて比較します。しかし、データが欠落またはバランスが取れていない場合は、仮定(球面性、正規性)を確認し、代替手法(例:混合効果モデル)を用いてください。
    2. 2つの実験群間でpEC50とEmaxを無対t検定、または2群以上の実験群を比較する場合は一方向ANOVAを用います。あるいは、分散の均質性や正規性の仮定が破られている場合は、ノンパラメトリック検定を用いることもあります。統計的有意をp < 0.05に設定します。

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結果

マウスやラットから分離された導管および抵抗動脈におけるワイヤー筋伝記の全体的なワークフローを示す概説図は図 1に示されています。マウス胸部大動脈環および2次級MRAの分離および装着の代表画像は、それぞれ 図2 および図3に示されています。ラット大動脈リングとMRAを用いたプリテンションおよび正規化手順を示すソフトウェアのスクリーンショットは、それぞれ 図4A、Bに示されています。

プロトコルに従い、成体の雄C57BL/6Jマウス (図5A,B) または成体のオスのウィスター京都ラット (

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ディスカッション

ワイヤーミオグラフィーは、血管機能を生体外で調べるための強力かつ高解像度のアプローチであり続けています。慎重に実行すれば、この方法は異なる生物学的課題に対応する信頼性の高い定量的エンドポイントを提供しつつ、同一動物内のマクロおよび微小血管床の厳密な比較を可能にします。導管動脈の研究では、脈圧や大動脈硬性に関連する全神経力学や大血管反応性の変化が明らかになり、抵抗動脈実験では末梢抵抗や組織灌流を直接制御する微小血管張力やメカニズムを探ります12,20。構造や生理的役割の重要な違いに加え、導管動脈と抵抗動脈は重要な機能的差異も示します。例えば、血管床および種間で一酸化窒素、プロスタノイド、EDHFが内皮依存的な血管弛緩に明確に寄与するなどです。<...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この活動はNHLBIの助成金(I.O.へのR00 HL153896)とトレド大学からのスタートアップ資金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL円錐遠心分離機チューブサーモフィッシャー・サイエンティフィック14-959-70C
50 mL円錐遠心分離機チューブサーモフィッシャー・サイエンティフィック14-959-49A
酢酸サーモフィッシャー・サイエンティフィックA490-212
アセチルコリンミリポール・シグマA6625-100G
分析的均衡メトラー・トレドMX304
CaCl2サーモフィッシャー・サイエンティフィックC79-500
炭化物(95% O2/5% CO2)エアガスCD USP50
解剖顕微鏡 ツァイスツァイス・ステミ305
解剖ペトリ皿リビングシステム計測DD-90-S-BLK
解剖ピンデンマークのMyo Technology(デンマークのMyo Technology)400626
解剖ツールキットデンマークのMyo Technology(デンマークのMyo Technology)101017キットは、解剖用のはさみ(1つ)、多目的はさみ(1個)、ペトリ皿(5個)、鉗子(3個)、解剖ピンで構成されています。
デュモン #5 - 細かい鉗子ファインサイエンスツール11254-20
EDTAサーモフィッシャー・サイエンティフィックBP2482-500
冷凍庫(-20度;C)サーモフィッシャー・サイエンティフィックTSG2325FA
冷凍ヒンジ付きボックスUSAサイエンティフィック2310-5848
グローブ(ラージ)サーモフィッシャー・サイエンティフィック19-041-171D
グローブ(中型)サーモフィッシャー・サイエンティフィック19-041-171C
グローブ(小サイズ)サーモフィッシャー・サイエンティフィック19-041-171B
グルコースサーモフィッシャー・サイエンティフィックD16-500
グラデーションシリンダーサーモフィッシャー・サイエンティフィック08-572G
GraphPad プリズムGraphPadソフトウェア該当なしデータ分析とグラフィカル表示
塩酸溶液サーモフィッシャー・サイエンティフィックSA48-1
アイスバケツサーモフィッシャー・サイエンティフィック03-395-156
KClサーモフィッシャー・サイエンティフィックP217-500
KH2PO4サーモフィッシャー・サイエンティフィックP380-500
LabChart 8ソフトウェアADインストゥルメンツ該当なしデータキャプチャソフトウェア
実験用冷蔵庫サーモフィッシャー・サイエンティフィックFBG49RPGA
LED光源サーモフィッシャー・サイエンティフィックAMPSILED21
磁気攪拌器サーモフィッシャー・サイエンティフィックFB30786159
磁気攪拌棒(大型)サーモフィッシャー・サイエンティフィック14-513-68
磁気攪拌棒(中型)サーモフィッシャー・サイエンティフィック14-513-61
MgSO4サーモフィッシャー・サイエンティフィックM63-500
マイクロスプーンとヘラサンプリングセットサーモフィッシャー・サイエンティフィックS43322
マイクロ遠心分離機チューブUSAサイエンティフィック1615-5510
ミニマイクロ遠心分離機サーモフィッシャー・サイエンティフィック07-203-954
ミニドライバーサーモフィッシャー・サイエンティフィックNC1349489
マルチワイヤー・マイオグラフシステムデンマークのMyo Technology(デンマークのMyo Technology)DMT 620M
NaCl サーモフィッシャー・サイエンティフィックS271-3
NaHCO3サーモフィッシャー・サイエンティフィックS233-500
pHメーターサーモフィッシャー・サイエンティフィック01-912-351pHメーター、LE420センサー、インストールクイックガイド、pHバッファスターターパックが含まれています
フェニレフリン ミリポール・シグマP6126-5G
ピペットコントローラーサーモフィッシャー・サイエンティフィック01-001-023
ラック入りピペットチップ(10 & micro;L)USAサイエンティフィック1111-3810
ラックのピペットチップ(1000およびマイクロ;L)USAサイエンティフィック1111-2830
ラックのピペットチップ(200 & micro;L)USAサイエンティフィック1111-1810
PYREX再利用可能なメディア保存ボトルサーモフィッシャー・サイエンティフィック06-414-1D
血清学用ピペット(10 mL)サーモフィッシャー・サイエンティフィック02-923-204
血清学的ピペット(25 mL)サーモフィッシャー・サイエンティフィック02-923-205
シングルチャネルマイクロピペットマルチパックサーモフィッシャー・サイエンティフィック13-684-2503つのピペット(0.5-10 & μ;L、10-100 & mu;L、100-1000 & mu;L)
ステンレス鋼線(40 & mu;m)デンマークのMyo Technology(デンマークのMyo Technology)400447
タイマーサーモフィッシャー・サイエンティフィック02-261-840
超純水システムサルトリウスH2O-MM-UV-SET-US(ハリー・ミューム・ブ・エッセ・アス)
ヴァンナス・スプリング・シザーズファインサイエンスツール15000-00
ボリューメトリックフラスコサーモフィッシャー・サイエンティフィック13-756-400
ボルテックスミキサーサーモフィッシャー・サイエンティフィック10-320-807
水浴サーモフィッシャー・サイエンティフィック07-202-155
皿の計量サーモフィッシャー・サイエンティフィック02-202-101

参考文献

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