マウス海馬における厚組織のクライオ電子断層撮影ワークフロー

サマリー

このプロトコルは、高圧凍結(HPF)とワッフル法、低温集束イオンビーム(cryo-FIB)リフトアウト、線量対称の並列取得を統合することで、厚組織のクライオ電子断層撮影(cryo-ET)を標準化し、マウス海馬での再現可能な 現地 解析のための均一な薄い板状およびガラス化標本を得ています。

要約

クライオ電子断層撮影(cryo-ET)は、ネイティブ細胞超微細構造の3D可視化を可能にしますが、厚組織への応用は信頼性の高いガラス化や低スループットのラメラ製剤の不足により制限されています。ここでは、銅箔を用いた「ワッフル」アセンブリを用いて高圧凍結(HPF;~2100バール、解剖から凍結までの時間≤90秒)を統合し、組織を薄くし、クライオFIBリフトアウトを行い、過剰傾斜補償付き120–200nmのラメラへの制御薄化を統合したエンドツーエンドワークフローを提示します。導電性コーティングは標準化されています(スパッター-Pt 30 mA/15秒;カーテンを最小限に抑えるためにGIS上限0.5–1.0μm。自動化された線量対称データ取得(0°、±3°、±6°...±60〜66°まで;ステップサイズは2〜3°;総線量100–150 e⁻/Ų)はPACEtomoスクリプト で 実装され、開始傾斜角はミリング角度と試料の向きから導かれます。AreTomo 3による処理は、モーション補正、CTF推定、アライメント、WBP再構築の機能をほぼリアルタイムで提供します。IsoNetはオプションで欠損ウェッジ異方性を低減することが可能です。サブトモグラム平均法(RELION 4.0)は、FSCカットオフ0.143に基づく解像度報告を行う擬似サブトモグラム戦略に従っています。マウスの海馬で実証されたこのワークフローは、よくガラス化されたサンプルと均一なラメラ(ターゲット厚さ150 ± 40 nm)を日常的に生成し、高スループットのチルトシリーズ収集(通常5〜8分/ティルトシリーズ)を実現します。このプロトコルは、複雑な組織環境から直接現 地 構造生物学を研究するための再現可能な方法を提供します。

概要

クライオ電子断層撮影(cryo-ET)は、高分子複合体や細胞構造を、その自然な水和状態である^1,2,3,4,5を可視化する重要な技術として登場しています。投影画像の傾き系列から三次元体積を再構築することで、クライオETは細胞の文脈と原子レベルの解像度とのギャップを埋め、構造生物学の現場⁶に関する前例のない洞察を提供します。細胞標本⁷(懸浮液中の凍結FIB薄薄細胞や付着細胞を含む)のクライオ電子断層撮影ワークフローは現在確立されていますが、厚く構造的に完全な組織への直接拡張は依然として非常に^{困難です。}特に脳¹¹のような高水分組織では、信頼性の高いガラス化や電子透明層(通常<200 nm)の調製が持続的なボトルネックを引き起こし続け^ます。

組織内のガラス化は、水分含有量が高く熱伝達が限られているため困難です。プランジ冷凍は薄い試料(≤20μm^)には効果的ですが、ほとんどの組織では効果がありません。高圧凍結(HPF)は高圧を加えることで氷の核生成を抑制し、理論上は最大~200μmの試料のガラス化を可能にします。しかし、従来のHPFの効率は組織のガラス化には最適とは言えないことが多いです。結果を改善するために、最近の取り組みでは、凍結前にクライオプロテクタント¹⁴を追加したり、^15,16の膜を機械的に減らすための事前切断(例:ビブラトームの使用)を行うなどの戦略が用い^{られています。}これらの方法はガラス化の質を向上させることができますが、多くの場合、長期間の体外での取り扱いや、天然構造を変化させるリスクのある化学添加剤の使用を伴います。これらの制約に対処するため、本研究はKelleyらが最初に開発した「ワッフル」キャリア戦略を修正し、重要な最適化を導入しました。すなわち、脳組織を2枚の研磨銅キャリアで物理的に圧縮し、凍結前にサンプルを薄めつつ、フィルム状のグリッドと銅箔の間に固定します。この設計は迅速かつ均一なガラス化を促進するだけでなく、機械的安定性を大幅に向上させ、その後の取り扱い時のグリッド破損やサンプル損失を効果的に防ぎ、完全な高品質な凍結組織標本を得るための強固な基盤を築きます。

ガラス化の後も、薄化は処理量と品質の両方において大きな障壁となっています。初期かつ広く採用された技術として、クライオウルトラミクロトミーは多くの基礎的な現地構造研究を可能にします。それにもかかわらず、圧縮や切断アー^{ティファクト}を頻繁に^導入し、構造的な強度を損なうことがあります。これに対し、クライオ集束イオンビーム(クライオFIB)ミリング²¹は、優れた精度と最小限の^{歪みを提供します7,22}。当初は、グリッド上のガラス化サンプルに直接クライオFIBミリングを施し、ラメラ²³を生成していました。しかし、このインサイトアプローチは主に薄い標^本(例:培養細胞や末梢組織領域)に効果的であり、厚くかさばる組織内のより深い構造にはアクセスできません。この深さの制約を克服するために、リフトアウト戦略²⁶が開発され、サンプル内部から関心領域(ROI)をサイト特有的に抽出できるようになりました。その後の方法論的進歩、例えばシリアルリフトアウト²⁷やオングリッドシリアルセクショニング(SOLIST)²⁸は、複雑組織における3D相関ターゲティングのスループット、ラメラー安定性、精度をさらに向上させました。近年では、Tangらによる6面接合法(リフトアウトおよび薄化時の機械的安定化)や、Benjamin C. Creekmoreらによる新しいオングリッドミリング手法(ネイティブ組織の文脈を保持しつつ深部構造へのアクセスを可能にする)など、この分野の革新が進んでいます。²⁹ページ。これらの進歩にもかかわらず、プロトコルは組織タイプごとに効率、再現性、適応性に依然として異なります。これらの最適化を多様な厚組織向けに統合する一貫したパイプラインに統合する、標準化され、容易に再現可能かつ広く適用可能なワークフローの確立には重大なギャップが残っています。

このギャップは、確立された手法から重要な技術的詳細を統合し、それらを一般化されたエンドツーエンドのパイプラインに洗練させることで埋められます。このプロトコルは、堅牢なガラス化のための強化HPFワッフル法を用いるだけでなく、体系的なオーバーチルト補償、標準化された導電コーティング、校正されたミリングシーケンスなど、クライオFIBリフトアウトおよび薄化の最適化ステップを組み込んでおり、ラメラの均一性を高め、アーティファクト(例:カーテン)を減らし、スループットを向上させます。特定の細胞タイプやモデル生物に特化したプロトコルとは異なり、このワークフローは一般化可能性を核として設計されており、実証されたマウスの海馬を超えた比較的柔らかく圧縮されやすい組織を含む幅広い厚く複雑な組織に適応可能な多様なフレームワークを提供します。

氷の損傷や構造的複雑さに敏感なマウスの海馬モデルで実証されたこの統合的かつ一般化されたワークフローは、高品質なラメラ(120–200 nm)を確実に生成し、効率的な傾斜系列取得(5–8分/シリーズ)をサポートします。このベストプラクティスの統合は、一貫性がありアクセスしやすく広く適用可能なプロトコルとなり、異なる生物学的・生物医学的文脈における厚組織研究におけるクライオETの技術的障壁を下げる再現可能な枠組みを提供します。

プロトコル

動物組織を含むすべての手技はSUSTech IACUC(プロトコルSUSTech-JY202501019に準拠しています)。摂政と使用された装備は 材料表に記載されています。

1. サンプルサポートの準備

1. HPFキャリア準備( 図1A参照)
   1. 6mm銅製HPFキャリア(タイプB)をペア取得します。キャリアのどちらかに平らな面があることを確認しましょう。
   2. キャリアの平らな面を濡らしてから挽き始めます。まず、8000番のサンドペーパーを使って元の加工痕を完全に取り除くまで使いましょう。その後、12000番のサンドペーパーに切り替え、前の工程の傷がほとんど消えて均一で滑らかな仕上がりになるまで研削を続けます。 図2 は、研削および研磨工程中のキャリア表面の典型的な画像を示しています。
   3. 柔らかい金属組織クロスとW0.5ダイヤモンドペーストで地面を研磨します。まずペーストを布に塗り、その後1〜2分間円を描くように研磨し、滑らかで非常に磨かれた仕上がりが得られます。キャリアをエタノールでしっかりすすぐ後、蒸留水で研磨剤の残留物を除去します。
   4. 使用前に研磨されたキャリアを1-ヘキサデセンに最低4時間(または一晩)浸してください。
      注:研磨・処理済みのキャリアは1-ヘキサデセンに浸されたまま保管可能です。
      注意:1-ヘキサデセンは可燃性で吸入すると有害です。PPEを着て排気フードで働くこと。
2. TEMサポートグリッド準備( 図1B参照)
   1. 100メッシュの銅グリッドに連続したFormvar/カーボンサポートフィルムを使いましょう。
   2. スパッターコーターを使ってグリッド両側に金をスパッターコートします。電流を50 mAに設定し、各側を120秒塗って約6 nmの層を1辺にします。
3. 銅箔の準備( 図1C参照)
   1. 厚さ1μmの高純度銅箔を入手してください。
      注:銅の熱伝導率は純度によって変わり、純度が低いほど熱伝導率も低下します。したがって、高純度の銅箔(Cu ≥ 99.9%)が必要です。
   2. 円形の穴あけで直径3mmの円盤に銅箔を打ちます。

2. 高圧凍結

1. 10μLの10%ショ糖溶液の滴をきれいなガラス面に置きます。
2. 安楽死したばかりのマウスの海馬を素早く解剖します。約0.5〜1 mm³ の小さな組織片を鋭利なカミソリの刃で切除します( 図1D参照)。
3. 爪楊枝や細かいブラシで、組織をHPFキャリア内の銅支持TEMグリッド(100メッシュ)に移します。2-メチルブタン(イソペンタン)を使って組織を優しく位置に移動させつつ、グリッドへの機械的応力を最小限に抑えます。
   注意:2-メチルブタン(イソペンタン)は非常に可燃性です。点火源のないフームフードで扱ってください。
4. 組織とグリッドを直径3mmの銅箔ディスクで覆います。組み立てを完了するには、2つ目のHPFキャリア(裏向きに)を上に置き、密封された「ワッフル」サンドイッチを形成します( 図1E参照)。
   注意:銅箔はワッフルアセンブリの重要な機械的役割を果たします。これはTEMグリッドと箔本体の間に組織を挟み込みます。組み立て時にはこの構成が優しい圧力をかけ、ガラス化に適した薄く均一な組織スライスを形成します。さらに、取り扱い時の組織損失を防ぎ、高圧凍結時に圧力を分散させることで、グリッド破損のリスクを減らします。凍結後、ホイルはキャリアをガラス化した試料グリッドから分離しやすくします。しかし、この調製方法は機械的圧縮損傷を引き起こす可能性があり、圧力によるアーティファクトに敏感な試料には適さない場合があります。このような試料については、圧縮せずに適切な厚さを得るための代替切断技術、例えばビブラトーム断面処理や試料パンチングを検討すべきです。
5. 製造元の運用プロトコルに従い、直ちに高圧凍結手順を開始してください。目標圧力を~2100バールに設定し、組織剥離から凍結までの合計時間が90秒を超えないようにします。
   注意:解剖から凍結までの全手順は、長期間の 生前 観察に伴う構造的変化を最小限に抑えるため、90秒以内に完了すべきです。脳の組織厚さの範囲は約20〜40μmです。

3. FIBミリングとリフトアウト

注意:クライオステージを備えたデュアルビーム顕微鏡を用いて以下の手順を実行してください。試料温度は全体的に-170°C以下に保ちます。

1. 受信グリッドの準備
   1. リフトアウト手順の最終受信グリッドとして使える新しい300メッシュのゴールドグリッドを入手してください。
   2. 室温の立体顕微鏡下でグリッドを優しくクリップし、対応するクライオFIBオートグリッドリングにクリップします。
   3. 組み立てたオートグリッドは、使用前に約40°Cで維持される乾燥オーブンに直接保管し、霜の蓄積を最小限に抑えます。
      注意:クリッピング中は、グリッドが平らで中央に置かれ、曲がりやずれを防ぐようにしてください。
2. ガラス化組織グリッドの回収と取り付け
   1. 組み立て物を液体窒素(LN₂)に継続的に浸しながら、組織と銅箔を含むガラス化TEMグリッドを周囲の「ワッフル」組立部品から慎重に分離します。
      注意:銅箔スペーサーは通常、グリッドをキャリアから切り離しやすくします。
   2. 予冷処理されたクライオローディング作業台上で、分離組織グリッドをLN₂保護のもとで2つ目のクライオFIBオートグリッドリングに取り付けます。
3. クライオトランスファーシャトルへのグリッドの共同ローディング
   1. 両方のオートグリッドをクライオ転送シャトルの指定スロットに積み込め。
   2. 各AutoGridを、ミリングノッチが外側を向いて垂直になるように配置してください。
   3. 積載したシャトルはLN₂浸漬または予冷却状態を保ち、FIB/SEM顕微鏡に移すまで保管してください。
4. FIB/SEMにおける局在化と導電コーティング
   1. 顕微鏡へのクリオ転送後、低SEM倍率で組織グリッドに移動します。
   2. グリッド表面全体に導電性と保護性のあるコーティングを施します。
      1. グリッド表面にプラチナ(Pt)を30 mAで15秒間スパッターコートします。
      2. ガス注入システム(GIS)を用いて、厚さ0.5〜1.0μmの有機金属性Ptキャップを堆積します。
      3. 30 mAでグリッド表面に最後のスパッターコーティングされたPt層を15秒塗布します。
         注:GIS上限はカーテンアーティファクトを減らすために非常に重要です。
5. 組織ブロックの分離とリフトアウト(参照) 図3)
   1. サイト選択と方向付け
      1. SEM電子ビーム画像を用いて組織グリッド上の選定された関心領域(ROI)へ移動します。
      2. サンプルを前面フライングのために向き付けます。典型的なステージ位置は110°回転、7°傾きに設定されており、この位置はイオンビームへのアクセスに適した角度で試料表面を提示します。
         注:蛍光マーカーがない場合は、事前スクリーニング戦略を用いることができます。この戦略は、標的組織領域を特定し、クライオプロテクタントやその他の非組織成分を含む領域を除外することを目的としています。表面の氷がないと思われる領域を選んだ後、標準的な前面向きで高いビーム電流(例:30 kVで15 nA)を用いて小さな試験溝を研磨し、より低いビーム電流(例:30 kVで1 nA)で研磨します。断面を調べるために電子ビームに切り替えると、組織は電子ビームの下で優れたコントラストを示し、これは特に膜構造や重元素が豊富な領域で顕著です。対照的に、クライオプロテクタントは通常、電子ビームの下で均一なコントラストを示します。これにより、完全なリフトアウト手順を進める前に迅速な検証が可能です。
   2. ブロックを隔離するためのトレンチミリング(図3A)
      1. 30kVで動作するイオンビームを用いて、ターゲット組織ブロックを囲む長方形の溝を定義します。
      2. ブロックから一定距離から比較的高い電流(15 nA)を使ってミリングを開始し、材料の迅速な除去を実現します。
      3. 溝壁がブロックに数マイクロメートル以内に近づくと、イオンビーム電流を7 nAに減らします。電流を減らすことで制御精度が向上し、イオンビームによる損傷や対象領域の生物材料の加熱を最小限に抑えます。
      4. ブロックの片側をバルク材に取り付けて「タブ」として一時的に固定するのが良いです。
   3. 厚いブロックに対するオプションのアンダーカットミリング(図3B)
      1. 推定厚さ20μmを超える組織ブロックについては、最終的なリフトアウトを容易にするために裏側からアンダーカットミリングステップを行います。
      2. ステージを回転させ(例:-70°)、ステージの傾き(例:23°)を調整してブロックの底部にアクセスします。
      3. FIBを使って30 kV、3 nAの電流で裏側接続を研磨します。
   4. マイクロマニピュレーター針への取り付け(図3C)
      1. 試料を針に取り付けるには、連続断面ミリングパターンを行います。
         注意:ゴールドブロックは300メッシュのゴールドグリッドのバーから抽出可能です。
   5. 組織ブロックのリフトアウト(図3D)
      1. ブロックとバルクサンプルをつなぐ残りの「タブ」をFIB(30 kV、1 nA)で切断します。
      2. マイクロマニピュレーターの針を慎重に操作し、今や隔離された組織ブロックを持ち上げ、溝や周囲の元のグリッドから完全に離れるようにします。その後、針を引っ込めてブロックを受信グリッドに運びます。
   6. ブロック移送、溶接、再塗装
      1. 針を進めて、予備冷却された300メッシュのゴールド受信グリッドへと導きます。
      2. ブロックを選んだグリッドマスに下ろします。ティッシュブロックをグリッド上のフィルムに接触させ、その後ブロックを垂直に持ち上げて接触を断ちます。イオンビーム(30 kV、1 nA)を用いて、ブロックからグリッドフィルムに厚さ約3〜4μmのスライスを粉砕します(図3E)。
         注意:氷屑がある場合は、接着部位を長方形パターン(30 kV、50 pA)で事前に清掃してください。ブロックがグリッドフィルムに接触し、静電気を減らすためにスライスがランダムにずれてしまうことがあります。
      3. 接合部の両側に洗浄断面パターン(30 kV、30 pA)を用いてミリングしてスライスを確実に溶接します(図3F)。
      4. ステップ3.4.2(図3G)に記載されている通り、導電性/保護コーティングを再塗布します。
         注:このGISメッキの段階では、ブロックサイズに応じて時間を短縮できます。
   7. ラメラの薄化
      1. ステージを回転させ(例:-70°)、初期ステージの傾き(例:15°)(図3H)を設定します。
         注:サンプルホルダーはプリチルト45°を備えています。
      2. 組織ブロックの滑らかな領域内で最終的なラメラ位置を定義します。
         注意:選択したエリアが氷の汚染がないことを確認してください。
      3. 表1に指定されたイオンビーム電流を用いて体系的なミリングを行います。目標面に近づくにつれて、電流は高くから低い方向へ進みます(図3I,J)。必要に応じて、ラメラから1〜2 μm以内に位置する場合は、ラメラの曲がりや巻きつきを防ぐために約1.5 μm離れた場所に応力緩和トレンチをミル加工することも^{可能です。}
         注意:残りの材料がターゲット面から~1μm以内に入った場合は、1回のパスで除去される厚さを制限してください。

4. Cryo-ETデータ収集

1. ラメラ準備が成功した後、グリッドを透過電子顕微鏡(TEM)に慎重に装着し、クライオホルダー、エネルギーフィルター、断層撮影ソフトウェア(例:SerialEM)を搭載します。
2. グリッド全体のアトラスマップ(例: 図4A;典型的な倍率は155×)を取得します。
3. ラメラ位置に移動し、モンタージュマップ(例: 図4B;典型的な倍率は3600×デフォーカスは-100μm)を取得します。
4. 標準的な記録倍率を設定し、ピクセルサイズが意図した解像度に適切かどうかを確認します。本研究では、ピクセルサイズが2.109 Åで使用されました。スポットサイズ、C2口径、照明面積などの対応する照明パラメータを調整し、直接電子検出器の最適な線量率を実現します。
5. フォーカスおよび試験照明条件を、レコードパラメータに設定された条件に合わせるように設定してください。
6. 以下の手順に従い、PaceTomo スクリプト³²を使用してデータ収集を行います。
   1. ナビゲーターの「ポイント追加」機能を使ってモンタージュマップ上のターゲットを事前選択し、最初の特徴が十分なコントラストを示すことを確認してください。
   2. PACEtomo_selectTargets.pyスクリプト³²でターゲットを選択し、必要に応じてプレビュー倍率でフィーチャーエリアを調整します。典型的な関心領域は図4Cに示されています。
   3. 線量対称スキーム(例:0°、+3°、-3°、+6°、-6°...)で傾き系列を取得します。最大±60°–66°)まで、2°または3°の段階で変化します。PACEtomo.py スクリプトで取得パラメータを設定します。開始傾き角はステップ3.7.1で指定されたフライリング角度(すなわち8°)によって決定され、その符号はクライオEMでの試料の荷重向きに依存します。最小および最大傾き角は絶対値を示します。ステップサイズは傾斜増分(例:3°)に対応します。
      注意:この開始傾斜角は、ラメラを電子ビームに対して水平かつ垂直に位置させるように設計されています。ミリング角度が不明な場合は、画像を傾けてラメラの見かけ高さを最も大きく表示します。これにより十分に正確なアライメントが得られます。
   4. すべての傾斜^{に分布した}累積電子線量を100〜150 e⁻/Å2に保ちます。もし可能であれば、スリット幅10 eVのエネルギーフィルターを使用してください。
   5. データ収集を開始しろ。各傾角ごとに自動フォーカスとトラッキングが実装されています。単一の傾斜シリーズの典型的な取得時間は5〜8分です。
      注:トラブルシューティングガイドは 表2に記載されています。

5. データ処理

1. AreTomo 3³³を用いて、傾斜系列のモーション補正、CTF推定、アライメント、3Dトモグラム再構築画像を処理し、3つのコアステップを実行します:(1) 生画像フレームのモーション補正、(2) 各チルト画像のコントラスト伝達関数(CTF)の推定、(3) 全傾斜シリーズのアライメント。
   1. アライメント後に重み付きバックプロジェクションアルゴリズム を使って 三次元(3D)トモグラムを再構築します。このステップに必要な入力には、生画像フレーム、mdocメタデータファイル(チルトシリーズ取得パラメータを記録)、サンプルのあらかじめ決められた回転軸が含まれていました。
2. くさびの補正欠損
   1. 再建後、生成されたトモグラムに対してIsoNet³⁴を用いた欠損ウェッジ補正を行いました。
3. パーティクルピッキングとキュレーション
   1. EMAN 2.9³⁵ でテンプレートマッチング法を用いて粒子ピッキングを行います。自動ピックの後、偽陽性(すなわち非ターゲット領域や誤選された領域)は、選択された粒子データセットの品質を確保するために手動で除外されました。
4. サブトモグラム平均化
   1. 傾斜系列と対応する粒子座標をRELION 4.0にインポートします。RELION 4.0ドキュメント(https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html)に記載された標準ワークフローに従ってサブトモグラフィー平均を実施し、再現性に関する確立されたベストプラクティスの遵守を保証します。

結果

このプロトコルの成功した適用により、高品質なガラス化組織ラメラの生成と、その後のトモグラム再構築が可能となり、自然な細胞超微細構造が明らかになります。マウスの海馬組織を用いて示された以下の結果は、成功した実験の代表例です。

「ワッフル」法による高圧凍結で処理された組織ブロックは、均一で電子透明な外観を示しました(図4B,C)。完全にガラス化した試料では、結晶性氷に伴う回折コントラストは認められませんでした。傾斜系列から得られたパワースペクトルは、氷結晶を示す鋭い六角回折リングを伴わない拡散プロファイルを示し、細胞水がガラス状状態で成功裏に保存されていることを検証しました。これは高解像度イメージング解析に不可欠です。最適化されたプロトコルにもかかわらず、厚い組織標本の完全なガラス化は依然として技術的課題です。評価された4つのブロックのうち、1つのサンプルは内部に局所的な氷結晶を示しました。対照的に、接触面は一貫してより有利な...

ディスカッション

ここで示すワークフローは、ネイティブ厚組織の 現地 クライオ電子断層撮影のための一般化され、最適化され、再現可能なパイプラインを確立します。その主な貢献は、単一の技術の発明ではなく、改良されたワッフル-HPF法を用いた堅牢なガラス化から、精密に校正されたクライオFIBリフトアウトおよび薄化プロトコルに至るまで、全体のプロセスの体系的な統合、洗練、詳細な標準化にあります。この合成は、複雑な組織にクリオETを適用する際にしばしば直面する再現性とアクセスのギャップに対処しています。

重要なステップとプロトコルの最適化
ワークフローの成功と信頼性にとって、いくつかの統合最適化が不可欠です。まず、強化型HPF「ワッフル」法は基本的で、重要な改良を伴います。2つの研磨銅キャリアを用いて組織を物理的に圧縮し、凍結前にサンプルを事前に薄める方法です。組織はフィルム状のグリッド上で支えられ、その上に銅箔が重ねられてサンプルを固定し、損失を防ぎます。この設計は迅速かつ均一なガラ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-ヘキサデセン	シグマ・オルドリッチ	H2131	化学物質&試薬
2-メチルペンタン	シグマ・オルドリッチ	M65807	化学物質&試薬
クリップリング	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	1131750;1188953	消耗品
銅箔	風成金属材料	1 & micro;厚さm(m)	消耗品
銅線サポートTEMグリッド(100メッシュ)	北京中京閣科技有限公司	BZ10021b	消耗品
クライオEM	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	クリオス G4	装備
クライオFIB	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	アクイロス2	装備
クライオFIBオートグリッド	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	1205101	消耗品
グリッド(UltrAufoil R 1.2/1.3 300メッシュ)	クアンティフォイル	アルトラ・オーフォイル	消耗品
高圧冷凍庫	ライカ・マイクロシステムズ	エム・アイス	装備
HPFキャリア、銅	ライカ・マイクロシステムズ	タイプB(6 mm)	消耗品
イオンスパッターコーター	定足数	Q150RS プラス	装備
金属組織研磨ペースト	lab-testec	W0.5	消耗品
布磨き	モラル	B00809	消耗品
サンドペーパー	イーグルブランドサンドペーパー	8000番、12000番	消耗品
立体顕微鏡	ライカ・マイクロシステムズ	S9i	装備
ショ糖	シグマ・オルドリッチ	200-334-9	化学物質&試薬
Tiltシリーズ取得ソフトウェア	https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/	シリアルEM 4.0.9	ソフトウェア
傾斜系列の整列と再構築ソフトウェア	https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3	アレトモ3	ソフトウェア
Tiltシリーズ取得ソフトウェア	https://github.com/eisfabian/PACEtomo	ペーストモ	ソフトウェア
傾斜系列の整列と再構築ソフトウェア	https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet	IsoNet	ソフトウェア
傾斜系列の整列と再構築ソフトウェア	https://github.com/cryoem/eman2	EMAN2	ソフトウェア
傾斜系列の整列と再構築ソフトウェア	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.html	レリオン4	ソフトウェア