リファキシミン治療およびシンバイオティックゲルを用いた健康なボランティアにおける ビフィドバクテリア および ラクトバチル菌 群形成ユニットの変化の定量化

Summary

本臨床試験では、リファキシミン治療中および4週間後のビフィドバクテリアとラクトバチルス・ラクトバチルス (NCFM )およびビ フィドバクテリア ム・ラクティスBi07(アガベイヌリンを含む)を投与後4週間のビフィド菌とラクトバチルスのカウントをプラセボジェルと比較して評価し、シンバイオティックジェルがラクトバチルスおよびビフィド菌の維持に役立つ可能性を示しました。

Abstract

腸内細菌叢は一般的に安定していますが、抗生物質治療の影響を受けることがあります。消化器系疾患の治療に用いられるリファキシミンは、細菌群の乱れリスクを減らすためにプロバイオティクスと頻繁に併用されます。 ラクトバチルス・アシドフィルス は腸細胞と相互作用し、プレバイオティクス化合物を使用します。ビフィドバク テリウム、特にビフィドバクテリウム・インファンテリス 属ラクティスBi07は、腸内で有益な効果と関連しているプロバイオティクスです。in vitro の研究では、アガベフルクタンがチコリイヌリンよりも優れていることが示されています。リファキシミンとシンバイオティクの併用後に糞便中の乳酸菌やビフィド菌の数が変化した研究は報告されていません。私たちの目的は、リファキシミン治療1週間およびその後4週間のプレバイオティクスであるLactobacillus acidophilus NCFM、Bifidobacterium lactis Bi07、およびアガベイヌリンを含むSynbioticジェルを摂取後、健康なボランティアにおける腸内ビフィドバクテリアおよびラクトバチルスのCFUカウントの変化を評価することでした。無作為化・プラセボ対照・二重盲検臨床試験では、前月抗菌薬治療を受けていなかった健康参加者を2グループに1:1でランダム化(10名)しました。シンバイオティックゲル群はプレバイオティクスとして10.32gのアガベイヌリン、4×10⁹ CFU/gの Lactobacillus acidophilus NCFMおよび4× 10^{10 9} CFU/gの ビフィドバクテリウム・ラクティス Bi07を1日5週間、1週間は200 mgのリファキシミンを1日2回投与しました。プラセボゲル群は5週間プラセボジェルを、最初の1週間はリファキシミン200mgを1日2回投与しました。細菌の変化は、糞便の微生物学的評価によってCFUを定量化することで推定されました。5週間後、乳酸菌とビフィドバクテリアの集団は変化しませんでした。一部の便サンプルでラ クトバチルス・アシドフィルス NCFMおよび ビフィドバクテリウム・ラクティス Bi07が検出されたことは、一時的かつ部分的な定着を示唆しており、この合成生物を用いた用量反応研究の必要性が浮き彫りになります。

Introduction

ヒト腸内細菌叢は、常時存在する在来種やその他の一時性微生物を含む密集した群集です。個体によって組成は異なりますが、一般的には安定していると考えられています。しかし、年齢、感染、抗生物質治療の影響を受けることがあります^1,2,3。リファキシミンは腸吸収率の低い広域スペクトル抗生物質で、腸疾患の治療に用いられ、腸内細菌を変化させることがあります。これらの影響を緩和するために、ラクトバチルス属やビフィドバクテリウム属のプロバイオティクス菌が用いられています。

ビフィドバクテリウム属の株はリファキシミン耐性²であることが報告されており、これはビフィドバクテリウム属の集団を含む腸内生物群を十分に促進し、有益なプロバイオティクス効果をもたらす興味深い効果を持っています。

さらに、ラクトバチルス・アシドフィルスは消化管上皮⁴との相互作用能力や、多糖類、オリゴ糖、フルクトリゴ糖などのプレバイオティクスを利用する能力で広く知られています。しかし、ラクトバチルス・アシドフィルス・ノースカロライナ食品微生物学(NCFM)株のようなプロバイオティクス株はごくわずかしか特定されていません。したがって、これらの生体内での効果の研究は重要であり、消化管におけるビフィドバクテリウム・ラクティスBi07の存在も同様に、さまざまな健康^{促進効果と}関連しています^2,5。これらのプロバイオティクスは最適に成長するためにプレバイオティクスを必要とするため、プロバイオティクスとプレバイオティクスの両方を含むシンバイオティクスは相乗効果を発揮します。つまり、その好ましい効果はプロバイオティクス単独よりも高いということです。プロバイオティクスの基質として機能するプレバイオティクスと組み合わせることで、この共生は消化管内のプロバイオティクス微生物の生存率を高め、マイクロバイオータのより大きな回復につながると期待されています⁶。

プレバイオティクスの重要な供給源としてアガベフルクタンがあり、チコリ根(Cichorium intybus L)よりも細菌叢に優れたインビトロ効果を持つと報告されています。⁷. プロバイオティクス摂取の効果が報告されています。例えば、Engelbrektsonらは抗生物質投与中および投与後にプロバイオティクス摂取が抗生物質による微生物叢の変化を減少させるかどうかを評価^{しました。}プロバイオティクスブレンドを受けたグループは^{、プロバイオ}ティクスを使わないグループよりも正常な腸内細菌叢の回復が速かったことがわかりました。さらに、Koningらは、500mgアモキシシリンを1日2回、7日間投与した40人の健康なボランティアの腸内細菌叢の不全と、プロバイオティクスブレンド摂取後の微生物叢の回復の可能性を調査しました。結果は、アモキシシリン処理が在来微生物叢の組成に影響を与えることを示しました。プロバイオティクスブレンドを投与すると^、2か月の摂取後にマイクロバイオータが有意に回復しました9。

しかし、文献では、リファキシミンなどの抗生物質投与中および投与後に腸内細菌叢に与えるシンバイオティクス摂取(アガベフルクタンを含む)が腸内細菌叢に与える影響を調査した研究は報告されていません。プロバイオティクスに関する研究しか見つかりませんでした。したがって、本研究は、リファキシミン治療1週間およびその後4週間のシナバイオティックジェル(プレバイオティクスとしてラクトバチルス・アシドフィルスNCFM、ビフィドバクテリウム・ラクティスBi07、アガベイヌリンを含む)を摂取後、健康なボランティアにおける腸内ビフィドバクテリアおよびラクトバチルスのCFUカウントの変化を評価しました。

Protocol

このプロトコルは、サルバドール・ズビラン国立医学・栄養研究所(INCMNSZ)のヒト生物医学研究機関委員会(CIIBH)によって承認されました(参考番号1734)。すべての参加者は本研究に含める前にインフォームド・コンセントを提供しました。

研究デザインと対象集団

これは5週間の追跡期間を持つ無作為化プラセボ対照二重盲検臨床試験でした。INCMNSZの研究者が研究に参加するよう招待され、2011年から2012年にかけて抗菌薬治療を受けていなかった20〜50歳の健康なボランティアがインフォームドコンセントを受け入れ署名した者を含めました。被験者は1:1でシンバイオティックゲル群に無作為化され、プレバイオティクスとして10.32gのアガベイヌリンと、10×10⁹ CFU/gのLactobacillus acidophilus NCFM4錠、Bifidobacterium lactis Bi07×4 10⁹ CFU/gを1日4袋に5週間、1日200mgリファキシミンを1日2回投与しました。プラセボゲル群は、シンバイオティックジェルと同じ症状と感覚特性を持つ15gプラセボジェル4パックを5週間、最初の1週間はリファキシミン200mgを1日2回投与しました(図1)。

臨床評価

両研究群とも、症状および便の見た目はブリストルスケールを用いて評価されました。体重、身長、体格指数(BMI)も測定しました。日記を用いてシンバイオティックジェル、プラセボジェル、リファキシミンの摂取状況を評価し、ゲル摂取に関連する副作用の有無を記録しました。

食物繊維の消費

食物繊維の摂取量は、両グループともに食事日記と24時間のリコールを用いて評価されました。

治療の遵守

リファキシミンおよびジェルの摂取遵守は、リファキシミンの投与回数と参加者あたり摂取したシンバイオティクスおよびプラセボゲルのサシェット数を数えて評価しました。 Lactobacillus acidophilus および Bifidobacterium lactis の存在はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて検出されました。

糞便の微生物学的評価

各グループで5回の訪問および週1回の訪問(6回)では、プレートカウント法を用いて120件の糞便サンプルからラクトバチル、ビフィドバクテリア、腸細菌の数を評価しました。この方法は、希釈したサンプルを特殊な固体培地¹⁰に置くことでコロニー形成単位(CFU)を測定します。各受診開始時に便サンプルを採取しました。

微生物の同定のために、糞便サンプルを収集しBBLチューブに保存しました。PBGバイアルは嫌気性細菌に使用され、糞便サンプルは冷凍ゲルパック入りの発泡スチロールクーラーで低温を保ち、処理前に実験室で処理されました。共プロカルチャー用のPBGバイアルのキャップを外し、便サンプルを綿棒で採取してサンプルに浸漬させました。その後、アプリケーターは固体培養培地が入ったチューブに挿入されました。

嫌気性細菌についてはバイアルを計量し、スプーンで5〜10gの便を採取しました。便はバイアルの内容物と混ぜられ、しっかりと密封されました。サンプル処理のために、サンプル入りのバイアルと無菌のスバーマーバッグの重量が測定されました。サンプルは袋に空にされ、60秒遠心分離され、その後0.1%ペプトン水4.5mLを加えました。その後、500μLのサンプルをバイアルに移し、混合液を均質化するためにボルテックス処理を行いました。サンプル100μLを各プレートに2回接種した後、ビフィドス菌用の特定の選択培地、Man Rogosa Sharpe(MRS)培地とシステイン+シクロヘキシミド(不要菌群除去用)を含むDP Berens培地をそれぞれのプレートに2回接種し、最大希釈8(希釈係数0.1 mL)まで投与しました。腸細菌については、希釈5–8(希釈係数0.1 mL)でマッコンキー培地を使用し、細菌コロニーを分離し¹¹を定量しました。各中粉は精製された蒸留水に溶かされ、溶液は沸騰まで加熱されて完全に溶解し、121°Cのオートクレーブで15分間滅菌されました。混合液は46.5°Cまで冷却され、注ぎ板法を行い、1プレートごとに1mLを15〜20mLの培養液を含む無菌ペトリ皿に2回ずつ注ぎ込み、プレートを固化させました。接種されたサンプルは、_CO2濃縮大気中の嫌気性GasPakシステムで37°Cで24〜48時間にわたり嫌気性状態を維持しました。コロニー形成ユニット(CFU)はペンで印をつけ、¹²個数えられました。以下の式が適用されました:

CFU/mL = (コロニー数×総希釈係数)/培養プレート体積(mL)

ラクトバチルリおよびビフィドス菌の形態的特徴の同定

標本の形態的特徴を特定するためにグラム染色が用いられました。各株の細菌群のサンプルを顕微鏡スライドに置き、クリスタルバイオレットで1分間染色し、蒸留水で洗い流しました。ヨウ素溶液を1分間塗布し、その後蒸留水で洗い流します。アルコールとアセトンの溶液を10秒間脱色剤として使い、蒸留水ですすぎました。最後に、サフラニンをカウンターステインとして1分間塗り、蒸留水で洗い流しました。顕微鏡スライドは、100倍対物レンズを用いた浸漬油を用いた光学顕微鏡で観察されました。

総定量は、各グループ5名の被験者からランダムに選ばれた糞便サンプルに対して従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて実施され、5週間で合計60サンプルを取得しました。培養培地から分離されたものは遺伝物質抽出のために処理されました。PCRは汎用細菌プライマーを用いて16S rRNA遺伝子¹³の断片を増幅しました。PCR産物は精製され、シーケンスされました。配列は検証され、糞便サンプルから分離されたラクトバチルスおよびビフィドバクテリア株の存在を確認するためにGenBankデータベースに提出されました。

統計解析

データは絶対頻度と相対頻度、または中央値(p25-P75)として提示されます。症状の累積重症度は、各フォローアップ時にリッカートスコア(軽度1、中等度2、重度3)を用いて算出されました。グループ間比較はウィルコクソン順位和検定とカイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定を用いて行われました。0週から5週までのグループ内比較はフリードマン検定とダービン・コノーバーとの複数比較を用いて行われました。統計的有意性はP < 0.05に設定されました。

Results

20名の健康なボランティアが無作為にシンバイオティックゲル群(n = 10)とプラセボゲル群(n = 10)に分けられました(図2および表1)。シンバイオティックゲル群では男性7名、女性3名で、中央値年齢は31歳(範囲27〜35歳)でした。プラセボゲル群では男性3名、女性7名で、中央値年齢は33歳(範囲28〜38歳)でした。年齢、性別、体重、BMIの面ではグループが似ていました。治療遵守率はシンバイオティックゲル群で100%、プラセボゲル群で90%でした。

研究中、腹痛、膨満感、ボルボリグミ、おならなどの消化器症状が両群でほぼ同じ頻度・強度で、主に軽度から中等度で、有意な差はありませんでした。排便頻度と便の一貫性は5回のフォローアップで安定していました。両群のボランティア全員で軽度のおならが報告されており、シンバイオティックジェル群の50%、プラセボゲル群の60%がベースライン訪問時に報告...

Discussion

本研究では、プラセボ群の便サンプルで介入1週目およびシンバイオティックゲル群の1週目および2週目に腸細菌数が有意に減少していることが確認されました。この変化は、病原性細菌の過剰増殖を緩和するとされるリファキシミンを用いて説明できます^。本研究では、リファキシミン後のシンバイオティックゲル群が良好な効果を示しました。介入期間中、ラクトバチルス株の中央値集団はベースラインから変化せず、ビフィドバクテリアはプラセボゲルと比較して1log CFU未満減少し、これは臨床的関連性が最小限とされています。リファキシミン処理後にL . acidophilus NCFMおよび B. lactis Bi07を含むシンバイオティクスをアガベフルクタンと組み合わせて投与することで、糞便中のLactobacillusおよびBifidobacterium集団の維持に役立つ可能性があります。

ラクトバチルス・アシドフィルスNCFM株は、その生理学...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BBLチューブ	NA	NA	どのブランドでも使えます。
DPメディア	NA	NA	どのブランドでも使えます。
冷凍ジェルパック
マッコンキー・メディア	NA	NA
MRSミディアム	NA	NA	どのブランドでも使えます。
PBGバイアル			リン酸緩衝剤、ゼラチン、塩類 0.05%システインを還元剤として
ペトリ皿
プラセボブレンド	蔵子バイオテック-ベビーキャット。	NA	シムイオティックジェルと同じ物理的・感覚的特性ですが、有効成分は含まれていません
発泡スチロールコンティナー
共生ブレンド	蔵子バイオテック-ベビーキャット。	NA	乳製品でないLactobacillus acidophilus NCMFおよびBifidobacterium infantis Bi-07(2 x 109 15gのパックにプレバイオティクスとして17.2gのアガベイヌリンを摂取しています