牛乳腺上皮細胞および乳腺組織からの脂質滴のサイズに基づく濃縮プロトコル

サマリー

このプロトコルは、順次遠心分離を用いて脂質滴のサイズに基づく分離と濃縮を実現し、脂質代謝機構および脂質滴に関連する生物学的プロセスの正確かつ再現性のある調査を可能にします。

要約

本プロトコルは、牛の乳腺上皮細胞(BMECs)および乳腺組織から異なるサイズの脂質滴(LD)を濃縮する逐次差別遠心分離法を記述し、従来のバルクLD分離法を超えたサイズ分解解析を可能にします。細胞内脂質代謝の動的な調節ハブとして、LDは中性脂質(トリグリセリドやコレステリルエステルなど)を貯蔵し、それらの合成、加水分解、輸送を調整します。エネルギー恒常性の維持、膜の生合成の支援、細胞内シグナル伝達の促進に中心的な役割を果たします。LD抽出は脂質代謝の調節機構を調査するために不可欠です。乳腺脂質代謝の研究は、乳児の発達、人間の健康、農業経済学、そして基本的な細胞生物学に重要な影響を与えます。したがって、BMECsおよび乳腺組織からLDを抽出するための差別遠心分離法を記述します。従来のバルクLD分離アプローチとは異なり、このプロトコルは遠心力を逐次調整することでサイズベースのLDサブポピュレーションを可能にします。LD分画の完全性と相対的な濃縮度は、BODIPY493/503染色法を用いて事前に評価され、脂質代謝およびLD関連プロセスの下流解析において実用的かつ再現性の高いアプローチを提供します。

概要

脂質滴(LDs)は、細胞内の動的な細胞小器官であり、中性脂質の主要な貯蔵部位として機能します^。異常なLDの蓄積は、肥満だけでなく脂肪^肝疾患2、心血管疾患³、糖尿病⁴、がん⁵などの幅広い疾患と関連しています。逆に、LDの数が不足すると細胞のエネルギー貯蔵量の喪失やその後の機能障害を引き起こす深刻な結果をもたらすこと^{もあります。}農業経済の文脈では、反芻動物のLDが不十分であると乳脂分泌不足が生じ、乳脂抑制を引き起こし、それが乳製品の栄養価や市場性を損なう可能性があります^。現在、LD代謝の調節は重要な研究分野として浮上しています。

20世紀以降のLDの抽出技術の開発は、より大量で、より高い純度、そしてより優れた生物活性を保有することを目指してきました。これは方法論の継続的な確立と最適化を伴います。現在、いくつかの企業がLD分離⁸用の市販キットを設計しています。これらのキットは分離時間を大幅に短縮し、従来の遠心分離機のみの使用で済みますが、解離が難しい試料では試薬の調整ができず、試験ステップの最適化も困難です。さらに、LDの抽出は、脂肪肝⁹、がん¹⁰、神経変性疾患¹¹などの代謝疾患のメカニズム解明に不可欠な役割を果たし、病理経路の解読のための多次元的なプローブとして機能します。タンパク質および脂質組成はLDを抽出することで解剖され、LDの生物学的機能の多様性を明らかにすることも可能です(¹²)。

乳脂の生成は単なる基質の劣化過程ではありません。むしろ、乳腺上皮細胞によって行われる高度に組織された脂質合成とパッケージングプロセスを表しています。¹³. 乳牛の乳脂生成は、これらの細胞の頂端膜分泌機構に依存します。すなわち、小胞体で合成されたトリグリセリドが細胞質LDを形成し、それが頂端膜に運ばれて出芽によって分泌されます。この過程で、LDは頂端膜から派生した乳脂球膜に包まれ、構造的に安定した乳脂球状体が形成されます¹⁴。牛の乳腺は哺乳類の授乳研究の古典的なモデルであり、LD合成と分泌を司る核心的なメカニズムは人間において非常に保存^{されています。}BMECsと乳腺組織の両方からLDを抽出する方法を確立することは、家畜生産と人間の健康をつなぐことを可能にします。抽出されたLDsのプロテオミクスおよびリピドミクス解析は、その後、乳量と品質の向上に活用され、安全性と安心を確保することができます。

本法は主にLDの低密度特性に基づいており、遠心分離¹⁶時に勾配の頂点に浮かび上がる。抽出手順は主に3つのステップから成り立ちます:サンプル採取、LD浮選のための超遠心分離、そしてLD洗浄です。LDを保護するためにショ糖(2.5 M)をバッファーに加え、遠心分離速度は実験要件に応じて調整されます。通常、大きなLDは10,000 x g未満の力で濃縮でき、より高速(10,000 x g以上)を用いて小さなLDを抽出します。これらの条件下で大きなLDは破裂する可能性があるためです。最後に、抽出されたLDは汚染防止のために複数回の洗浄を行い、抽出純度はBODIPY493/503染色で予備的に評価されます。

従来のLD分離法は主に異質なLD集団の一括回収を達成し、サイズ依存的な構造的および機能的差異の解析を制限します。本プロトコルは、LDサブ集団のサイズに基づく増殖を逐次差動遠心分離で可能にし、LDの成長、入れ替わり、細胞内輸送、リポリティックまたはオートファジ経路による差異利用の研究を促進することで、標準的アプローチを拡張しています。この方法は絶対的な精製ではなく濃縮を実現し、連続したサイズ分布や共有された物理的性質のために、サイズ分数間の部分的な重複が生じることがあります。

プロトコル

濃縮のためのターゲット脂質滴のサイズを決定します(図1)。

1. 試薬の設置

1. PBS:重量8 g NaCl、0.2 g KCl、3.58g Na₂HPO₄·12H₂O、0.24g KH₂PO₄を800 mL ddH₂Oに混ぜて、pHを7.4に調整し、十分に混ぜて1リットルにします。オートクレーブ後、最大1年間4°Cで保存します。
2. ショ糖(2.5 M):ショ糖856gを400 mLのddH₂Oに溶かします。完全に溶解するまでよくかき混ぜ、その後1Lに調整します。溶液をオートクレーブし、4°Cで最大3ヶ月保存します。
3. バッファーA:トリシン1.79gを重量し、ddH₂O400 mLに溶かします。KOHでpHを7.8に調整します。pH調整後、事前に準備された2.5 Mショ糖溶液50 mLを加えます。よく混ぜて、容量を500mLに調整します。オートクレーブ後、バッファーは最大3か月間4°Cで保存可能です。
4. バッファーB:重量:HEPES 0.95 g、KCl 1.49 g 、MgCl₂·6H₂Oを180 mL ddH₂Oに別々に投与します。KOHでpHを7.4に調整し、十分に混ぜてから200 mLまで集積します。オートクレーブ後は4°Cで最大3ヶ月保存します。
5. PMSF(1,000x、0.2 M):PMSFを0.175 gの重さで、5 mLのDMSOに溶かします。-20°Cの光から保護して最大1年間保存します。
   注意:PMSFは非常に有害です。適切な保護措置を講じる必要があります。準備中は光からの完全な保護を確保し、PMSFは溶解が難しく、1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに分割できます。

2. 細胞からのLDの抽出

1. BMECの文化
   1. -80°Cの冷蔵庫から凍結されたBMECセル5本を回収し、37°Cの水浴で急速解凍します。完全に解凍された後、チューブを250 x g で4分30秒遠心分離します。
   2. ピペッターで凍結保存培地を捨て、10% FBSを1 mL加えて細胞を再懸濁させ、100mmの細胞培養皿に6 mLの10% FBSを入れて優しく加えます。皿を優しく揺らして細胞の分布を均一にし、37°Cで5%のCO₂で孵化します。
   3. 顕微鏡で細胞の形態を観察し、細胞が80%〜90%のコンバール率に達したらサブカルチャーを行います。
      注意: LD抽出前に最適な細胞状態と十分な細胞数を確保し、収率と再現性を向上させること。
   4. ピペットで元の培地をペトリ皿に残し、各皿の壁に沿って1mLのPBSを加えます。2回洗った後、各皿に1mLのトリプシンを加え、37°Cで3分30秒培養します。
   5. 顕微鏡で細胞が完全に消化されているか観察し、消化完了後に10% FBSを1mL加えて消化を終えさせます。ピペッティングで細胞を優しく再懸浮させ、2 mLのマイクロ遠心分離管に移し、250 x g で遠心分離機で4分30秒間処理します。
   6. 上清液を捨て、ステップ1.2で説明した手順を繰り返します。
   7. 約30個の培養皿やより大きな培養容器を用いて細胞を拡張するか、細胞培養にはより大きな培養皿を使用します。抽出前夜に150μmol/Lのt10,c12-CLA(DMEMで希釈)を加えて細胞処理を行います。100mmの培養皿につき7mLの培地を使いましょう。培養時間は分離が必要なLDの大きさによって異なります。
      注意:事前最適化に基づき、BMECはt10,c12-CLAで6時間治療して大きなLDを濃縮し、12〜24時間で小さなLDを濃縮します。細胞にはLDが少ないため、通常は外因性脂肪酸が添加されてLDの蓄積を促します。本研究では、培養細胞にt10,c12-CLAを加えてLDの蓄積を誘導します。
2. サンプル採取
   1. 元の培地を捨て、氷で冷えたPBSを1mL加えて3回洗います。最終洗浄時にPBSを捨てないでください。例えば、100mmセルの30皿を用いると、10枚のプレートごとに細胞を集めて15mLの遠心分離機チューブに集めます。各チューブには約1x108が含まれており、合計3本の遠心分離機チューブとなります。
      注意:抽出過程中はすべてのサンプルを≤4°Cに保ち、LDsのタンパク質分解を防ぎましょう。
   2. バランスを取った後、遠心分離機は1,000 x g、4°Cで10分間加熱します。
   3. PBSは捨てろ。遠心分離機チューブに事前に準備済みのバッファーA10mLとPMSF10μL(1,000x、0.2 M)を加えます。よく混ぜて氷で20分間孵化します。
3. 細胞溶解と初期分離
   1. プローブ型超音波ホモジナイザーを用いた破壊細胞は、5秒オンおよび10秒オフのパルスサイクルで動作し、30分間の有効超音波処理時間を合計10分達成しました。直径3mmのプローブを使って機器を40%の出力(プローブ振幅約76μmに相当)に設定します。
      注意:過熱を防ぐため、検査中はサンプルを氷に保管してください。
   2. ホモジネートを3,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離し、核や細胞の残骸を除去します。上清液を核後に上清液(PNS)として採取します。
4. 浮遊するLDの超遠心分離
   1. 上澄液を100μmのセルストレーナーでろ過します。
   2. 10 mLのPNSを15 mLの遠心分離機チューブにピペット移液します。2 mLのスクロース(2.5 M)と2 mLのバッファーBを順にPNSの上部に加えます(スクロースは適切に減少させつつ、LD純度を高めるためにバッファーBの体積を増やすことができます)、そして初めて遠心分離機をかけます(5,000 x g、4 °C、20分)。
   3. 遠心分離後、チューブの上部に乳白色でクリーム状のLD層を集めます。LDを採取するには、まず1.5 mLのマイクロ遠心分離機管にバッファーBを100 μL加え、その後20 μLピペットで浮遊するLD層を何度も優しく吸引し、できるだけ多くのLDを採取します。
      注意:LDは上部に浮かぶクリーム層を形成します。汚染を防ぐために、下層溶液の吸引はできるだけ避けてください。
   4. 2回目の遠心分離(10,000 x g、4°C、30分)を行い、LDを採取します。
   5. 溶液をスイングバケットローターに対応した超遠心分離機管に移し、キャップをして管のバランスを取る。超遠心分離機(50,000 x g、4°C、40分)で3回目の遠心分離を行い、LDを採取します。
      注意:安全な超遠心分離機運転を確保するために、真空管は0.0001gまで正確にバランスを取ってください。
   6. バランス調整後、4回目の遠心分離(150,000 x g、4 °C、50分)を行い、LDの収集を続けます。目標LDサイズに応じて速度と持続時間を最適化します。
      注意:長時間または繰り返しの高速遠心分離はLDを乱す可能性があります。これに対し、洗浄中の10,000 x g での短時間遠心分離は主に不純物を除去し、LDの完全性への影響は最小限です。この方法は適応可能です。異なる細胞タイプや組織ごとに最適化が必要になる場合があります。
5. 洗濯 LD
   1. 収集したLDを冷たいバッファーBに再懸浮させ、遠心分離機で10,000 x g 、4°Cで5分間保持します。
   2. 上清液を慎重に除去し、同じバッファー容量、遠心力、遠心分離時間を使い、洗浄工程を少なくとも4回繰り返します。小型LDでは、効率的な分離を確保するために遠心力を必要に応じて増強します。
   3. 最終洗浄後、LD分画をまとめて優しく混ぜ、−80°Cで保存します。
      注意:洗う手順を省略しないでください。多少の断心障害は避けられません。膜の破片が目に見えなくなるまで洗い続けてください。

3. 組織からのLDの抽出

1. サンプル採取
   1. 液体窒素から牛の乳腺組織サンプルを採取してください。5gの組織を重量し、氷の結晶がなくなるまで氷で解凍します。
   2. 組織はPBSまたは生理食塩水で洗い流してください。
   3. 外科用ハサミで組織を1〜2mmの細かい細分に刻みます。
   4. 挽いた組織を、バッファーA12mLとPMSF10μL(1,000x、0.2 M)を含む冷却済みモルタルに移します。混合物を氷で約10分間挽きます。
   5. ホモジネートを氷で20分間培養します。
   6. 徹底的に粉砕した後、均質酸塩を15mLの遠心分離機チューブに集めます。
   7. 遠心分離機は2,500 x g、4°Cで10分間。その結果生まれる上澄液はPNSです。
2. 浮遊するLDの超遠心分離
   1. 上澄液を100μmのセルストレーナーでろ過します。
   2. 10 mLのPNSを15 mLの遠心分離機チューブにピペット移液します。ショ糖2mLとバッファーB2mLを順次に加えます。最初の遠心分離(4,000 x g、4 °C、20分)を行います。乳白色でクリーム状の素材を集めます。
   3. 2回目の遠心分離(7,000 x g、4 °C、30分)を行い、LDを採取します。
   4. 3回目の遠心分離(10,000 x g、4 °C、40分)を行い、LDを採取します。
   5. 上清液をSW40チューブに移し、超遠心分離(50,000 x g、4 °C、50分)を行います。LDを集めましょう。
   6. 5回目の遠心分離(100,000 x g、4 °C、60分)を行います。LDを集めましょう。
3. 洗濯 LD
   細胞抽出LDの洗浄方法を参照してください。

4. 染色によるLD純度の予備検証

1. 光保護条件下(BODIPY:バッファーB = 1:1:100、V/V)で、10 μg/mLの中性脂質蛍光染料溶液を事前に準備します。
2. マイクロ遠心機チューブに適切な量の混合LDとバッファーBを加えます。光が遮られた環境下で、適量の中性脂質蛍光染料溶液を加えます。よく混ぜて10分間孵育します。
3. きれいな顕微鏡スライドを用意してください。混合物を2.5μLをカバースリップに分散します。気泡を避けながら、スライドを混合物の上に優しく置きます。逆型蛍光顕微鏡の下で観察してください。

5. ウェスタンブロットによるLD純度の検証

1. LD分画のタンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキットを用いて測定されました。
2. ウェスタンブロット分析では、各サンプルから20μgのタンパク質を5倍のSDSローディングバッファーと混合し、99°Cで10分間加熱して完全な変性を確保します。
3. 次に、分子量に応じて10%勾配ポリアクリルアミドゲル上でSDS–PAGEでタンパク質を分離します。
4. 電気泳動の後、タンパク質を事前に活性化されたPVDF膜に移し、室温で5%BSAで1.5時間ブロッキングします。その後、膜を4°Cで一晩、ウサギ抗ペリピン2(1:500)やウサギ抗抗βアクチン(1:5000)を含む一次抗体で培養します。
5. 膜を1回TBSTで3回、それぞれ10分間洗浄し、その後HRP結合ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:5000)と室温で1.5時間培養します。
6. TBSTによる追加3回の洗浄後、強化化学発光(ECL)キットでタンパク質バンドを検出し、ゲルイメージングシステムで可視化します。

6. 一時停止ポイントと保管ガイドライン

1. 超遠心分離の前に、PNSを最大1〜2時間氷で保ちましょう。
2. 集めたLDは洗う前に最大1〜2時間氷で保管してください。短期保存には、LDを4°Cで最大24時間保存してください。長期保存の場合は、LDを−80°Cで保存し、凍結・解凍サイクルを最大1回に制限してLDの完全性を保ちます。
3. すべての実験中断中は、汚染を最小限に抑えるためにサンプルを氷に保管し、チューブキャップを閉じて保管してください。

7. トラブルシューティング

1. 薄い浮遊層:緩衝材の体積や遠心力を調整してください。
2. 浮力不良:遠心分離速度を上げるか、時間を延長する。
3. 汚染:無菌の取り扱いとろ過されたバッファーの確保。
4. LD破裂:サンプルを氷に保管、遠心分離力を減らす、または優しく再懸濁してください。

結果

ワークフローと方法論的枠組み
遠心分離条件の選択を実験目的に基づけるための意思決定木の回路図(図1)が確立されました。具体的には、遠心力≤10,000 × g )が大きなLD(≥2 μm)に用いられ、10,000 x g の>力は小さなLD(< μm)に加わりました。このフレームワークは、サイズベースのLD分離を達成するための実用的な基盤を提供します。BMECや乳腺組織からのLD分離の全体的なワークフローは 図2に示されています。サンプルの起源に違いがあるものの、この手順はサンプルの準備、破壊、逐次遠心分離を含む標準化された順序に従っており、サンプルの種類間で一貫した処理と比較を可能にします。

脂質滴の分離の検証
血清なし条件下では細胞内LDは制限され、そのため、外因性脂肪酸がLD蓄...

ディスカッション

LDは、リン脂質単一層に囲まれた中性脂質コアを持つ独特な小器官です。これらは小胞体から発芽し、その大きさや数を動的に変化させることで、細胞内輸送を促進し、他の細胞内構造との広範なコミュニケーションを促進し、細胞内の脂質恒常性を調整します 17,18,19。この動的挙動は全身代謝の手がかりによってさらに調節されており、インスリンはグルコースと脂質の代謝クロストークを協調し、LDターンオーバーや細胞^{エネルギーバランスに影響を与える}ことが示されています。LDは幅広い生物に存在し、単純な細菌から複雑な高等植物や動物に至るまで、主要なエネルギー貯蔵区画として機能します^1,21。真核細胞内の位置に基づき、LDは細胞質LD、核LD、腔内...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン-EDTA	ギブコ	25200072	試薬
10% PAGEゲル迅速調製キット	北京バイオマン	PG112	試薬
100 & mu;M細胞ストレーナー	ビヨタイム	FSTR100	試薬
100mm細胞培養皿	コーニング	490167	試薬
アマシャムイメージャー600	GEヘルスケア・ライフサイエンス	600	装備
オートクレーブ	パナソニック	MLS-3751L	装備
BCAタンパク質アッセイキット	北京定国。	BCA01	試薬
ボディピー 493/503	インビトロジェン	D3922	試薬
遠心分離機	エッペンドルフ		装備
DMEM	ハイクローン	SH30022.01	試薬
DMSO	ソーラービオ	D8370	試薬
胎児用牛血清	ギブコ	2492319	試薬
ヘペス	メドケムエクスプレス	HY-D0857	試薬
HRP結合型AffiniPureヤギ抗ウサギ二次抗体	プロテインテック	SA00001-2	試薬
KCl	フシ	20030666	試薬
KH2PO4	フシ	10017608	試薬
MgCl2	フシ	20059028	試薬
Na2HPO4middot;12H2O	フシ	S112623	試薬
NaCl	フシ	10019328	試薬
オムニイージー即時タンパク質ローディングバッファー	上海エピザム生物医学技術	LT101S	試薬
Omni-ECL超高感度化学発光検出キット	上海エピザム生物医学技術	SQ201	試薬
PBS	ハイクローン	SH30256.01	試薬
ペニシリン&ストレプトマイシン100回以上;	NCMバイオテック	CLOOC5	試薬
pHメーター	メトラー・トレド	S220K	装備
ピペット	エッペンドルフ		装備
PMSF	クールアバー	CP8651	試薬
PVDF膜転送キット	ジェンスクリプト	eBlot L1	試薬
ウサギ抗ペリピン2	アブカム	15294-1-AP	試薬
ウサギ抗βアクチン	プロテインテック	20536-1-AP	試薬
研究用逆蛍光顕微鏡	オリンポス	IX73	装備
ショ糖	ソーラービオ	S8271	試薬
SW 40 Tiローター	ベックマン・コールター	331301	装備
トランス10、シス12共役リノール酸	ケイマン	90145	試薬
トリシン	クールアバー	CT11331	試薬
超遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマ XE-100	装備
超音波細胞クラッシャー	シエンツ	JY92-11N	装備