方法論記事

大 腸菌 および哺乳類細胞における遺伝コード拡張による部位特異的リジンラクチル化

DOI：

10.3791/70209

⸱

2026年2月24日

 ,  ,  , 
1Synthetic Biology Center for Chinese Medicine, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、遺伝暗号拡張を利用して、大 腸菌 および哺乳類細胞におけるヒトエノーラーゼ-1(hENO1)およびスーパーフォルダーGFP(sfGFP)の特定部位にラクチルリジン(Klac)を成功裏に組み込む方法が確立されました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

乳酸化は、多様な生物学的機能を持つ最近発見された翻訳後修飾(PTM)です。2019年にマクロファージ分極の調節因子として初めて特定されて以来、ヒストンラクチル化は細胞代謝と機能的調節を結ぶ重要な連結点として浮上しています。生化学的には、ラクチル基がリジン残基に共有結合的に移動する過程を含み、ラクチルCoAをアシルドナーとして使用するラクチルトランスフェラーゼ、またはラクチルAMP中間体を介してアミノアシル-tRNA合成酵素(AARS)によって媒介されます。これらのメカニズムを通じて、細胞内の乳酸レベルはタンパク質の修飾や機能と直接結びついています。ラクチル化は、遺伝子調節、DNA修復、代謝再プログラミング、免疫調節などの生理的機能から、腫瘍の進行や転移といった病理学的プロセスに至るまで、さまざまな重要な細胞プロセスを媒介します。プロテオミクスによって多数のラクチル化部位が特定されているにもかかわらず、変異誘発による部位特異的リシンラクチル化の実現は依然として困難です。これに対処するため、ラクチルリジン特異的アミノアシルtRNA合成酵素(KlacRS)とその関連tRNAを用いて、指定残基にラチルリジン(Klac)を正確に組み込む遺伝暗号拡張技術を用います。この戦略により、直接的な機能研究のために均一なラクチル化タンパク質変異の生成が可能になります。ここでは、ヒトエノーラーゼ1(hENO1)とスーパーフォルダーGFP(sfGFP)をモデルシステムとして用い、大腸菌(Echerichia coli)および哺乳類細胞の両方で検証された部位特異的タンパク質乳酸化の簡潔なプロトコルを説明します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

リシンラクチル化(Klac)は、もともとヒストン上で同定され、異常腫瘍代謝とエピジェネティック調節を結びつける重要な結節として浮上しています。腫瘍細胞における好気性解糖作用の強化による乳酸の蓄積は、ラクチル化の代謝基盤となり、乳酸は単なる代謝副産物としてだけでなく、タンパク質機能を直接調節するシグナル分子として機能することを可能にします。増え続ける証拠は、ラクチル化ががん細胞増殖2,3,4,5、転移6、代謝再プログラミング7、治療抵抗性8,9を調整することで腫瘍の開始と進行に広く関与していることを示しています。

表現型レベルでは、乳酸化の上昇は腫瘍の攻撃性の増強と密接に関連しています。例えば、透明細胞腎細胞癌(ccRCC)では、H3K18ラクチル化が血小板由来成長因子受容体β(PDGFRβ)をアップレギュレーションすることで増殖と転移を促進し、乳酸蓄積とがんシグナル伝達の間に正のフィードバックループを形成します10。同様に、大腸がん(CRC)では、H3K18ラクチル化の上昇がルビコン様オートファジー増強子(RUBCNL)の転写強化を通じて腫瘍の進行を促進し、オートファゴソームの成熟を促進し、がん細胞の生存を支えます11。

腫瘍攻撃性への直接的な影響に加え、ラクチル化は代謝関連遺伝子の発現と活性を調節することで腫瘍代謝の再プログラムも媒介します7。非小細胞肺がん(NSCLC)では、ヒストンラクチル化が解糖系酵素をダウンレギュレーションし、トリカルボン酸(TCA)サイクル酵素をアップレギュレートし、腫瘍細胞のグルコース取り込みを促進し、代謝調節障害を悪化させます12。一貫して、グローバルなラクチルロームプロファイリングは、ラクチル化がグルコース代謝、TCAサイクル、アミノ酸/脂肪酸代謝など中心代謝経路に関与する酵素を優先的に標的にし、これらの修飾は攻撃的な腫瘍表現型と強く相関していることが示されています7。

重要なのは、ラクチル化の生物学的影響が非常に部位依存的であり、この修飾が腫瘍治療耐性の重要な決定要因として浮上していることです。CRCでは、減数分裂組換え11(MRE11)のK673ラクチル化が相同組換え(HR)修復を促進し、化学療法およびポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)阻害剤に対する耐性を付与します13。膠芽腫(GBM)では、アルデヒド脱水素酵素1ファミリーのA3(ALDH1A3)とピルビン酸キナーゼM2(PKM2)との相互作用により乳酸産生が増加し、その結果、X線修復交差補完タンパク質1(XRCC1)のK247乳酸化が誘導され、DNA損傷修復を促進し、放射線耐性およびテモゾロミド(TMZ)化学抵抗性14を駆動します.これらの研究は、定義されたリシン残基におけるラクチル化の正確な制御が、機構的解剖および治療的標的化に不可欠であることを強調しています。

高分解能質量分析の進歩により、代謝酵素、転写因子、シグナル伝達トランスデューサーにまたがる広範なラクチル化が明らかになり、代謝、シグナル伝達、細胞生理学の制御における広範な役割が強調されました(15,16,17,18)。これまでに、ラクチル化を触媒する複数のライター酵素が報告されています。例えば、AARS1はp53ラクチル化を媒介して腫瘍形成を促進します19、AARS1/2はcGASラクチル化を調節して自然免疫を抑制しますが、これらの酵素は基質選択性であり、任意のタンパク質に対して完全な部位特異的ラクチル化を達成することは現時点ではできません。したがって、研究や治療目的でKlacをいかに操作するかという課題は依然として難しかったのです。

機能的研究は依然として主に部位指向変異誘発に依存しており、通常はリジン(K)をグルタミン(Q)に置換して、アセチル化やラクチル化などのアシルリジン修飾の非荷電状態を模倣します(21,22,23,24)。しかし、このアプローチはネイティブラクチル化を忠実に再現する上で大きな制約があります。グルタミンの化学構造や側鎖形状はラクチル化リジンとは異なり、重要なのはKからQへの置換では、同じ部位でアセチル化とラクチル化状態を区別できないことです。

遺伝暗号拡張(GCE)は、定義された部位で非標準的なアミノ酸をタンパク質に直接組み込むことで、これらの制約に対する強力な解決策を提供します。Methanosarcina mazeiのピロリシル-tRNA合成酵素(MmPylRS)変異ライブラリーの陽性スクリーニングにより、以前にKlac依存性成長を示すバリアントを特定しました。この変異体はL301M、Y306L、L309A、C348Fの突然変異を持ち、KlacRS125,26と指定されました。KlacRS1は、同源の直交tRNAをKlacとアミノアシル化し、琥珀のストップコドンを抑制し、Klacを標的タンパク質に効率的かつ部位特異的に組み込むことを可能にします。KlacRS1に加え、MbPylRS由来のLacKRS(L270I/Y271L/L274A/C313F)やLacKRS3(Y271M/C313S)19,27、さらにMmPylRS由来のLacKRS(C348T/Y384F)28など、Klacを取り込むことができる複数のaaRSバリアントも報告されています。これらのツールは、個々のラクチル化イベントの生物学的影響を理解するために、サイト特異的ラクチル化タンパク質変異を生成するための多用途な遺伝学ツールキットを確立します。

これまでの研究では、このGCEベースのシステムを応用し、Lys147に部位特異的なラクチル化を持つALDOAタンパク質を大腸菌および哺乳類細胞の両方で発現させました。機能的解析により、Lys147での乳酸化が解糖作用に負のフィードバック効果を及ぼし、ALDOAの熱的および化学的安定性を高め、細胞質から核への転座を促進することが示されました。これらの結果は、ALDOAのこれまで認識されていなかった調節機構を明らかにしただけでなく、この部位特異的ラクチル化プラットフォームの堅牢性、多様性、実用的な有用性を検証しました25,26。この基盤を基に、ここではヒトエノーラーゼ1(hENO1)とスーパーフォルダーGFP(sfGFP)を代表例として用い、直交型KlacRS/tRNAシステムを用いて正確なKlac組み込みの効率的な戦略を説明します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ラクチルリシンを標的遺伝子に遺伝的にコードするための琥珀ストップコドン変異誘発

  1. 製造元のプロトコルに従い、サイトディグレイン変異誘発により hENO1 遺伝子の89位およびsfGFP 遺伝子149位にTAGアンバーストップコドンを導入し、PCR産物を精製し、相同組換えを行います。以下のプライマーを使用してください。
    ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGタグATTGACAAACTGATGATCGAG
    ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTGTGTGTGACGTTCAGTTTCTTG
    sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATタグGTGTATATCACCGCCGACAAGC
    sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTTGAAGTTATTACCCAC
    注意:ラクチル化リジンの部位特異的組み込みには、標的部位をアンバーストップコドン(TAG)やその他のナンセンスコドンに変異させ、TAAまたはTGAを真のストップコドンとして使用すべきです。
  2. DH5αの正常細胞を氷上で解凍し、組換え産物5μLと細胞50μLを混ぜて30分間氷上で培養します。混合物を42°Cで45秒の熱ショックにさらし、その後2〜3分間氷に置きます。LB培地350μLを加え、37°Cで振って(220rpm)1時間培養します。
  3. 細胞をアンピシリンを含む予熱したLBプレートに広げ、37°Cで12〜16時間培養します。突然変異を確認するためにサンガーシーケンスのために2つの単一コロニーを選びます。

2. 大 腸菌 細胞における乳酸化タンパク質の発現

  1. 50μLの 大腸菌 DH10B化学的に適格な細胞と、標的遺伝子をコードするpBad-ENO1-K89TAGと、KlacRSとtRNAペアをコードするpEvol-MmKlacRS1(Addgeneプラスミド#232157)を共変換します。
  2. 混合物を氷の上で25分間孵化し、42°Cで45秒熱衝撃を与え、再び氷に戻して3分間保存します。室温のLB培地350μLを加え、37°Cで220rpmで1時間激しく振る。
  3. 細胞培養液をLB/プレートに広げ、アンピシリン100 μg/mL(アンペア100)とクロランフェニコール50 μg/mL(Cm50)を補足します。プレートを37°Cで12〜16時間培養します。
  4. 4mLのスターター培養液を接種するために単一のコロニーを選び、一晩培養します。翌日、一晩培養液を100Cm50 のLB/Amp 400 mLに拡張し、220 rpm、37°Cで激しく振ってOD 600が0.6-0.8に達するまで続けます。
  5. 0.2%のL-アラビノースと1 mM Klacを誘発します。30°C、220rpmでさらに16時間孵育します。

3. HEK 293T細胞におけるラクチルリシンの遺伝的コード

  1. 12ウェルプレート内の種子細胞を、1 mLのDMEM培地で1 x 10 x5 細胞の密度で設置します。24時間の培養後、細胞のコンフルエンシーが70%〜80%に達したらトランスフェクションを行います。
    注意:トランスフェクションでは70%〜80%のコンバーンが推奨されますが、コロニー形成アッセイではシーディング密度が低く、経験的に決定する必要があります。
  2. 希釈されたDNA溶液を製製するには、pcDNA-sfGFP-N149TAGおよびpNeu-KlacRS(Addgeneプラスミド#232155)を1:1の比率で38μLの高グルコースDMEMに添加します。ピペットを上下に優しく動かしたり、短く渦巻きて混ぜます。
  3. 希釈されたトランスフェクション試薬を製製するには、2.25μLのトランスフェクション試薬を高グルコースの血清フリーDMEM38μLに加えます。ピペットを上下に3〜4回優しく動かして混ぜます。
    注:Opti-MEMの使用可能かどうかは、その血清含有量がトランスフェクション効率に影響を与える可能性があるため、製造元の指示によります。
  4. 希釈したトランスフェクション試薬を一度に希釈したDNA溶液に加えます。
    注意:溶液を逆の順に混ぜないでください。
  5. すぐにピペットを上下に3〜4回、または短くボルテックスで混ぜます。室温で10〜15分間培養し、トランスフェクションやDNA複合体が形成されます。
    注意:トランスフェクション/DNA複合体は、準備から20分以内に使用してください。
  6. 50μLのトランスフェクション/DNA混合物を各ウェルの培地にドロップ順に加え、プレートを優しく渦巻きながら均質化します。
  7. トランスフェクションから6時間後に、1 mM Klacを含む新しいDMEMに交換します。24〜48時間の培養。
    注:以前のデータに基づくと、1〜5 mM濃度のKlacは細胞26に対して細胞毒性の影響を示しませんでした。Klacの作動濃度はタンパク質発現レベルに基づいて最適化されるべきです。標的タンパク質がラクチル化修飾の喪失しやすい場合は、HDAC阻害薬(例:トリコスタチンA)またはシルトゥイン阻害薬NAM(ニコチンアミド)の投与が推奨されます。

4. 大 腸菌 細胞における乳酸化タンパク質のHisタグ精製

  1. 細胞を6,900 x g で遠心分離し、4°Cで10分間採取します。 50 mLの溶解バッファー(20 mM Tris-HCl、pH 8.0、200 mM NaCl)に再懸濁します。氷上で超音波解析で3秒パルス、8秒間隔、200Wで30分間溶除します。13,800 x g、4 °Cで30分間遠心分離し、その後上清液を採取します。
    注意:標的タンパク質が機械的せん断に感受性がある場合、超音波処理の代わりに大 腸菌に適した調製されたタンパク質抽出試薬を用いた穏やかな細胞溶解に置き換えることができます。
  2. 0.45μmの膜を通して上清液をろ過し、可溶性分画を収集します。精製した溶解液を1 mLのNi-NTA重力カラムに積み込みます。約5 mLのバッファーA(20 mM Tris-HCl、pH 8.0、200 mM NaCl)で洗浄します。
    5 mMイミダゾール)を、エリュート中に検出可能なタンパク質が見つからなくなるまで投与します。バッファーB1mL(20 mM Tris-HCl、pH 8.0、200 mM NaCl、200 mM イミダゾール)でタンパク質を5回洗出します。すべての分数を保存してください。ブラッドフォードアッセイで溶出タンパク質の有無を調べましょう。
  3. 精製されたタンパク質分画を結合し、バッファー交換を貯蔵バッファー(20 mM Tris-HCl、pH 8.0、150 mM NaCl)に行います。濃縮タンパク質を各チューブで50μLに分割し、急速冷凍して-80°Cで保存し、次の分析を行います。

5. ラクチル化タンパク質の生化学的特徴付け

  1. SDS-PAGEとウェスタンブロッティング
    1. SDS-PAGEでタンパク質を分離します(90Vで20分、次に150Vで50分)。ジェルをクマッシーブルーで染色し、電子レンジで15秒加熱し、シェーカー(50rpm、15分)で脱色液(40%絶対エタノール、10%氷河酢酸、50%脱イオン水)で染みます。染色の工程を繰り返し、タンパク質帯がはっきり見えるまで続けます。
    2. メタノールにPVDF膜を1分間活性化します。転写スタックを順番に組み立てます:スポンジ、フィルターペーパー、ゲル、メンブレン、フィルターペーパー、スポンジ。事前に冷却されたバッファーで250 mAで1時間転送を行います。膜を5%脱脂乳で1.5時間ブロックし、その後TBSTで3回(各10分)洗います。
    3. 一次抗体(Anti-His 1:10,000;抗L-ラクチルリジン1:1,000)を4°Cで一晩投与しました。TBSTで3回洗ってください。
      注:最適な希釈比率は、異なる市販の抗体に対して経験的に決定すべきです。
    4. ウサギの二次抗体(1:10,000)を室温で1.5時間培養します。TBSTで3回洗ってください。化学発光を用いた画像と画像ラボでの保存データ。
  2. 質量分析解析
    1. 完全な質量分析の場合、タンパク質を0.1%の蟻酸(FA)を含む水で最終濃度0.1 μg/Lまで希釈し、超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)システムにかけます。移動相は溶媒A(水中の0.1% FA)と溶媒B(アセトニトリル、ACN)で構成され、流量は0.3 mL/minでした。
    2. hENO1-89Klacの分子量を、m/z範囲を300-2000に設定した高分解能四重極飛行時間分析計(Q-TOF)を用いて測定します。すべてのデータをMassLynxソフトウェアで収集・処理します。
    3. プロテオーム解析では、前述の通り、ナノフロー液体クロマトグラフィーシステムを高分解能トリブリッド質量分析器と分析し、解析装置を搭載します。移動相は溶媒A(水中で0.1%のFA)と溶媒B(ACN/水、8:2、v/v)で構成され、流量は300 nL/minでした。
    4. 逆相C18毛細血管カラム(75μm x 250mm)上の別々のペプチドは、90分勾配で3%-8%B(0-5分)、8%-28%B(5-60分)、28%-38%B(60-75分)、38%-100%B(75-80分)、100%B(80-90分)です。m/z 350-1800で解像度120,000、AGCターゲット4e5でMS1スペクトルを取得します。高エネルギー衝突解離(HCD)断片化(衝突エネルギー=32%)によりMS2スペクトルを生成する。第一質量はm/z 110、分解能は30,000、AGCターゲットは5e4。
  3. フローサイトメトリー解析
    1. セルを事前に冷却したPBSバッファーで2回洗浄し、洗った後は1,380 x g で3分間遠心分離します。遠心分離後に得られた細胞ペレットを500μLのPBSバッファーに再懸浮させ、優しくピペットで混合します。細胞懸濁液を300メッシュの無菌ガーゼでろ過し、細胞凝集体からの干渉を最小限に抑えるためにフローサイトメトリーチューブにろ過液を採取します。蛍光信号を検出するために、デュアルレーザーを備えたフローサイトメーターを用いて分析します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

まず、大腸菌のタンパク質へのKlac特異性の組み込みを評価しました。ヒトエノーラーゼ1(hENO1)の遺伝子は、残基K89(hENO1-89TAG)に琥珀色の停止コドンを含むように設計され、この構成は直交するKlacRSおよびそれに対応するtRNA対と共発現していました。1 mM Klac補足がなかったため、全長のhENO1は検出されませんでした。対照的に、1 mM Klacを培養培地に加えると、位置89にKlacを含む全長hENO1(hENO1-89Klac)が~1.2 mg/Lの収量で生成されました(図1A)。全長hENO1の存在およびKlacの選択的組み込みは、抗Hisタグおよび抗L-ラクチルリジン抗体を用いた免疫ブロットによって確認されました(図1B-C)。精製されたhENO1-89Klacは、エレクトロスプレーイオン化飛行時間質量分析(ESI-TOF MS)を受けました。図2A

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、原核細胞および真核細胞の両方におけるKlacの部位特異的タンパク質組み戦略を説明します。標的遺伝子の望ましい位置に琥珀のストップコドンを導入し、宿主細胞内の直交するKlacRS/tRNAペアと共発現させることで、本物のラクチルリジンを生細胞のタンパク質に正確に組み込むことができ、ラクチル化特異的生物学を探る強力なツールを提供します。

代表的な機能タンパク質であるhENO1とsfGFPをモデルシステムとして用いて、このワークフローの実現可能性を示しました。hENO1は多機能解糖酵素であり、2-ホスホグリセレートをホスホエノールピルビン酸への変換を触媒します。細胞増殖、低酸素適応、アレルギー反応、免疫調節など、多様な生物学的プロセスに関与しています。特に、本研究で特徴付けられたK89を含む腫瘍細胞のENO1上に複数の乳酸化部位が確認されており、転写抑制因子および腫瘍抑制因子としての潜在的な役割が浮き彫りになりました。sfGFPは、生細胞研究で広くラベル付けや追跡に用いられる堅牢な蛍光レポータータンパク質です。...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は中国国家自然科学基金(22377058)、南京中国医学大学の伝統中国医学合成生物学分野横断資金、国家高水準人材特別支援プログラム(1万人プログラム)—若手人材の支援を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6*his、His tag 組換えモノクローナル抗体プロテインテック84814-1-RR6×を標的とする特異的な免疫グロブリンのクラス;彼のタグ(6つの連続したヒスチジン残基からなる短いペプチド、HHHHH)は組換えタンパク質に存在します。
ACQUITY UPLCシステム水域超高性能液体クロマトグラフィー
抗L-ラクチルリシンウサギmAbPTMバイオラボPTM-1401RML-ラチルリジン(Klac)を標的とした特定の免疫グロブリンのクラスであり、タンパク質の翻訳後修飾(PTM)です。
ClonExpress II ワンステップクローンキットVazyme C112シンプルで迅速、かつ効率的なDNAシームルクローニング技術に基づき、挿入断片は任意のベクターの任意の部位に方向性的にクローン化することができます。
CytoFlexフローサイトメーターベックマン・カウルター高感度検出および多色解析能力を備えたフローサイトメーター
DH10BバイオラビットEC005H-Sプラスミド形転換、遺伝子クローニング、青白スクリーニングのための有能な細胞の一種です。
DH5&α;Vazyme C502プラスミド形転換、遺伝子クローニング、青白スクリーニングのための有能な細胞の一種です。
EASY-nano LC 1200システムサーモフィッシャー・サイエンティフィック高感度・高分解能の複雑な試料を分離するためのナノ液体クロマトグラフィー
オービトラップ・エクリプス・トリブリッド質量分析計サーモフィッシャー・サイエンティフィック旗艦級の高性能三重線液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)システム
ファンタマックス・スーパーフィデリティDNAポリメラーゼVazyme P505高速増幅と忠実度を兼ね備えた高忠実度の単一酵素
ポリジェットシグナジェンSL100688PolyJet DNA In Vitroトランスフェクション試薬は、細胞毒性の低く効果的かつ再現性の高いトランスフェクションを保証する強力なトランスフェクション試薬として調合されています。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  2. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m6A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  3. Pan, L., et al. Demethylzeylasteral targets lactate by inhibiting histone lactylation to suppress the tumorigenicity of liver cancer stem cells. Pharmacol Res. 181, 106270(2022).
  4. Xu, H., et al. Royal jelly acid suppresses hepatocellular carcinoma tumorigenicity by inhibiting H3 histone lactylation at H3K9la and H3K14la sites. Phytomedicine. 118, 154940(2023).
  5. Chai, P., Zhao, F., Jia, R., Zhou, X., Fan, X. Lactate/lactylation in ocular development and diseases. Trends Mol Med. 31 (12), 1073-1076 (2025).
  6. Wang, G., et al. The relationship and clinical significance of lactylation modification in digestive system tumors. Cancer Cell Int. 24 (1), 246(2024).
  7. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  8. Chen, L., et al. Lactate-lactylation hands between metabolic reprogramming and immunosuppression. Int J Mol Sci. 23 (19), 11943(2022).
  9. Sun, X., et al. The diapause-like colorectal cancer cells induced by smc4 attenuation are characterized by low proliferation and chemotherapy insensitivity. Cell Metab. 35 (9), 1563-1579 (2023).
  10. Yang, J., et al. A positive feedback loop between inactive VHL-triggered histone lactylation and PDGFRβ signaling drives clear cell renal cell carcinoma progression. Int J Biol Sci. 18 (8), 3470-3483 (2022).
  11. Li, W., et al. Tumor-derived lactate promotes resistance to bevacizumab treatment by facilitating autophagy enhancer protein Rubcnl expression through histone H3 lysine 18 lactylation (H3K18la) in colorectal cancer. Autophagy. 20 (1), 114-130 (2024).
  12. Jiang, J., et al. Lactate modulates cellular metabolism through histone lactylation-mediated gene expression in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 11, 647559(2021).
  13. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311 (2024).
  14. Li, G., et al. Glycometabolic reprogramming-induced XRCC1 lactylation confers therapeutic resistance in ALDH1A3-overexpressing glioblastoma. Cell Metab. 36 (8), 1696-1710.e10 (2024).
  15. Liberti, M. V., Locasale, J. W. The warburg effect: How does it benefit cancer cells. Trends Biochem Sci. 41 (3), 211-218 (2016).
  16. Varner, E. L., et al. Quantification of lactoyl-CoA (lactyl-CoA) by liquid chromatography mass spectrometry in mammalian cells and tissues. Open Biol. 10 (9), 200187(2020).
  17. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311.e21 (2024).
  18. Chen, H., et al. NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance. Nature. 631 (8021), 663-669 (2024).
  19. Zong, Z., et al. Alanyl-trna synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis. Cell. 187 (10), 2375-2392.e33 (2024).
  20. Ju, J., et al. The alanyl-tRNA synthetase AARS1 moonlights as a lactyltransferase to promote YAP signaling in gastric cancer. J Clin Invest. 134 (10), e174587(2024).
  21. Sun, L., et al. Lactylation of METTl16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 14 (1), 6523(2023).
  22. Mao, Y., et al. Hypoxia induces mitochondrial protein lactylation to limit oxidative phosphorylation. Cell Res. 34 (1), 13-30 (2024).
  23. Lv, L., et al. Mitogenic and oncogenic stimulation of K433 acetylation promotes PKM2 protein kinase activity and nuclear localization. Mol Cell. 52 (3), 340-352 (2013).
  24. Okada, A. K., et al. Lysine acetylation regulates the interaction between proteins and membranes. Nat Commun. 12 (1), 6466(2021).
  25. Wan, N., et al. Cyclic immonium ion of lactyllysine reveals widespread lactylation in the human proteome. Nat Methods. 19 (7), 854-864 (2022).
  26. Shao, C., et al. Genetic code expansion reveals site-specific lactylation in living cells reshapes protein functions. Nat Commun. 16 (1), 227(2025).
  27. Sun, Y., et al. Genetic encoding of ε-N-L-lactyllysine for detecting delactylase activity in living cells. Chem Commun (Camb). 58 (61), 8544-8547 (2022).
  28. Ren, C., et al. Expanding the scope of genetically encoded lysine post-translational modifications with lactylation, β-hydroxybutyrylation and lipoylation. Chembiochem. 23 (18), e202200302(2022).
  29. Hu, Y., et al. Engineering unnatural cells with a 21st amino acid as a living epigenetic sensor. Nat Commun. 16 (1), 9388(2025).
  30. Elsasser, S. J., Ernst, R. J., Walker, O. S., Chin, J. W. Genetic code expansion in stable cell lines enables encoded chromatin modification. Nat Methods. 13 (2), 158-164 (2016).
  31. Zhu, W., Fan, C., Hou, Y., Zhang, Y. Lactylation in tumor microenvironment and immunotherapy resistance: New mechanisms and challenges. Cancer Lett. 627, 217835(2025).
  32. Mills, E. M., Barlow, V. L., Jones, A. T., Tsai, Y. H. Development of mammalian cell logic gates controlled by unnatural amino acids. Cell Rep Methods. 1 (6), 100073(2021).
  33. Italia, J. S., et al. Genetically encoded protein sulfation in mammalian cells. Nat Chem Biol. 16 (4), 379-382 (2020).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

tRNA

関連記事