2型糖尿病における腸内細菌叢と代謝変化:16S rDNAシーケンシングとバイオインフォマティクスからの洞察

サマリー

本研究は、2型糖尿病(T2DM)における腸内細菌叢の多様性の減少と代謝経路の変化を特定し、プロテオバクテリアの増加と有益な分類群の減少を強調し、T2DMに関連する微生物の不全がその病態生理に寄与している可能性を示唆しています。

要約

2型糖尿病(T2DM)の世界的な増加は、特に宿主とマイクロバイオームの相互作用に関わるその根本的な生物学的メカニズムをより深く理解する必要性を強調しています。本研究は、新たに診断されたT2DM患者と非糖尿病適合(NM)群を比較して、腸内微生物の多様性、分類学的構成、および予測される代謝経路を特徴づけることを目的としました。新鮮な便サンプルは16S rDNAシーケンスを用いて分析しました。アルファ多様性(Chao、ACE、Shannon、Simpson指数)およびベータ多様性を計算し、微生物群落構造を評価しました。分類学的差異は、ウィルコクソンランク-総和検定および線形判別分析効果サイズ(LEfSe)を用いて評価されました。機能経路予測は、KEGGおよびMetaCycアノテーションに基づく未観測状態の再構築による群集の系統解析(PICRUSt2)を用いて実施されました。逆分散重み付け、MR-エッガー法、加重中央値法を含むメンデルランダム化(MR)解析を用いて、微生物分類群とT2DMとの遺伝的に予測された関連性を評価しました。結果は、T2DM患者において、Chao指数およびACE指数の低下に反映される微生物の豊富さの低下と、シャノン指数の低下と高いシンプソン指数に見られる多様性構造の変化、そして著しい組成の変化を示しました。プロテオバクテリアの相対的な個体数の増加と、ラクノスピラテ科やブラウティアなどの有益な分類群の個体数の減少が観察されました。機能的予測では、非酸化性ペントスリン酸経路、イソブタノール生合成、L-イソロイシン生合成に関連する経路の存在量が減少していることが示されました。MR解析は、特定の微生物分類群とT2DM感受性との関連を支持する補完的な証拠を提供しました。結論として、T2DMは微生物の豊富さの低下、多様性構造の変化、そして明確な分類学的および機能的変化と関連しています。これらの発見は、T2DMにおける腸内細菌叢の重要性を強調し、マイクロバイオームベースのバイオマーカーや治療戦略の有用性を支持しています。これらの発見を検証し、その根本的なメカニズムを明らかにするためにさらなる研究が必要です。

概要

2型糖尿病(T2DM)は、急速な都市化、西洋化された食生活パターン、そしてますます座りがちな生活様式により、世界的に最も急速に増加している慢性疾患の一つとなっています^1,2。これは世界の罹患率と死亡率に大きく寄与し、公衆衛生上も大きな負担^{となります。}遺伝的感受性も影響しますが、T2DMの発生率の急増は環境および代謝^{決定因子の}重要性を浮き彫りにしています。したがって、修正可能な生物学的メカニズムを特定することは、早期発見と予防戦略を改善するために不可欠です。最近の進展により、腸内細菌叢が代謝恒常性の重要な調節因子であることが特定^{されています。}腸内微生物生態系は、グルコース代謝、免疫機能、腸の関門の健全性、慢性的な低度度炎症に影響を与え、これらはすべてT2DM⁶の病因の中心的要因です。ディスバイオシスは肥満、インスリン抵抗性、内毒素血症、エネルギーバランスの変化と関連しており、微生物の変化と疾患進行の間にメカニズム的関連があると示唆されています⁷。さらに、短鎖脂肪酸、胆汁酸、分枝鎖アミノ酸などの微生物代謝物がインスリン感受性および宿主代謝の調節に関与していることが示唆^{されています。}

蓄積される証拠は腸内細菌叢がT2DMに果たす役割を支持していますが、既存の多くの研究は観察設計に依存しており、因果推論は限定的です。ショットガンメタゲノミクスやターゲットメタボロミクスなどの代替アプローチは、より高解像度の機能的洞察を提供しますが、コスト、計算複雑さ、探索的またはパイロット規模の研究における実現可能性の限界により制約を受けることが多いです。これに対し、16S rDNAシーケンシングはコスト効率が高く広く採用されている微生物群集構成のプロファイリング方法ですが、その分類学的解像度は種レベルに限定され、機能的代謝物を直接定量することはできません。したがって、16S rDNAシーケンシングは、探索的臨床コホートに適したコスト効率が高くスケーラブルなアプローチとして本研究に選ばれ、さらに下流の機能予測や補完的な分析フレームワークとの統合を可能にします。したがって、16Sベースの微生物プロファイリングとバイオインフォマティクスの機能予測、メンデルランダム化(MR)などの補完的アプローチを統合することで、組成的および潜在的因果関係の両方を探るバランスの取れた枠組みを提供する可能性があります。

特に、新たに診断され治療未経験のT2DM患者に焦点を当てたデータは相対的に不足しています。このような集団では、特にメトホルミンは腸内細菌叢の構成^{や機能を著}しく変えることが知られている薬理学的介入によって微生物の変化が混同されにくい9。これは、既存の多くの研究が治療曝露が異なる異質な患者集団を対象とし、マイクロバイオームプロファイリングと遺伝的解析アプローチの統合が限定的であるため、現在の文献における重要なギャップを示しています。

この文脈で、本研究は16S rDNAシーケンシングとバイオインフォマティクス解析を用いて、新たに診断されたT2DM患者とNM群を比較して腸内細菌叢の多様性、分類学的構成、機能経路の予測を特徴づけることを目的とした。さらに、公開されているゲノム全関連データを用いてメンデルランダム化を適用し、特定の微生物分類群とT2DMリスクとの遺伝的予測関連の可能性を探りました。この統合分析戦略により、微生物群集プロファイリングと集団レベルの遺伝データから補完的な知見が得られます。具体的には、16S rDNAシーケンシングは研究集団における微生物組成を直接的に特徴づけ、メンデルランダム化は独立したコホートからの遺伝的手法を活用し、観察された関連が遺伝的に予測された関係と整合しているかどうかを評価します。この統合は、観察マイクロバイオーム研究の主要な限界を補完し、微生物叢とT2糖尿病の関連性の堅牢性を支持する補完的な証拠を提供することを意図しています。したがって、これらの手法を統合することは冗長性ではなくクロスバリデーションを提供し、微生物叢とT2DMの関連の解釈可能性を強化することを目的としています。

本研究は三つの側面に焦点を当てています。第一に、新たに診断され治療未経験のT2DM患者における腸内細菌叢の変化を評価し、薬理学的介入による交絡因子を低減します。第二に、分類学的プロファイリングと予測される機能経路を統合し、微生物叢に関連する代謝変化をシステムレベルで把握すること。第三に、メンデル無作為化解析を取り入れ、観察される関連が遺伝的に予測された関係と整合しているかどうかを評価し、方法論的な三角測量を提供します。これらの側面は総合的に、純粋に記述的な研究ではなく、マイクロバイオーム解析において補完的かつ再現可能な枠組みを提供し、単一手法の観察デザインに依存し、微生物プロファイリング、機能予測、遺伝的推論を統合しない従来の研究と区別されます。

プロトコル

人間参加者を含むすべての処置は重慶陳家橋病院の倫理委員会(承認番号20240131)によって審査・承認されました。サンプル採取前に全参加者から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。すべての便サンプルおよび参加者情報は、 材料表に記載された非識別化された研究コードを使用して処理されました。

参加者のスクリーニングと登録

2023年6月から12月にかけて重慶陳家橋病院を訪問した新たに診断されたT2DM患者を対象に適格性をスクリーニングしました。参加者は20歳から65歳の間で、新たに2型糖尿病と診断され、新しい便サンプルの提供に同意し、必要な病歴評価および臨床検査を完了した場合、DMグループに登録されました。同時期に募集された健康なボランティアは非糖尿病マッチング(NM)グループとして含まれ、年齢、性別、一般的な人口統計的特徴に関してDMグループにできるだけ近いマッチングを行いました。血液疾患、中枢神経系疾患、活動性リウマチ疾患、自己免疫疾患、急性または慢性消化器感染症、慢性下痢、便秘、活動性または治癒中の消化管潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、腸結核、消化器腫瘍、その他の悪性腫瘍、重度の心不全、重度肝不全、重度腎不全、その他の重度代謝疾患がある場合は除外されました病気、栄養失調、免疫不全、先天性代謝障害、精神疾患、鎮静・催眠薬の使用、または薬物乱用。また、便採取の1か月前に抗生物質、胃酸抑制剤、消化管運動促進薬、プロバイオティクス、グルココルチコイド、免疫抑制剤を投与した場合は除外されました。さらに、下痢を経験した人、消化器外科手術や消化器内視鏡検査を受けた人、便採取1か月前に生活環境や食習慣に急激な変化があった者は除外されました。サンプル採取前に、各対象参加者に固有の研究コードが割り当てられました。対象コホートから、新たに診断されたT2DMおよび12名のNM参加者が、サンプルの入手可能性とシーケンシング品質要件に基づき、下流の16S rDNAシーケンスおよびマイクロバイオーム解析のために選抜されました。

便の採取と保管

各参加者には、非識別化のために割り当てられた研究コードのみがラベル付けされた無菌便採取容器が提供されました。参加者は排便前に膀胱を排出し、尿の汚染を最小限に抑え、トイレの水、尿、消毒剤、その他の潜在的な汚染物質に触れずに新鮮な便を直接滅菌容器に集めるよう指示されました。採取直後、約1〜2gの便を無菌の使い捨てサンプリングスプーンを用いて無菌の低温チューブに移しました。チューブはしっかりと密閉され、すぐにドライアイスまたは予冷えた転送容器に入れられました。すべてのサンプルは採取後2時間以内に検査室へ運ばれました。研究所到着後、研究コードが検証され、各チューブに漏れや目に見える汚染がないか検査されました。すべてのサンプルの採取および保管時間が記録されました。便サンプルはその後、ゲノムDNA抽出まで−80°Cで保存されました。サンプルは、保管および輸送中に完全に凍結された状態で、チューブ漏れや外部汚染の証拠がない場合のみ、下流分析として認められました。

ゲノムDNA抽出

便サンプルは−80°Cの保存から採取し、処理前に氷に保管されました。各サンプルは、繰り返しの凍結・解凍サイクルに伴う分解を最小限に抑えるため、均質化が可能になるまでのみ解凍されました。約200mgの便が無菌のマイクロ遠心分離機チューブに移され、便DNA抽出キットに付属していた溶解緩衝剤は、 材料表に記載された製造元の指示に従って追加されました。サンプルは30秒間激しく渦巻きさせて完全な均質化を達成し、その後室温で5〜10分間培養して細胞溶解を促進しました。溶解後、サンプルは12,000× g で4°Cで10分間遠心分離されました。 上清液はペレットを乱さずに新しい無菌マイクロ遠心分離機チューブに慎重に移されました。その後、メーカーのプロトコルに従い、キットに付属していたエリューションバッファーまたはヌクレアーゼフリー水を用いてゲノムDNAを溶出しました。抽出されたDNAは短期使用のために−20°C、長期保存のために−80°Cで保存されました。下流解析に適したDNAサンプルは透明で、目に見える粒子状物質は含まれていませんでした。

DNA品質評価

DNA品質はアガロースゲル電気泳動および蛍光に基づく定量を用いて評価されました。1%アガロースゲルを電気泳動バッファーで準備し、抽出したDNAサンプルをローディングバッファーと混合してゲルウェルにロードしました。DNAバンドが十分に分離されるまで電気泳動を行い、その後、紫外線または青色光の下でゲルを検査しました。DNAの完全性は、著しい劣化や過度な塗りつぶしなく完全なゲノムDNAバンドが観察された場合に許容範囲とされました。その後、蛍光ベースのDNA定量システムを用いてDNA濃度を定量しました。その後、サンプルは下流PCR増幅に必要な濃度まで希釈されました。高品質なDNAサンプルは通常、アガロースゲル電気泳動で明確なバンドを示し、その後の増幅手順に十分な濃度が確保されていました。

16S rDNA V3–V4領域のPCR増幅

細菌の16S rDNAのV3–V4高可変領域は、バーコードプライマーを用いて増幅されました。プライマー配列は以下の通りで、前方プライマー5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′、逆プライマー5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′でした。PCR反応は、4μLのPCRバッファー、2μLのヌクレオチド混合物(2.5 mmol/L)、各0.8 μLの順位・逆プライマー(5 μmol/L)、0.4 μLの高精度DNAポリメラーゼ、10 ngのテンプレートDNA、そして体積に対してヌクレアーゼフリーの水を含む20 μLの氷上で準備されました。反応混合物はピペットで優しく混合され、短時間遠心分離してチューブ底部の液体を集めました。PCR増幅は以下のサイクル条件で行われました:95°Cで5分間の初期変性、その後95°Cで30秒間の変性25サイクル、55°Cで30秒のアニーリング、72°Cで30秒伸長、最終72°Cで10分間の拡張ステップ。増幅バイアスを最小限に抑えるため、各サンプルは三次反応で増幅され、同じサンプルから得られたPCR産物はその後、単一のチューブにプールされました。アガロースゲル電気泳動で期待されるサイズのクリアなアンプリコンバンドの存在により、増幅が成功したことが確認されました。

PCR産物の検証と精製

PCR産物は2%アガロースゲル電気泳動を用いて検証されました。各サンプルの結合PCR産物をゲルにロードし、ターゲットアンプリコンバンドが明確に分離されるまで電気泳動しました。期待されるアンプリコンサイズに対応する帯は、清潔で滅菌された刃で除去され、製造元の 材料表に記載された指示に従ってゲル抽出キットで精製されました。精製されたPCR産物はその後、洗脱バッファーまたはヌクレアーゼフリー水で溶出されました。各精製PCR産物の濃度は蛍光ベースのDNA定量システムを用いて定量され、その濃度値は下流ライブラリーの準備のために記録されました。アガロースゲル電気泳動により、期待されるアンプリコンサイズの単一の透明バンドによって増幅および精製が成功しました。

図書館の準備とプール化

配列決定ライブラリーは、製造元の 材料表に記載された指示に従い、DNAライブラリー調製キットを用いて作成されました。シーケンスアダプター配列は標準ライブラリの調製ワークフローに従い、精製アンプリコンに結ばれました。アダプターライゲートされた製品は、選択したライブラリーの調製プロトコルに応じてゲル抽出またはビーズベースの精製法で精製されました。精製ライブラリー製品は、適切な断片分布を確認するために2%アガロースゲル電気泳動を用いて評価されました。ライブラリーの濃度は蛍光ベースのDNA定量システムを用いて定量されました。DNA濃度と断片サイズに基づき、各ライブラリーはサンプル間の配列深さのバランスを保つために同じモル濃度に正規化されました。同量の個別ライブラリを1:1の比率でプールし、最終的なシーケンシングライブラリプールを生成しました。シーケンス前に、プールされたライブラリはシーケンスプラットフォームのプロトコルに従って変性処理され、サンプルローディングが行われました。シーケンシングに適したライブラリは、予想されるサイズ範囲内で明確な断片分布を示し、下流のシーケンス解析に十分な濃度を示しました。

ペアエンドシーケンス

最終的なプールライブラリは、メーカーの標準作業手順に従ってペアエンドシーケンスプラットフォームにロードされました。ペアエンドシーケンシングは、2×250 bpまたは2× 300 bpのラン構成を用いて実施され、各サンプルの微生物多様性の包括的な特性評価のために十分なシーケンス深度を確保しました。シーケンス品質は、プラットフォーム生成の品質指標を用いて実施期間中ずっと監視されました。シーケンス完了後、各サンプルに対して生のペアエンドFASTQファイルがエクスポートされ、後続のバイオインフォマティクス解析が行われました。シーケンシングデータセットは、サンプルあたり十分なリードディープ、適切なQ30品質スコア、バーコード割り当ての成功を示した場合に許容範囲とされました。

生配列処理

生のペアエンドFASTQファイルは、マイクロバイオームバイオインフォマティクス解析パイプラインにインポートされ、下流処理が行われました。配列は各サンプルに割り当てられたバーコードに基づいてデマルチプレクシングされました。その後、品質の低いスコア、曖昧なベース、またはシーケンスアーティファクトを含むリードを除去するために品質フィルタリングが行われました。リードの末端にある低品質塩基は、品質スコア分布に基づいてトリミングされ、全体の配列信頼性が向上しました。品質管理の後、ペアエンドリードは重複領域間でマージされ、全長配列を再構築しました。その後のマイクロバイオーム解析のために保持された高品質な融合配列のみが残されました。

アンプリコン配列変異(ASV)生成と分類学的注釈

シーケンスノイズ除去は、DADA2やDeblurを含む検証済みノイズ除去アルゴリズムを用いてシーケンスエラーを修正し、シーケンス精度を向上させました。ノイズ除去工程でキメラ配列が特定され除去されました。その後、各サンプルに対して代表的なASV配列と対応するASV存在比表が作成されました。ASV配列の分類学的割り当てはナイーブベイズ分類器を用いて行われ、分類学的注釈はSILVA 138参照データベースに対して行われました。分類学的存在比表は、下流解析のために門、科、属レベルでエクスポートされました。最終的なASVデータセットには、各サンプルに対する代表的な配列、存在比情報、対応する分類学的注釈が含まれていました。

アルファおよびベータ多様性解析

Chao、ACE、Shannon、Simpson、Coverage 指数を含むアルファ多様性指数を計算し、サンプル内の微生物の多様性と富度を評価しました。アルファ多様性指数は平均±標準偏差で表されました。データの正規性はシャピロ–ウィルク検定を用いて評価されました。正規分布変数はDM群とNM群間でStudentのt検定を用いて比較し、正規分布でない変数はWilcoxonランク和検定で解析されました。その後、適切な距離行列を用いてベータ多様性距離を計算し、サンプル間の微生物群集組成の違いを評価しました。主座標解析(PCoA)を実施し、グループ間の微生物群集構造の違いを可視化しました。さらに、類似性分析(ANOSIM)を実施し、グループ間の違いがグループ内変動を上回るかどうかを判断し、対応するANOSIMのR値およびp値を報告しました。アルファ多様性分析はサンプル内の微生物多様性を反映し、ベータ多様性分析はグループ間の微生物群集構成の違いを評価しました。

差異分類学的解析

微生物群集の構成は、門、科、属のレベルでまとめられました。積み重ね棒プロットを作成し、個々のサンプルおよび研究グループ間で優勢分類群の相対的な存在比を可視化しました。さらに、汎・コア曲線およびベン図を構築し、DM群とNM群間の共通およびグループ特異的ASVを比較しました。グループ間の分類群個体個体数の差はウィルコクソンランク和検定を用いて評価されました。その後、LEfSe解析が行われ、集団間識別に最も強く寄与した微生物分類群を特定しました。差異分類学解析により、DM群またはNM群のいずれかに富む微生物群の同定が可能となりました。

関数予測

PICRUSt2または同等の検証済み機能予測パイプラインを用いて、16S rDNAシーケンシングプロファイルから微生物の機能経路を推定しました。ASV存在比データは選択した分析パイプラインの要件に従って正規化され、予測関数はKEGGまたはMetaCyc経路の注釈にマッピングされました。その後、DM群とNM群間で予測経路の存在量を比較しました。ヒートマップやその他の適切なグラフィカル手法を用いて、有意に異なる経路が可視化されました。予測関数は、直接測定された代謝物の存在比ではなく、推定微生物の代謝ポテンシャルとして解釈されました。機能的予測解析により、炭水化物およびアミノ酸代謝に関連する経路を含むグループ間で異なる候補微生物経路の同定が可能となりました。

メンデルランダム化解析

ゲノムワイド関連研究(GWAS)による腸内微生物叢の要旨統計は、公開データセットから取得されました。¹⁰。微生物分類群のゲノム全体で有意な関連データを、NHGRI-EBI GWASカタログ(https://www.ebi.ac.uk/gwas/)から、GCST90032172から4 GCST90032644までの登録番号を用いて取得しました。さらに、FINRISK 2002コホートからも欧州ゲノム現象アーカイブ(Research ID: EGAS00001005020)を通じてメタゲノムデータを取得しました。2型糖尿病のGWAS要約統計はNHGRI-EBIのGWASカタログ(登録番号:ebi-a-GCST006867)からも取得されました。微生物分類群に関連する遺伝的変異は、あらかじめ定められた統計的閾値に従って計測変数として選定され、連鎖不平衡の変異は除外されました。曝露データセットとアウトカムデータセットは、対立遺伝子の向きが一貫していることを保証するために調和されました。その後、主要な解析手法として逆分散加重法(IVW)を用いたメンデルランダム化解析が行われました。感度分析はMR-Egger法および加重中央値法を用いて実施されました。器具の強度はF統計量を用いて評価され、機器変数間の異質性はコクランのQ検定で評価されました。水平多面性はMR-Eggerインターセプトテストを用いて検査されました。複数の比較を考慮してボンフェローニ補正が適用されました。メンデルランダム化の結果は、因果関係の決定的な証拠というよりも遺伝的に予測された関連として解釈されました。

データ出力とエンドポイント

最終的な解析成果には、ASV存在比表、分類組成プロット、アルファ多様性指標、ベータ多様性分析、差異分類学結果、予測機能経路プロファイル、メンデルランダム化推定が含まれていました。シーケンスデータセット内のすべてのサンプル識別子は、対応する非識別化された研究コードとの整合性を確保するために検証されました。生のシーケンスファイル、処理済みASVテーブル、統計出力、図のソースファイルがアーカイブされ、後続の解析およびデータ管理に利用されました。高品質なシーケンシングデータ、分類学的プロファイル、多様性指標、予測機能経路解析、メンデルランダム化結果が成功裏に生成・検証された時点で、プロトコルは完了とみなされました。

結果

最初にスクリーニングされた臨床コホートのベースラインの人口統計学的および臨床的特徴は 表1に示されています。その後、16S rDNAシーケンスおよび下流マイクロバイオーム解析のために、12名の新たに診断されたT2DMおよび12名のNM参加者からなる代表的なサブグループが選抜されました。

シーケンス深度評価

シャノン指数を計算し、稀薄曲線をプロットしてシーケンス深度を評価しました。全サンプルで合計1,064,930配列が検出され、4,770のASVをカバーしており、高い群集の多様性を示しています。すべての曲線は平坦化されており、シーケンスデータ量が十分であり、サンプル中に存在する主要な細菌群集を反映していることを示唆しています(図1)。

微生物(アルファ)多様性解析...

ディスカッション

近年、人間のマイクロバイオーム、特に腸内マイクロバイオータは、宿主代謝、免疫調節、疾患発生において複雑かつ影響力のある要因として浮上しています。健康な宿主では、腸内細菌叢が免疫恒常性と腸の関門の完全性に寄与します¹¹。ディスバイオシスは代謝障害、自己免疫疾患、悪性腫瘍など、さまざまな病理学的状態と関連しています(12,13,14,15,16)。腸内細菌叢の構成の変化もT2DM患者で観察されており、微生物の不均衡が疾患の発症と関連していることを示唆しています^12,17。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16S rRNAプライマー（V3–V4）	サンゴンバイオテック	カスタム	細菌の16S領域用ユニバーサルプライマー
80 °C フリーザー	ハイアールバイオメディカル	DW-86L626	長期サンプル保管
アガロースゲルシステム（Sub-Cell GT）	Bio-Rad	170-4401	PCR製品検証
AMPure XPマグネティックビーズ	Beckman Coulter	A63880	DNA精製およびサイズ選択
ビードビーティングチューブ（Lysing Matrix E）	MPバイオメディカルズ	116913050	微生物細胞の機械的溶解
バイオインフォマティクスワークステーション	Dell	Precision 7920	QIIME2とRを使用したデータ分析
DADA2パイプライン	Bioconductor	バージョン1.28	シーケンスのノイズ除去とASV生成; https://benjjneb.github.io/dada2
Deblur	QIIME2	バージョン2023.5	シーケンスのノイズ除去と誤り訂正; https://docs.qiime2.org
ヨーロピアンゲノム-フェノムアーカイブ	EMBL-EBI	EGAS00001005020	公開メタゲノムデータセットリポジトリ; https://ega-archive.org
GWASカタログ	NHGRI-EBI	アクセスGCST90032172–GCST90032644	公開ゲノムワイド関連集計統計データベース; https://www.ebi.ac.uk/gwas
イルミナMiSeqシーケンシングシステム	イルミナ	SY-410-1003	高スループットシーケンシングプラットフォーム
KEGGデータベース	京都遺伝子・ゲノム百科事典	リリース107	機能的経路注釈データベース; https://www.genome.jp/kegg
MetaCycデータベース	SRIインターナショナル	バージョン27.1	代謝経路データベース; https://metacyc.org
マイクロ遠心機	エッペンドルフ	5424R	サンプル調製用冷却遠心機
Nextera XTライブラリ調製キット	イルミナ	20018705	シーケンス用ライブラリ調製
PCRマスターミック（2x PrimeSTAR Max Premix）	タカラバイオ	RR350A	高忠実度PCR用
PCRサーモサイクラー	Bio-Rad	T100	PCR増幅器
PICRUSt2	PICRUSt2開発チーム	バージョン2.5.2	16S rDNAシーケンシングデータからの機能的経路予測; https://github.com/picrust/picrust2
QIAamp Fast DNA Stool Miniキット	QIAGEN	51504	糞便サンプルからのDNA抽出
QIAquickゲル抽出キット	QIAGEN	28704	アガロースゲルからのDNA精製
Qubitフルオロメーター	Thermo Fisher Scientific	Q33226	DNA定量
Rソフトウェア	統計計算財団R	バージョン4.3.1	統計分析とメンデリアンランダム化分析; https://www.r-project.org
SILVA 138データベース	SILVAリボソームRNAデータベースプロジェクト	リリース138	分類学的アノテーションの参照データベース; https://www.arb-silva.de
糞便収集チューブ	サルステッド	76.9923.001	滅菌済糞便標本収集チューブ
糞便DNAキット	オメガ	D4015-02	DNA抽出キット
TwoSampleMRパッケージ	MR-Base	バージョン0.5.7	Rにおけるメンデリアンランダム化分析; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR