$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
本研究は華中科技大学同吉医科大学麗源病院倫理委員会により承認されました[承認番号:2026IEC(RYJ016)]。すべての患者はインフォームド・コンセントを提供し、臨床サンプルの採取と使用はヘルシンキ宣言の関連する倫理ガイドラインに準拠していました。本研究で使用された主な実験材料および機器は材料表に記載されています。
臨床組織サンプルの採取とCDCP1発現の検出
2019年1月から2019年12月にかけて、当院で鼻咽頭癌と診断された7名の患者から外科用組織標本を採取しました。同時に、鼻炎患者6名の鼻組織サンプルを対照群として採取しました。すべての組織サンプルは、収集後すぐに液体窒素で凍結され、その後のRNA抽出が行われました。
RNA抽出とリアルタイム定量PCR検出
製造元の指示に従い、組織サンプルから総RNAを抽出しました。各サンプルに対して、50〜100 mgの組織を1 mLの抽出試薬に溶け込み、組織均質剤を用いて氷上で処理しました。均質化は30秒間行われ、組織の完全な破壊を確実にするために3回繰り返されました。組織破壊後、各溶解液には200μLのクロロホルムが投与されました。管は15秒間激しく渦を振られ、室温で3分間保持され、その後12,000 ×g で4°Cで15分間回転させて相を分離しました。透明な水層は間相を乱さずに除去され、新しいチューブに移されました。
この水溶液からは、1:1の体積比でイソプロパノールを加えることでRNAを回収しました。室温で10分間の培養後、サンプルは12,000× g で4°Cで10分間遠心分離され、RNAをペレット化しました。上澄液は廃棄され、ペレットは75%エタノール1mLで一度洗浄されました。7,500 × g で4°Cで5分間遠心分離を行った後、エタノール洗浄液が除去されました。その後、RNAペレットは室温で5〜10分間自然乾燥させ、RNaseフリー水20μLに再懸浮させました。RNAの量と純度は分光光度測定法で決定されました。
cDNA製剤には、逆転写のために総RNA1μgが使用されました。反応は37°Cで15分間行われ、その後85°Cまで5秒加熱されました。その後、定量的リアルタイムPCR(qPCR)をリアルタイムPCRシステム上でTB Greenプレミックス(Ex Taq II)で実施しました。各20 μL反応には2 μLのcDNAテンプレート、0.4 μmol/Lの順位および逆プライマー、10 μLのSYBR Greenプレミックス、ヌクレアーゼフリー水が含まれていました。増幅プロトコルは95°Cでの変性から30秒間始まりました。その後、40サイクルが続き、各サイクルは5秒間95°C、アニーリング・延長時は60°Cで30秒分のサイクルで構成されていました。プライマー配列は 表1に記載されています。
CDCP1タンパク質発現の免疫組織化学的検出
組織標本はまず4%パラホルマルデヒドに24時間固定され、その後標準的な脱水、パラフィン埋め込み、厚さ4μmの切片の準備が行われました。パラフィン切片はキシレンで処理されパラフィンを除去し、段階化されたエタノール溶液で順次再水和されました。抗原のアンマスキングのために、スライドはクエン酸バッファー(pH 6.0)に入れられ、溶液が沸騰した後3分間圧力鍋で加熱されました。内因性過酸化物酵素活性は、切片を3%過酸化水素に10分間曝露することで抑制されました。
内因性酵素活性を遮断した後、切片は4°Cで一晩インキュベートされ、抗CDCP1一次抗体は1:200で希釈されました。翌日、スライドは室温でホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合の二次抗体を30分間処理しました。信号可視化はDAB基質キットを用いて行われ、その後ヘマトキシリンでカウンターステインされた。最後にスライドは脱水され、マウントされ、光学顕微鏡で検査されました。
細胞培養とグルーピング
CNE2およびHK1ヒト鼻咽頭がん細胞は、10%胎児用牛血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補足した高グルコースDMEMで維持されました。細胞は5%のCO₂を含むインキュベーターで37°Cで培養されました。細胞が70%–80%のコンフルエンスに達したとき、以下のグループに従ってトランスフェクションされました:対照群(対照群):空ベクターまたは陰性対照siRNAでトランスフェクト;CDCP1過剰発現群(CDCP1-OE): CDCP1 過剰発現プラスミドでトランスフェクト;CDCP1サイレンシンググループ(si-CDCP1): CDCP1 siRNAでトランスフェクト;救助実験群(CDCP1-OE + U0126): CDCP1 の過剰発現に基づき、ERK1/2特異的阻害剤U0126(10 μmol/L)で48時間処理。
トランスフェクションは製造元の指示に従って行われました。細胞はトランスフェクションの24時間前に6ウェルプレートで2個の5個セル ×1ウェルあたり2mLの抗生物質フリー培地を装填しました。トランスフェクションは、培養が約70%の合流点に達した時点で開始されました。その後、培養培地を取り除き、新しい血清フリー培地に交換しました。各ウェルごとに、5μLのトランスフェクション試薬と別に2μgのプラスミドDNAまたは100pmolのsiRNAを準備し、各成分は還元された血清含有培地250μLで希釈されました。両方の混合物は室温で5分間保管しました。希釈した核酸とトランスフェクション試薬を結合し、室温で20分間放置してトランスフェクション複合体を生成しました。これらの複合体はセルに滴下されて追加され、ウェル全体に優しく分布し、6時間セルと共に培養されました。潜伏期間が終わると、トランスフェクション混合物を除去し、細胞に10%FBSを含む完全な培地を供給しました。
細胞増殖アッセイ
トランスフェクション後48時間で、各グループからCNE2およびHK1細胞を採取し、3個×10個3 セル/ウェルの密度で96ウェルプレートにシードし、1ウェルあたり100μLの培地を1ウェルに充填し、各グループに5回の複製ウェルを設けました。細胞を24時間、48時間、または72時間培養した後、各ウェルに5 mg/mLのMTT溶液10 μLを加えました。その後、プレートは再び37°Cで5%のCO₂を含んでさらに4時間培養されました。この培養後、培養上清液は慎重に廃棄され、各ウェルに100μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えてホルマザン結晶を溶解させました。プレートは完全に溶けるように10分間攪拌されました。吸収はマイクロプレートリーダーで570 nmで記録され、基準波長は630 nmを用いました。
アポトーシス活性アッセイ
トランスフェクションから48時間後に各群からCNE2細胞を採取し、製造元の指示に従いカスパーゼ3活性アッセイキットを用いてカスパーゼ3活性を検出しました。合計100μLの溶解バッファーを1×10個の6 細胞に加え、氷上で15分間溶解し、その後12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離しました。 得られた上澄液は後続分析のために移送されました。カスパーゼ3アッセイでは、各ウェルに50μLの反応バッファーと5μLのカスパーゼ3基質(DEVD-pNA)が投与されました。プレートは37°Cで2時間維持され、マイクロプレートリーダーで405nmの吸収が測定されました。
ウェスタンブロット解析
トランスフェクションから48時間後、各実験群からCNE2およびHK1細胞を採取し、タンパク質抽出を行いました。細胞はプロテアーゼ阻害剤を含むRIPAバッファーで破壊され、30分間氷床に保管されました。得られた溶液は12,000 × gで4°Cで15分間遠心分離し、その後上清液の分画を採取しました。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキットで測定されました。
ウェスタンブロット分析では、各サンプルから総タンパク質30μgを5倍ローディングバッファーと混合し、100°Cで10分間加熱してタンパク質を変性させました。サンプルは10% SDS-PAGEゲルで120Vで90分間分離され、その後PVDF膜に300 mAの定流で90分間移送されました。移植後、室温で5%無脂肪ミルクで1時間膜を塞ぎました。
膜はCDCP1(1:1,000)、E-カデリン(1:1,000)、ビメンチン(1:1,000)、p-ERK1/2(1:2,000)、ERK1/2(1:1,000)、GAPDH(1:5,000)に対する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートされました。
翌日、膜はTBSTで3回洗い、各洗浄は10分間続きました。その後、室温で1時間、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体に曝露されました。さらに3回のTBST洗浄後、ECL化学発光基質を用いてタンパク質信号を可視化しました。バンド強度はImageJソフトウェアで測定され、正規化制御としてGAPDHが使用されました。
統計解析
すべての実験は独立して3回実施されました。結果は標準偏差(SD)±平均値として提示されます。複数グループ間の差異は一方向分散解析(ANOVA)で評価され、ペアワイズの事後比較にはトゥーキーの手法が用いられました。P値は統計的に有意とされ<0.05でした。