トランスクリプトミクス解析により、アトピー性皮膚炎病変におけるミトコンドリア駆動のサブグループが明らかになる

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

トランスクリプトミクス解析により、アトピー性皮膚炎病変におけるミトコンドリア駆動のサブグループが明らかになる

DOI:

10.3791/70240

⸱

May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アトピー性皮膚炎(AD)は、分子の多様性が顕著な慢性炎症性皮膚疾患です。本研究は、ミトコンドリア遺伝子発現と免疫浸潤の差異によって駆動される2つのトランスクリプト的に異なるADサブグループを特定し、患者の層分けのバイオマーカーとなる可能性のある4つのハブ遺伝子を明らかにします。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アトピー性皮膚炎(AD)は、世界的に有病している一般的かつ慢性的な炎症性皮膚疾患です。その臨床的多様性と複雑な分子メカニズムは、効果的な治療法の開発に大きな課題をもたらします。病変皮膚トランスクリプトミックデータを用いてADの分子異質性を探り、その生物学的および免疫プロファイルを特徴づけ、分化の基盤となる主要な遺伝子を特定すること。DESeq2を用いて差異発現遺伝子を特定し、その後、経路解析およびWGCNA による 共発現解析が行われました。ミトコンドリア関連遺伝子は、DEGsおよびWGCNAモジュールをMitoCarta3.0データベースと交差させることで抽出され、その機能的関連性をGOおよびKEGG濃縮によって評価しました。ハブ遺伝子はタンパク質間相互作用ネットワーク解析によって同定され、その後分類モデルの構築に用いられました。転写調節因子はhTFtargetを用いて予測され、免疫細胞浸透はCIBERSORTを用いて定量化されました。2つの分子サブグループが同定されました。クラスター1は細胞シグナル伝達と接着経路に富んでおり、クラスター2は酸化リン酸化およびプロテアソーム関連プロセスのアップレギュレーションを示しました。エネルギー代謝に主に関与する85のミトコンドリア関連遺伝子がクラスター間で差異的に発現しました。PPIネットワーク解析により、クラスター1で有意なアップレギュレーションが見られた4つのハブ遺伝子(BAD、 BOLA1、 CHCHD5、 ISOC2)が特定されました。ハブ遺伝子ベースの分類器は強力な識別力(曲線下面積>0.7)を示しました。予測された主要な転写調節因子には ATF3、 BRD2、 BRD4、 CEBPAが含まれていました。免疫プロファイリングにより、クラスター1では調節T細胞の浸潤が増加し、クラスター2では濾胞補助T細胞が増加することが明らかになりました。本研究は、分子的および免疫学的に異なる2つのアルトハトム病のサブタイプを明らかにし、ミトコンドリア機能と免疫微小環境の特徴の違いを特徴とします。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アトピー性皮膚炎(AD)は、子どもの最大20%、成人の10%に影響を及ぼす一般的かつ慢性的な炎症性皮膚疾患^です。激しいかゆみと再発性湿疹性病変が特徴です^。臨床的には、ADは多遺伝子感受性(例:FLG機能喪失変異)、免疫調節障害、低湿度や微生物の不全といった環境曝露の動的な相互作用から生じ^ます。ADは乾癬といくつかの病態生理的特徴を共有しますが、臨床的症状は相反しており、共通経路における遺伝的影響や免疫変異が異なります。

ADは異質な疾患であり、異なる患者群や疾患症状に異なるトランスクリプトームプロファイルが特徴です⁵。皮膚組織および末梢血単核細胞の統合解析により、紅斑や丘床化などの臨床的特徴が異なる免疫学的特徴と関連しており、局所的な皮膚と全身免疫応答の相互作用を反映していることが示^{されました。}大規模なトランスクリプトム研究はさらに、IL-13経路がADの病因に果たす役割を強調しており、ADは乾癬よりも分子異質性が高く、疾患の重症度、発症年齢、遺伝的背景に関連する遺伝子発現パターンの変動を示しています^5,7。これらの違いは、ADの病因の複雑さと、研究や治療における個別化アプローチの必要性を強調しています。

ミトコンドリアタンパク質は、酸化ストレスや代謝経路の調節不全を通じて、ADの病因に重要な役割を果たします。研究では、非病変性ADケラチノサイトにおけるミトコンドリア複合体IおよびIIの活性が増加し、長鎖脂肪酸の過剰酸化とROS産生の増加を引き起こし、表皮バリア機能障害を増加させることが明らかになりました^8,9。同時に、プロテオーム解析により、アルトハム表皮におけるNRF2抗酸化経路タンパク質およびミトコンドリア成分が同定され、酸化ストレス分解能が低下します¹⁰。ミトコンドリアDNA損傷はさらに炎症反応に寄与し、ミトコンドリア標的抗酸化物質の使用などの介入はROS^11,12を緩和することで表皮恒常性の回復に効果を示しています。これらの発見は、ミトコンドリアタンパク質がADの病理の要因であると同時に治療対象となる可能性を強調しています。

最近のADのトランスクリプトーム解析は、その遺伝的構造や分子異質性の理解を大きく進展させました。ADの最初のRNAシーケンシングプロファイリングでは、TREM-1経路およびIL-36サイトカイン¹³の発現増加が明らかになりました。遺伝子発現プロファイルに基づく加重遺伝子共発現ネットワーク解析により、HSPA4、LCE3E、LCE3Dなどの異なる分子モジュールやハブ遺伝子が炎症反応と角化を指揮し、潜在的な治療標的が浮き彫りになりました¹⁴。これらの研究は、多組織トランスクリプトミクスと多遺伝子リスクモデリングが疾患予測の精度を高め、ADの複雑な基盤を明らかにする上で重要であることを強調しています。しかし、既存の研究は主にアルツ病全体のトランスクリプトミクスに焦点を当てており、分子サブグループにおけるミトコンドリア遺伝子の役割を明確に解明していません。本研究は、複数のGEOデータセットを統合してコンセンサスクラスタリングに基づくADサブグループを特定し、差異発現遺伝子、WGCNAモジュール、厳選されたミトコンドリア遺伝子カタログを体系的に交差させ、サブグループの同一性を定義し、新たなバイオマーカーとして機能する可能性のあるハブミトコンドリア遺伝子を特定することで、従来のトランスクリプトミクス解析を超えて前進しています。

病変性AD皮膚は、ミトコンドリア遺伝子発現の違いを特徴とする分子的に異なるトランスクリプトムサブグループを有し、これがADの臨床的異質性を支える可能性があるという仮説です。これを検証するために、本研究では発表された研究のRNAシーケンシングデータを統合し、266名のAD患者の病変皮膚サンプルの遺伝子発現データを収集しました。遺伝子発現のコンセンサスクラスタリングに基づいて分子サブグループを特定し、2つの分子サブグループ間の遺伝子発現を比較しました。この違いを駆動する遺伝子は、細胞シグナル伝達と酸化的リン酸化における機能的豊化を示します。さらに、2つの分子群を区別するミトコンドリア遺伝子を調べ、タンパク質間相互作用ネットワーク内で重要なハブ遺伝子が同定されました。これらの発見は、AD病の遺伝的多様性を浮き彫りにし、AD病理におけるミトコンドリアタンパク質の役割の知見を広げます。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、Gene Expression Omnibus(GEO)データベースから公開されている遺伝子発現データセットを使用しました。患者を特定できるデータはアクセスされず、新たな患者サンプルも採取されませんでした。したがって、この公開データの二次分析には機関審査委員会(IRB)の承認や患者の同意は必要ありませんでした。使用されているソフトウェアおよびデータベースは 材料表に記載されています。

1 データとリソース

アトピー性皮膚炎(AD)患者のトランスクリプトームデータはGEOデータベースから取得され、4つの研究が含まれます:GSE121212 (N = 55)⁵、GSE157194 (N = 57)¹⁵、GSE193309 (N = 111)¹⁶ 、およびGSE277961 (N = 43)¹⁷。すべてのデータセットは病変皮膚生検からの生計数または事前正規化カウントデータを含んでいました。生カウント行列をダウンロードし、研究間で統合しました。クロススタディのバッチ効果はComBat-seq法(sva Rパッケージ、v3.44.0)を用いて補正し、4つのGEOデータセット間の発現プロファイルを調和させ、その後解析に進みました。これら4つのデータセットはすべて、ヒト皮膚生検標本に対して行われたRNA-seqに基づいており、研究特有のパイプラインを用いてヒトリファレンスゲノムGRCh38にアラインメントされています。遺伝子レベルの発現定量はEnsembl遺伝子注釈(v105)を用いて行われました。

2 コンセンサスクラスタリング

ConsensusClusterPlus Rパッケージ(v1.64.0)¹⁸ を用いて、AD患者の病変皮膚サンプル266件をトランスクリプトミックプロファイルに基づき層別化する無監督コンセンサスクラスタリングを実施しました。クラスタリング前に、すべての研究の生カウントデータを統合し、limmaパッケージのremoveBatchEffect関数を使ってクロススタディのバッチ効果を補正しました。その後、DESeq2を用いて分散安定化変換(VST)を行い、最も変動の大きい上位5,000遺伝子を保持するようにフィルタリングしました。クラスタリングは、ピアソン相関と平均リンクを用いた階層クラスタリングを用いて1,000回の反復にわたり実施され、1回の反復あたりサンプルの80%をサブサンプリングしました。最良のクラスター数(kの範囲は2から10)は、コンセンサス累積分布関数(CDF)、デルタ面積プロット、クラスタ・コンセンサススコアの評価によって決定されました。得られたクラスターはコンセンサスヒートマップとPCAを用いて検証され、下流の生物学的および臨床的解析に用いられました。

3 差異遺伝子発現解析

遺伝子発現レベルはDESeq2 Rパッケージ(v1.46.0)を用いて分子サブグループ間で比較されました¹⁹。生計数データを入力して遺伝子ごとの分散を推定し、負の二項モデルに適合させました。差分発現遺伝子(DEGs)はWald検定を用いて同定され、結果は 調整p値<0.01、絶対log2倍変化>1の有意閾値を用いてフィルタリングしました。

4 遺伝子セット豊か解析

遺伝子セットリッチメント解析(GSEA)はclusterProfiler Rパッケージ(v4.12.6^)を用いて実施されました。すべての遺伝子は差分発現解析からのlog2フォールド変化でランク付けされ、GSEA関数はパラメータeps = 0、minGSSize = 10、maxGSSize = 500で適用され、その他の設定はデフォルトに維持されました。MSigDBのHallmark遺伝子セットに対して濃縮が行われました。各分子クラスター(クラスター1およびクラスター2)ごとに、名目p値と正規化濃縮スコア(NES)に基づいて上位3つの濃縮経路が選ばれました。結果はGseaVis Rパッケージ(v0.1.0)²¹を用いて可視化されました。

5 加重遺伝子共発現ネットワーク解析

WGCNAは、RパッケージWGCNA (v1.73)²²を用いてトランスクリプトムサブタイプ同一性に関連する遺伝子共発現モジュールを特定するために、AD患者の遺伝子発現プロファイルを対象に実施されました。遺伝子は全サンプルで最も分散の大きい上位75%を保持するようにフィルタリングされました。符号付き共発現ネットワークは、スケールフリートポロジーを近似するために1から30までのソフトしきい値付けパワーを用いて構築されました。遺伝子モジュールは階層的クラスタリングと動的木切断によって同定されました。モジュール-形質の関連は、共発現モジュール固有遺伝子と分子サブタイプラベルの相関を研究し、分子サブタイプと有意な相関(p < 0.05)を示すモジュールを選定して後続解析を行いました。

6 AD分子サブグループにおけるミトコンドリアタンパク質

DEGsおよびWGCNAモジュール内のミトコンドリア関連遺伝子を特定するため、これらの遺伝子セットはMitoCarta3.0²³の厳選されたミトコンドリアタンパク質リストと重なり合いました。交差する遺伝子は、AD疾患の文脈に関連する推定ミトコンドリアタンパク質とみなされました。

7 遺伝子オントロジーとKEGG濃縮解析

分子サブグループを分化させる主要な細胞機能と生物学的プロセスを特定すること。clusterProfilerを用いてミトコンドリア関連遺伝子のGOおよびKEGG濃縮解析を実施しました。GO濃縮は、生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)カテゴリごとに、OrgDb = "org."のenrichGO関数を用いて別々に実施されました。Hs.eg.db"、ont = "ALL"、そしてデフォルトのパラメータ。KEGG経路の濃縮は、生物を「has」に設定したenrichKEGG関数を用いて実施されました。調整後 p値<0.05の豊か項が有意とみなされました。

8 タンパク質間相互作用ネットワーク

85のDEGおよびAD関連モジュールの重なりミトコンドリア遺伝子をSTRINGデータベース(https://string-db.org)²⁴ で検索し、既知および予測されたPPIを取得しました。ネットワークトポロジー解析は、各タンパク質のノード重要度をランク付けするために、7つの指標(Degree、Closeness、Betweenness、Eigenvector、PageRank、Hub、Authorities)を用いて実施されました。各測定値の上位30位の遺伝子を選び、7つのアプローチすべての交差点をUpSetプロットで可視化しました。測定から交差する4つの遺伝子を用いて、その遺伝子発現レベルに基づく分類モデルを構築しました。分類性能を評価するために、モデルの精度、感度、特異度、ROC曲線下面積(AUC)を計算しました。

9 転写制御解析

hTFtargetデータベース(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ は、4つの交差するハブ遺伝子の実験的に支持されたTFターゲット相互作用を取得するために調査されました。その結果、igraph²⁶ およびggraph²⁷ Rパッケージを用いてTF遺伝子調節ネットワークを構築し、可視化しました。

10 バルクRNA-seq免疫細胞浸潤解析

CIBERSORT²⁸ アルゴリズム(https://cibersort.stanford.edu/)は、病変皮膚トランスクリプトームデータにおける22種類の免疫細胞の相対的な割合を推定するために用いられました。正規化された遺伝子発現データは、LM22シグネチャマトリックスとともにCIBERSORT(v0.1.0)に入力されました。分析は1,000の置換を行い、分位数正規化を無効にして実施されました。 CIBERSORTのp値出力が0.05<サンプルを下流解析に検討しました。推定された免疫細胞割画は、22種類の免疫細胞タイプ間で複数比較したFDR補正を用いたWilcoxonランク-和検定を用いて分子サブグループ間で比較され(p.adjust.method = 「FDR」)、ggplot2²⁹ Rパッケージを用いたボックスプロットで結果を可視化しました。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アトピー性皮膚炎における転写サブグループ

266名のAD患者サンプルからRNA-seqデータを解析し、疾患内の転写異質性を調査しました。複数の研究における品質管理とバッチ効果の補正を経て、監督なしの合意集分けにより2つの明確な分子サブグループが明らかになりました(図1A)。クラスタの安定性と最適クラスタ数は、累積分布関数(CDF)プロット(図1B)、デルタ面積プロット(図1C)、およびコンセンサスマトリックスヒートマップ(図1D)を用いて評価されました。これらの結果は、ADにおける2つの堅牢な転写サブタイプの存在を支持しており、遺伝的多様性を反映しています。

ADサブグループ間の差異発現遺伝子

正規化遺伝子発現マトリックスに基づくt-SNEプロットは、コンセンサスクラスタリングによって特定された転写サブグループをさらに検証しました。t-SNEプロットは、以前に定義されたサブグループのいずれかに対応する2つのよく分離されたクラスター(図2A)を示し、AD患者間で異なる分子プロファイルの存在を支持しました。次に、2つのサブグループ間の差異発現をDESeq2を用いて解析し、調整p < 0.01および|log₂フォールド変化の閾値を用いて分析しました。> 1.その結果得られた火山プロット(図2B)は、遺伝子の差異発現(DEGs)を示し、強い転写分岐を示しました。上位10のアップレギュレーション遺伝子はクラスター1に ABHD2、ADAR、ADCY3、ADCY9、ADD1、ADIPOR2、AFF1、AGFG1、AGRN 、 AHNAK で、クラスター2には C2orf68、CTTN、GPR108、HERPUD1、LRPAP1、MAP1LC3B2、NKIRAS2、NR1H2、PDE5D 、 PMPCA があります(図2C)。

ADサブグループに関連する遺伝子セット

遺伝子セット豊か解析(GSEA)により、2つのトランスクリプトムクラスター間で異なる機能豊化プロファイルが明らかになりました(図3A)。クラスター1は、細胞シグナル伝達および接着に関与する経路、例えば局所接着(図3B)やMAPKシグナル伝達経路(図3C)に有意な濃縮を示し、細胞間細胞外マトリックスの相互作用と増殖を特徴とする活性状態を示唆しています。対照的に、クラスター2は酸化リン酸化(図3D)およびプロテアソーム機能(図3E)に強い濃縮を示し、活性化された酸化的かつプロテオリタン的な代謝表現型を示唆しました。

AD分子群における共発現遺伝子

トランスクリプトミックサブタイプに関連する共発現モジュールを特定するために、データ前処理後にWGCNAが実施されました。外れ値サンプルはまず特定され、下流ネットワーク構築の堅牢性を確保するために、サンプル距離の階層的クラスタリングに基づいて除去されました(図4A)。次に、スケールフリー位相の基準を用いてソフトしきい値付けのパワーを選び、6のべき乗を選んでスケールフリーのR² >0.85を達成しました(図4B)。遺伝子モジュールは階層的クラスタリングと動的木切断を通じて同定され、その後、密接に関連するモジュールを統合するための固有遺伝子クラスタリングが行われました(図4C および 図4D)。得られた遺伝子ネットワークはトポロジカル重なりのヒートマップを用いて可視化され、異なる遺伝子共発現パターンの存在が確認されました(図4E)。モジュール-形質関係解析により、MEyellowモジュール(N_遺伝子=743)と分子サブグループの間に強く有意な相関関係があることが明らかになりました(図4F)。

ADサブグループに関連するミトコンドリア遺伝子の機能的豊化

その後、DEG間の交差遺伝子(N=85)、MEyellowモジュールの遺伝子、MitoCarta3.0のミトコンドリアタンパク質リスト(図5A)に対してGOおよびKEGG濃縮解析を行い、クラスター間の転写差異を駆動するミトコンドリア関連遺伝子の機能的役割を調査しました。KEGG経路解析により、酸化的リン酸化および代謝経路の濃縮が確認されました(図5B)。GO濃縮解析では、陽子動力力駆動のミトコンドリアATP合成、呼吸鎖複合体、NADH脱水素酵素活性など、ミトコンドリア機能に関連する用語の著しい過剰代表が明らかになりました(図5C)。これにより、これらの遺伝子は主にミトコンドリアのエネルギー代謝およびエネルギー調節に関連していることが示唆されています。

AD分子分化におけるハブミトコンドリア遺伝子

85のミトコンドリア転写体サブグループ関連遺伝子の主要遺伝子を特定するために、PPIネットワークを構築しました(図6A)。7つの位相的指標それぞれの順位(方法参照)に基づき、上位30の遺伝子が選ばれ、それらの交差点を解析・UpSetプロットで可視化しました(図6B)。この解析により、すべてのランキング基準(BAD、 BOLA1、 CHCHD5、 ISOC2)に基づき、4つのハブ遺伝子が一貫して中心ノードとして特定されました。2つのトランスクリプトムクラスターで発現プロファイルを調べたところ、クラスター1では4つのハブ遺伝子すべてがクラスター2に比べて有意にアップレギュレーションされていることがわかりました(図6C)。ペアワイズ遺伝子発現相関解析では、4つの遺伝子すべてで正の相関が示され、協調した調節を示し、 CHCHD5 と ISOC2 が最も強い相関を示しました(図6D)。さらに、これら4つの遺伝子の発現を用いて構築した分類モデルでは、両クラスター間で強固な識別力が示され、ROC曲線は曲線下面積(AUC)>0.7を示しました(図6E)。さらに、転写因子(TF)調節ネットワーク解析も行われ、4つの特定されたハブ遺伝子の発現を制御する調節機構を研究しました。これらのハブ遺伝子を調節する可能性のある既知および予測されるすべての転写因子をhTFtargetから照会し、その結果を転写調節ネットワークとして統合・可視化しました(図7)。TFハブ遺伝子調節ネットワークにおいて、 BAD は最も多くのTFを持ち、 ATF3、 BRD2、 BRD4、 CEBPA はそれぞれ4つのハブ遺伝子すべてと相互作用しており、共通の調節機構を示唆しています。

ADサブグループ間の免疫細胞浸潤の比較

トランスクリプトームサブグループに関連する免疫学的状況を調査するため、CIBERSORTを用いた免疫細胞浸透解析が行われ、バルクトランスクリプトームデータに基づき22種類の免疫細胞の相対的な割合を推定しました(図8)。免疫サブセットの中で、調節性T細胞(Tregs)はクラスター1で有意に多く存在していることが判明し、ミトコンドリア活動やシグナル伝達経路のアップレギュレーションに関連する免疫抑制的な微小環境の可能性を示唆しています。対照的に、濾胞補助T細胞はクラスター2で有意に濃縮されており、このサブグループではより活発な適応免疫応答が見られる可能性があります。

データの利用可能性:

本研究で解析されたトランスクリプトミクスデータは、Gene Expression Omnibus(GEO)リポジトリで、登録番号GSE121212、GSE157194、GSE193309、GSE277961(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)で公開されています。

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図1:トランスクリプトミックプロファイルに基づくアトピー性皮膚炎病変サンプルのコンセンサスクラスタリング。 (A) アトピー皮膚炎(AD)サンプルを対象としたコンセンサスマトリックスのヒートマップおよび階層的クラスタリング。(B) 最適クラスタ数を決定するために用いられる合意累積分布関数(CDF)プロット(k = 2–10)。(C) 各kに対するCDF曲線下面積の相対変化を示すデルタ面積プロット。(D) k = 2に対するコンセンサスクラスタ割り当て。各列は個別のサンプルを表し、色はクラスターのメンバーシップを示します(クラスター1、赤;クラスター2、青緑色)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:アトピー性皮膚炎分子サブタイプの遺伝子発現の違い。 (A) AD サンプルの t 分散確率近傍埋め込み(t-SNE)プロット。各点は二次元に投影されたサンプルを表し、クラスタの割り当てに応じて色付けされます。(B) クラスター1とクラスター2間の差異発現遺伝子(DEGs)の火山プロット。各点は遺伝子を表し、log2の重変化(x軸)と−log10の調整p値(y軸)でプロットされます。赤い点と青点はそれぞれクラスター1とクラスター2で有意に上向き調節されている遺伝子を示し、グレー点は有意でない遺伝子を示します。(C) クラスター1およびクラスター2の上位10の高発現遺伝子のヒートマップ。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:アトピー性皮膚炎分子サブタイプの遺伝子セット豊富解析。 (A) クラスター1とクラスター2間のGSEA結果を示す両面棒グラフで、上部の経路が有意に濃縮されています。クラスター1で濃縮された経路は右側に、クラスター2で濃縮された経路は左側に示されています。(B–E)局所癒着、MAPKシグナル伝達経路、酸化リン酸化、プロテアソーム経路の代表的な濃縮プロット。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4:アトピー性皮膚炎サンプルの加重遺伝子共発現ネットワーク解析。 (A) 遺伝子発現プロファイルに基づくサンプルクラスタリング樹状図。(B) スケールフリートポロジー適合指数およびソフト閾値付け乗(1–30)における平均連結性。(C) モジュール固有遺伝子のクラスタリングとヒートマップ、色はペア間の相関を示す。(D) 遺伝子を共発現モジュールにまとめた階層的クラスタリングの樹木図。(E) 遺伝子ペア間の共発現類似性を表すトポロジカルオーバーラップ行列(TOM)のヒートマップ。(F) モジュールと形質関係のヒートマップ。モジュール固有遺伝子と臨床形質の相関を示す。相関係数は各セル内に表示され、色の強さは相関の強さと方向を示します(赤は正、青は負)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図5:サブタイプ関連ミトコンドリア遺伝子の遺伝子オントロジーおよびKEGG経路の濃縮。 (A) DEGs、サブタイプ関連モジュール遺伝子、ミトコンドリア遺伝子間の重複を示すベン図。(B) 交差遺伝子の上位20の濃縮KEGG経路のバブルプロット。(C) 生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)に関する上位10の強化遺伝子オントロジー(GO)用語。すべての濃縮解析は、有意性閾値として0.05(偽発見率)<調整済みp値を用いて実施されました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図6:タンパク質間相互作用解析およびハブ遺伝子の同定。 (A) 85の交差遺伝子によるタンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク。ノードはタンパク質を表し、辺はSTRINGデータベースからの予測または実験的に検証された相互作用を示します。(B) 7つのネットワーク中心性指標に基づく上位30遺伝子間の交差を示すUpSetプロット。(C) クラスター1およびクラスター2における4つのハブ遺伝子の発現レベルを示すボックスプロット。(D) 4つのハブ遺伝子間のペアワイズ相関解析。(E) 分類性能を示す受信者動作特性(ROC)曲線(特異性に対する感度プロット)。曲線下面積(AUC)は全体の精度を示します。パネル(C)における統計的有意性はウィルコクソンランク-総和検定(*p < 0.05)を用いて評価されました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図7:ハブ遺伝子の調節ネットワーク。赤い丸はハブ遺伝子、青い丸は関連する転写因子(TF)を表します。エッジは調節相互作用を示します。各ハブ遺伝子ノードのサイズは相互作用するTFの数を反映しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

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図8:アトピー性皮膚炎サブグループ間の免疫細胞浸潤の比較。各クラスターにおける推定22種類の免疫細胞の割合を示すボックスプロット(クラスター1、赤;クラスター2、青緑色)。アスタリスク(*)は、複数比較に対して偽発見率補正を用いたウィルコクソンランク-総和検定で評価されたクラスター間の統計的に有意な差を示します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アトピー性皮膚炎は、広く存在し遺伝的に多様な炎症性皮膚疾患であり、個別化治療戦略に大きな課題をもたらします。本研究は、266件の病変皮膚サンプルから2つの異なる転写サブグループを特定することで、ADの分子的異質性についての洞察を提供します。これらのサブグループは生物学的機能の豊かさと免疫細胞浸潤の面で異なる特徴を持ち、クラスター1は活発な細胞シグナル伝達と接着経路、調節T細胞(Tレッグ)の濃縮を特徴とし、クラスター2は酸化的リン酸化とプロテアソーム機能の増加、さらに濾胞補助T細胞の増加によって特徴づけられます。重要なのは、クラスター1で上行調節されている4つのミトコンドリア関連遺伝子(BAD、BOLA1、CHCHD5、 ISOC2)が特定されたことです。 これらは2つのトランスクリプトムサブタイプを定義する85遺伝子からなるPPIネットワークのハブ遺伝子であり、 ATF3、 BRD2、 BRD4、 CEBPAなどの転写因子によって同時に調節されます。

この2つの異なるクラスターは遺伝子発現パターンに基づいて特定されており、ADは有意な遺伝子発現の異質性を示すことが示唆されています。これまでの研究では、この異質性は遺伝的、エピジェネティック的、免疫媒介のメカニズムによって異なる分子^{エンドタイプ}^5,30,31を定義することが示されています。両クラスター間では異なる免疫細胞浸潤も観察されており、クラスター1は調節T細胞、クラスター2は濾胞ヘルパーT(Tfh)細胞で豊富であり、ADコホートにおける免疫学的異質性と疾患メカニズムの違いを示唆しています。Treg優勢のクラスターは、調節機構が顕著な免疫環境を示唆しており、炎症の制御や慢性免疫活性化に対する補償的応答を反映している可能性があります(^32,33)。しかし、ADではTregの機能が増加しても機能が損なわれることがあり、炎症を効果的に抑制できないことがあります。対照的に、Tfh濃縮クラスターはB細胞の活性強化、生殖中心活動の増加、そしておそらくIgE産生の増加を示しており、これらはアレルギー反応やより重篤または外因性の^AD34,35の特徴です。Tfh細胞はB細胞の分化と抗体クラスの切り替えを支持することが知られており、その増殖は疾患活動やアレルギー感作と相関しています³⁶。これらの異なるクラスターの存在は、異なる臨床表現型、疾患の重症度、治療への反応を反映している可能性があり、ADの研究と治療における個別化アプローチの重要性を浮き彫りにしています。

ミトコンドリア機能障害は、表皮関門の維持、活性酸素種^の産生、免疫細胞応答の調節などのメカニズムを通じて、ADの病因に重要な役割を果たすことが知られています。³⁹。4つのミトコンドリアタンパク質がトランスクリプト体分化に関連する遺伝子の中心節として同定され、分子サブタイプを高精度で予測できます(AUC>0.7)。これらの遺伝子がADと直接的な関連を示す研究はありませんが、これらの結果はAD患者の層別化やミトコンドリア機能障害の評価に役立つバイオマーカーの可能性を示唆しています。BAD(BCL2関連作動薬オブ細胞死)は、ミトコンドリアのアポトーシスシグナル伝達に関与するBCL-2ファミリーのプロアポトーシスメンバーです。クラスター1での上位調節は、このサブタイプにおけるミトコンドリアのアポトーシスプライミングの強化を反映している可能性があります。BOLA1は、鉄-硫黄クラスターの生合成および酸化ストレス調節に関与するミトコンドリアタンパク質です。CHCHD5(コイルドコイルヘリックスコイルコイルヘリックスドメイン含み5)は、クリステの組織化および電子伝達連鎖効率に関連するミトコンドリア内膜タンパク質です。ISOC2(2を含むアイソコリマターゼドメイン)は代謝過程およびミトコンドリア機能に関連しています。クラスター1におけるこれら4つの遺伝子の協調的なアップレギュレーションは、このADサブグループにおけるミトコンドリア代謝活動およびアポトーシスシグナル伝達の高まり状態を示唆しています。

この研究にはいくつかの制限があります。本研究では、ミトコンドリア遺伝子で異なる遺伝子発現と分離された免疫細胞浸潤を持つ2つの分子サブグループを特定しましたが、病況の重症度や長期的治療反応との層別化を相関させるための詳細な臨床表現型データが不足しています。クラスター1におけるこれら4つのハブ遺伝子の高い発現が何を意味するのかを完全に理解するためには、今後の研究で包括的な臨床メタデータを統合し、理想的にはケラチノサイトやマウスモデルでの機能検証を行うべきです。さらに、本研究は公開されているバルクRNA-seqデータに依存しています。大規模解析には強力ですが、特定の細胞タイプでは解像度が不足しています。この制限により、観察されるミトコンドリア遺伝子の差異発現がケラチノサイト、浸潤免疫細胞、またはその他の皮膚常駐細胞集団に由来するものかを判断することが困難です。単細胞および空間的トランスクリプトミクス手法の広範な利用により、発現シグナルの解コンボリュート化と細胞レベルでのトランスクリプトトムプロファイルのより正確な概要の提供が今後の研究に大きく恩恵をもたらすでしょう。さらに、すべてのデータは全層皮膚を採取したパンチ生検標本から得られました。今後のテープストリップRNA-seqを用いた研究は、表層表皮トランスクリプトームのプロファイリングに補完的かつ非侵襲的アプローチを提供し、低侵襲環境で同定されたサブグループシグネチャーの検証が可能となる可能性があります。将来的に単細胞RNAセクシーク序および空間トランスクリプトミクスデータの統合により、AD皮膚における細胞型特異的ミトコンドリアシグネチャーの解像の解想がさらに進むことになります。

結論として、本研究は266サンプルのADのトランスクリプトム異質性を調べ、主要なミトコンドリア遺伝子と独自の免疫細胞浸潤を特定し、サブグループを区別しました。これらの発見は、ADの分子異質性の理解を深め、特定の分子プロファイルに基づく精密な治療法の開発の可能性を示しています。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは利益相反を一切認めていない。

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
シーバーソート	スタンフォード大学	v0.1.0;免疫細胞の脱畳み込み;https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	バイオコンダクター	v4.12.6;GSEAおよびGO/KEGG濃縮解析;https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
コンセンサスクラスタープラス	バイオコンダクター	v1.64.0;監督なしコンセンサスクラスタリング;https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	バイオコンダクター	v1.46.0;差異遺伝子発現解析、https://bioconductor.org/packages/DESeq2
遺伝子発現オムニバス(GEO)	NCBI	公開トランスクリプトミックデータリポジトリ;データセットGSE121212、GSE157194、GSE193309、GSE277961;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	クラン	データ可視化;https://ggplot2.tidyverse.org
ggraph	クラン	グラフおよびネットワークの可視化;https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVision	GitHub(junjunlab)	v0.1.0;GSEAの可視化、https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	華中科技大学	ヒト転写因子標的データベース;http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraph	クラン	ネットワーク構築と可視化;https://igraph.org
リマ	バイオコンダクター	removeBatchEffect 関数;https://bioconductor.org/packages/limma
ミトカルタ3.0	ブロード研究所	キュレーションされたミトコンドリアタンパク質データベース;https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB(Hallmark遺伝子セット)	ブロード研究所	GSEAの遺伝子セットデータベース;https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
組織。Hs.eg.db	バイオコンダクター	ヒトゲノム注釈データベース;https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	Rコアチーム	統計計算環境;https://www.r-project.org
ストリング	EMBL	v12.0;タンパク質間相互作用データベース;https://string-db.org
sva(ComBat-seq)	バイオコンダクター	v3.44.0;バッチ効果補正;https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	クラン	v1.73;加重遺伝子共発現ネットワーク解析;https://cran.r-project.org/package=WGCNA

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トランスクリプトミクス解析により、アトピー性皮膚炎病変におけるミトコンドリア駆動のサブグループが明らかになる

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