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方法論記事

チモキノンがビスフェノールA誘発性神経毒性、Keap-1/Nrf-2シグナル伝達、酸化ストレスおよびラットにおける行動に与える影響の調査

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DOI：

10.3791/70242

⸱

2026年3月24日

 , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University

この記事について

サマリー

本研究は、ビスフェノールAに曝露されたラットのチモキノンが酸化ストレス、Keap-1/Nrf-2シグナル伝達経路、および血漿、大脳皮質、海馬における行動に与える影響を調査することを目的としました。

要約

環境内分泌撹乱物質であるビスフェノールA(BPA)への慢性的な低用量曝露は、酸化ストレス介在性神経毒性とますます関連しています。チモキノン(TQ)は ニゲラ・サティバの生物活性成分であり、強力な抗酸化特性を示します。しかし、BPA誘発性の毒性に対する神経保護効果については、いまだに完全には解明されていません。BPA曝露の広範な性質を踏まえ、効果的でアクセスしやすい神経保護戦略の特定はますます重要になっています。本研究は、BPA曝露ラットにおけるTQが酸化ストレス、Keap-1/Nrf-2シグナル伝達、行動、組織病理学的変化に与える影響を調査しました。合計24頭の成体オスのウィスター・アルビノラットが4つのグループ(n=6/グループ)に無作為に割り当てられました:対照群、BPA、BPA + 10 mg/kg TQ(BPA+TQ I)、およびBPA + 20 mg/kg TQ(BPA+TQ II)。BPA(50 μg/kg)およびTQは30日間胃内投与されました。BPA曝露は著しい行動障害、酸化ストレス、Keap-1/Nrf-2シグナル伝達の障害、海馬および大脳皮質における顕著な組織病理学的損傷を引き起こしました。TQ治療は運動活動と抑圧様行動を有意に改善し、脂質過酸化および一酸化窒素レベルを低下させ、グルタチオン関連抗酸化能力を回復させ、Keap-1およびNrf-2の発現を正規化しました(p < 0.001)。これらの保護効果は、より高いTQ用量でより顕著に現れました。これらの発見を総合すると、チモキノンは酸化ストレスおよびKeap-1/Nrf-2シグナル伝達経路の調節を通じてBPA誘発性の神経毒性を緩和し、環境に関連したBPA曝露に対する神経保護剤としての可能性が浮き彫りになります。

概要

ビスフェノールA(BPA)は、プラスチックやエポキシ樹脂に広く使用されている合成化合物であり、食品包装材料、水道システム、医療機器、家庭用品で一般的に検出されています。継続的な環境曝露は、特に実際の人間曝露を反映した慢性的な低用量条件下での神経毒性への懸念を生んでいます。

米国食品医薬品局(FDA)や米国環境保護庁などの規制機関は、50 μg/kg/1日を無副作用のレベルと定義していますが、新たな実験的および疫学的証拠は、低用量でも行動や認知の変化が起こることを示しています。その結果、欧州の許容摂取量は1日あたり4μg/kgに減少し、環境に関連するBPA曝露のメカニズム的効果を調査する必要性が強調されています1,2。

酸化ストレスはBPA誘発性神経毒性の中心的なメカニズムと考えられています。BPAはグルタチオン(GSH)などの抗酸化防御を減少させ、マロンジアルデヒド(MDA)を含む脂質過酸化マーカーを増加させることで細胞のレドックスバランスを乱します3,4。しかし、BPA曝露下での抗酸化反応を制御する上流の調節機構はまだ十分に解明されていません。

ケルチ様ECH関連タンパク質1(Keap-1)/核因子赤血症2関連因子2(Nrf-2)経路は、主要な内因性抗酸化防御機構です。酸化ストレス条件下では、Nrf-2はKeap-1から解離し、核に移座して抗酸化反応要素依存性遺伝子発現5を活性化します。細胞防御における確立された役割にもかかわらず、環境に関連するBPA曝露時の脳内のKeap-1/Nrf-2シグナル伝達の領域特異的調節は、行動結果と併用して包括的に調査されていません。

チモキノン(TQ)は、ニゲラ・サティバ種子油の主要なバイオアクティブ成分であり、血脳関門を通過できる脂溶性ベンゾキノンです。TQは抗酸化作用、抗炎症作用、抗アポトーシス特性を示し、これはNrf-2シグナル伝達の活性化と内因性抗酸化能力の強化によって一部に見られます5,6。過去の研究では様々な神経毒性モデルでTQの保護効果が示されていますが、同じBPA曝露パラダイム内で酸化ストレスマーカー、Keap-1/Nrf-2シグナル伝達、行動パラメータを評価する統合的手法アプローチは5,6,7が欠けています。

ここでは、酸化ストレスバイオマーカー、Keap-1/Nrf-2経路発現、環境関連BPA曝露ラットモデルにおける行動変化を評価する再現可能な実験プロトコルを説明し、複数の脳領域におけるチモキノンの神経保護効果を評価する。

低用量BPA曝露は、酸化ストレスを介してKeap-1/Nrf-2シグナル伝達経路の調節障害を引き起こし、チモキノンが酸化還元バランスを回復しNrf-2依存性抗酸化反応を活性化することでこれらの影響を緩和すると仮説を立てました。

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プロトコル

すべての実験手順は、施設動物実験地域倫理委員会(承認番号:68429034/07)によって承認されました。

動物と実験設計
24頭の成体オスのウィスター・アルビノラット(200〜250g)が実験動物研究所から採取され、個別に管理された環境(12時間の明暗サイクル、24 ± 2°C)で、標準的な食事水と水道水を 自由に利用 しました。動物たちは実験室の環境に順応させられ、実験は32日間続きました。

ラットは選択バイアスを最小化するため、コンピュータ生成の単純ランダム化方法を用いて実験群にランダムに割り当てられ、各グループに同数の動物が割り当てられました(n=6/グループ):対照群、BPA、BPA + 10 mg/kgチモキノン(BPA + TQ I)、およびBPA + 20 mg/kgチモキノン(BPA + TQ II)。サンプルサイズはG*Powerソフトウェア(バージョン3.1)を用いた事前検出力解析によって決定されました。BPA誘発性神経毒性および抗酸化介入、特に生化学的および行動的アウトカム測定を評価した過去の研究で報告された効果量に基づき、一方性ANOVAの統計的検出力は0.80と仮定されました。これらの条件下では、実験群間で統計的に有意な差を検出するには、1群あたり最低6頭の動物が必要でした。

BPA(50 μg/kg)およびTQ(10または20 mg/kg)は、ガヴェージによって1日1回、30日間胃内投与されました。すべての治療は新たに準備され、総容量1 mL/kgで投与されました。本研究で使用されたBPA用量(50 μg/kg/日)は、米国環境保護庁(EPA)および米国食品医薬品局(FDA)による「観察された有害副作用なし」レベルおよび基準用量として選定されました。この用量は、環境に関連したBPA曝露のモデル化や、これまで安全と考えられていた曝露レベルで起こる神経行動的および生化学的変化の可能性を調査する実験研究で広く用いられています。重要なのは、実験的証拠の蓄積により、この用量またはそれ以下でも神経学的および行動的な悪影響が起こることを示しており、低用量BPA毒性の評価にこの効果が関連性を支持していることです1,2。TQ用量(10mgおよび20 mg/kg)の選択は、毒性を誘発しない神経保護および抗酸化効果を示した以前の実験研究に基づいています。これらの用量は神経毒性、酸化ストレス、神経炎症のげっ歯類モデルで広く用いられており、繰り返し投与した場合の報告された毒性閾値を大きく下回っています。パイロット用量発見試験は実施されませんでした。用量選択は文献の先例に基づき、有効性と翻訳関連性を確保するために安全性プロファイルが確立されました。

BPAは30日間連続して投与されました。最終曝露後31日目と32日目に行動評価が実施されました。動物はすべての行動テスト終了後32日目に生贄にされました。このタイムラインは、急性の取り扱いや手技的ストレスが後の生化学的、分子的、組織病理学的分析に与える潜在的な交絡影響を最小限に抑えつつ、行動評価に十分な時間を確保するために設計されました。チモキノンはBPA直後に同じ胃内経路を経由して1日1回投与されました。最終的なBPAおよびTQ投与後に行動検査が実施されました。実験のタイムラインは 図1にまとめられています。

体重測定
体重は、より正解されたデジタル精密天秤(感度±0.1 g)で測定されました。各ラットは投与前の朝に個別に体重測定され、変動を最小限に抑えるために標準化された条件下で1日目、10日目、20日目、32日目に測定値を記録しました(図2)。

行動評価
すべての行動パラメータは、グループ割りを盲目にした単一の観察者によって採点され、観察者バイアスと観測者間変動を最小限に抑えました。動物は行動テストの少なくとも30分間、新奇性によるストレスを減らすために試験室に慣れさせました。

オープンフィールドテスト(OFT)と強制泳ぎテスト(FST)を組み合わせて使用することで、BPAによる神経行動毒性の包括的な評価が可能となり、BPAは齧歯類の感情反応性と運動活動の両方を変化させることが示されています2,3。FST不動の解釈において、運動活動の変化に関連する交絡効果を最小限に抑えるために、OFT由来の運動運動アウトカムを考慮しました。

FST:うつ様行動は、32日目の強制泳ぎテストで評価され、その前に24時間前に行われた15分間の事前検査セッションが行われました。ラットは個別に直径35cm、高さ50cmの円筒形タンクに入れられ、深さ30cm、温度25±1°C)で水を満たし、5分間泳がせられました。移動不能、泳ぎ、登攀行動はビデオカメラで記録され、オフラインで分析されて行動的絶望を評価しました。

OFT:不安様行動および自発的な運動活動は、31日目のオープンフィールドテストで評価されました。各ラットは白いプレキシガラスのアリーナ(90cm×35cm)に個別に配置され、24の等間隔に分割され、5分間自由に探索させられました。動きはビデオカメラで記録されました。中央および周辺ゾーンで過ごした時間と4本の前足すべてでの交差回数は、不安に関連する行動や移動の指標として定量化されました。

サンプル採取
32日目には、ラットに筋内ケタミン(45 mg/kg)およびキシラジン(5 mg/kg)による深い麻酔を受けました。足の引き込み反射がなくなったことで、十分な麻酔深度が確認されました。血液は滅菌注射器を用いた心臓穿刺で採取され、各動物から約3〜5 mLの血液が採取されました。安楽死は深麻酔下での大量出血によって完了しました。血液サンプルは抗凝固剤入りチューブに移管され、3,000 x g で4°Cで10〜15分間遠心分離されました。 分離された血漿は分割され、生化学分析まで−80°Cで保存されました。

海馬と左大脳半球は迅速に解離され、計量され、液体窒素で速凍され、その後の生化学的解析のために−80°Cで保存され、右大脳半球は組織病理学的および免疫組織化学的評価のために10%中性緩衝ホルマリンに固定された。方法論的一貫性を確保し、サンプル間変動を最小限に抑えるため、左半球はすべての動物において生化学的測定に、右半球は形態学的解析に体系的に割り当てられました。重要なのは、ホルマリン固定は組織学的および免疫組織化学的手法に限定され、固定組織はタンパク質ベースの生化学的アッセイには使用されなかったため、固定に伴うタンパク質分解を防いだことです。生化学的評価では、凍結された脳組織の一定量(通常1回のアッセイで50〜100 mg)を、アッセイ特異的ホモジナイゼーションバッファーと各生化学パラメータの要件に応じた標準化された組織対バッファー比を用いて均質化しました。すべての解析は、各アッセイ内で実験群間で均等な組織量を用いて実施されました。

組織ホモジネート中の総タンパク質濃度は、製造元の指示に従いフルオメトリックタンパク質アッセイを用いて測定されました。すべての生化学的パラメータは、各アッセイ内で標準化かつ均等なタンパク質濃度を用いて測定され、サンプル間および実験群間の比較可能性を確保しました。

酸化ストレスパラメータの評価
脂質過酸化は、チオバルビツル酸反応物質(TBARS)法を用いて血漿および組織サンプルのMDAレベルを測定することで評価されました7。還元チオール(RSH)およびGSHレベルは、5,5′-ジチオビス(2-ニトロベンゾイン酸)(DTNB)ベースのアッセイを用いて分光光度測定で決定されました。硝酸塩還元後のグリース反応を用いて、血漿および組織ホモジネート中の総一酸化窒素(NO)レベルを測定しました。すべての生化学的パラメータは 、図3 および 図4に示されているように、nmol/gタンパク質またはμmol/g組織として表されます。すべての生化学的アッセイは重複して実施され、平均値は統計解析に使用されました。

脳組織解析に加え、血液サンプルから生化学的推定を行い、BPA曝露による全身性酸化状態の評価が行われました。血漿脂質過酸化レベルはTBARS法で測定され、結果はMDA相当物として表現されました。減少したスルフィドリル(RSH)レベルはDTNBを用いて測定し、前述の通り硝酸塩還元後のグリース反応で総NOレベルを評価しました。吸収度値は分光光度測定で532 nm(TBARS)、412nm(RSH)、540nm(NO)で記録されました。すべてのアッセイは標準化された条件下で重複して実施されました。

BPAは全身循環に入り、多臓器に作用する遍在する環境毒性物質です。したがって、循環中の酸化ストレスマーカーは全体的な酸化還元不均衡を反映する補完的な情報を提供します1,2。血液ベースの生化学的パラメータの評価により、中枢性と末梢の酸化変質の関係を評価でき、これらのマーカーは環境試験や臨床試験で曝露関連毒性の監視に一般的に用いられるため、所見の翻訳的関連性を高めます。

ウェスタンブロット解析
ウェスタンブロット解析を用いて、海馬組織中のKeap-1およびNrf-2タンパク質レベルを測定しました。約50mgの組織をプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む500μLのRIPAバッファーに均質化しました。ホモジネートは14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上澄液を採取しました。タンパク質濃度は製造元の指示に従い、蛍光定量測定法を用いて測定し、濃度は標準的な校正曲線から計算されました。同量のタンパク質(30μg)をβ-メルカプトエタノールを含むLaemmliバッファーと混合し、95°Cで5分間加熱、10%SDS-PAGEゲルで分離、PVDF膜に110Vで60〜90分間移しました。膜は3%BSAで遮断し、Keap-1およびNrf-2に対する一次抗体(1:3000)およびβアクチン(1:1000)と共に4°Cで一晩インキュベートし、その後HRP結合二次抗体でインキュベートしました。タンパク質バンドは化学発光で可視化され、バンド強度は密度測定解析で定量化され、βアクチンに正規化されました。

組織病理学的解析
右半球の脳組織サンプルは、10%中性緩衝ホルマリンに72時間固定され、段階化されたエタノール系列で脱水され、キシレンでクリアされ、標準組織学的手順に従ってパラフィンに埋め込まれました。新鮮な組織は生化学分析のために確保されました。冠状切片(5μm)は、ラット脳アトラス10に基づき、海馬および内嗅皮質レベルで取得されました。1匹あたり4回連続の切片をガラススライドに取り付け、組織学的および免疫組織化学的評価を行い、切片厚と解剖学的局所の均一性を確保しました。切片は脱脂、再水和、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)による染色が通常の染色プロトコル11に従って行われました。組織病理学的検査は、偏りを最小限に抑え観察者間のばらつきを排除するために、実験群を盲目にした単一の訓練済み観察者によって光学顕微鏡下で実施されました。

免疫組織化学的解析
関心領域は、海馬および内嗅皮質などを、BPA誘発性の神経毒性に対する脆弱性および認知・感情調節における役割に基づいて選定しました1,2。Nrf-2およびKeap-1の免疫組織化学的染色は、パラフィン埋め込み脳切片に対して実施されました。切片はキシレンで脱脂され、段階化されたエタノール系列で再水和され、シトレートバッファー(pH 6.0)で熱誘導抗原回収を受けました。インキュベーション前に内因性過酸化酵素活性が抑制されました。

切片は4°CでNrf-2(1:100)およびKeap-1(1:200)に対する一次抗体とともに一晩インキュベートされました。検出は、製造元の指示に従い、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した種特異的二次抗体を含む市販の即用ポリマーベースのHRP検出システムを用いて行われました。免疫反応性は3,3′ジアミノベンジジン(DAB)を染色原として用いて可視化され、その後ヘマトキシリンによる逆染色が行われました。区画は脱水処理、片付け、カバースリップが行われました。

陰性対照群は一次抗体インキュベーションなしで並行処理されました。定量解析のために、1匹あたり3つの隣接しない切片が評価されました。画像は全グループで同じ露光設定で取得されました。各セクションごとに16の重複しないフィールドがImageJソフトウェアを用いて解析されました。関心領域は手作業で区切り、背景染色を差し引き、免疫反応性は平均グレー値として表しました。動物ごとの平均値を計算し、統計分析に用いられました。

組織病理学的スコアリング
組織病理学的変化はH&E染色切片で半定量的に評価されました。各セクションごとに無作為に選ばれた重複しない10のフィールドが調査され、病理学的パラメータは独立してスコアリングされました。海馬および内嗅皮質の損傷重症度は、影響を受けた細胞の割合に基づく4点スケールで評価されました:スコア0(<5%)、スコア1(≤3分の1)、スコア2(1/3〜2/3)、スコア3(>3分の2)。統計分析には動物ごとの平均スコアが用いられました。

統計解析
データはSPSSソフトウェア(バージョン29.0)を用いて解析され、平均標準偏差(SD)±提示されています。サンプルサイズは、過去の研究と検出力分析に基づいて決定され、1群につき6匹の動物が生物学的に関連性のある差異を検出するのに>80%の検出力を提供することが示されました。データ分布の正規性はシャピロ・ウィルク検定を用いて評価されました。分散の均一性はレヴェーン検定を用いて評価されました。グループ比較は一方向分散解析(ANOVA)を用いて行われ、その後Tukeyの事後検定が行われました。統計的有意なのは p < 0.05に設定されました。

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結果

体重
研究の1日目と32日目に、グループ間で統計的に有意な体重差は認められませんでした(F(3,20)=2.750、 p > 0.05; 図2)。

行動テストの結果
野外試験解析では、BPA曝露が運動活動を有意に減少させ、対照群と比べて交差回数が減少したことが示されました(p < 0.001)。10 mg/kgおよび20 mg/kgのTQ治療では、BPA群に比べて交配数が有意に増加し(p < 0.001)、特にBPA+TQ II群でBPA+TQ I群と比べてより大きな増加が観察されました(p < 0.001;F(3,20)=183.031; 表1)。

BPA曝露は対照群に比べて開けたフィールドの中心で過ごす時間を有意に...

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ディスカッション

本研究では、USEPAにより安全と認められたポリカーボネートプラスチックの構造成分であるBPAが、50 μg/kg 1,2の用量で酸化ストレス、Keap-1/Nrf-2シグナル伝達、挙動、組織病理学的変化に与える影響を評価しました。さらに、抗酸化作用がよく知られている自然発生化合物TQの神経保護効果の可能性が、2種類の用量(10 mg/kgおよび20 mg/kg)で調査されました5,6,7。この研究結果は、安全な用量のBPAへの亜慢性曝露が著しい酸化的不均衡を引き起こし、Keap-1/Nrf-2シグナル伝達を妨げ、行動を障害し、著しい組織病理学的損傷を引き起こす一方で、併用治療はこれらの変化を用量依存的に効果的に緩和することを示しています。

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

このプロジェクトは大学の科学研究プロジェクト調整室(プロジェクト番号TIP)の支援を受けました。A4.24.003)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)Thermo Scientific  69-78-3 
Benchtop centrifuge NF048Nüve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, United States7D2C10
Bisphenol AMerck239658
BSA solution  Proteintech, United States)66201-1-Ig
Butylated hydroxytolueneSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatör Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuvarcih
azlari.com/urun/daihan-hg-
15d-dijital-homojenizator-set
-a?srsltid=AfmBOorx_az06ulc
HpSzKZsuP8-47Za4BkvLOM2
2Xhp00tgwWhJ-86Vc
Hematoxylin–eosin Bio OpticaW01030708
Hydrochloric acidMerck7647-01-0
Image J software program NIH; Washington, U.S.A.https://imagej.net/ij/
Immunohistochemical staining kit Lab VisionTM UltraVisionTM Large Volume Detection System: anti-polyvalentHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Germanyhttps://www.leicabiosystems.
com/histology-equipment/mic
rotomes/histocore-autocut/
Light microscope Nikon, Eclipse Ni-U, 940728
N-(1-Naphthyl)ethylenediamineThermo Scientific 1465-25-4
Nano Microplate ReaderBMG LABTECHSPECTROstar Nano
phosphate-buffered saline MerckP4417
Primary antibodies Keap-1 ProteintechCat No. 10503-2-AP, 1:200
Primary antibodies Nrf-2 ProteintechCat No. 16396-1-AP, 1/100
Qubit Protein BR Assay Kit ThermoFisher Scientific-INVITROGENQ33211
sodium citrateMerck03-04-6132
Sodium Dodecyl SulfateThermo Scientific 151-21-3
sodium hydroxideMerck1310-73-2
Sodium nitrateMerck7631-99-4
Streptavidin Peroxidase Thermo Scientific SHRP248-B
sulfanilamideThermo Scientific  63-74-1 
thiobarbituric acid Merck504-17-6
TQ CAYMAN 490-91-5
Tricarballylic acid, 99%Thermo Scientific Chemicals 139360500
Trichloroacetic acidThermo Scientific Chemicals76-03-9
Tris-HClThermo Scientific  1185-53-1 
Vanadium(III) chlorideSigma Aldrich7718-98-1
West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate and the iBright 750 Thermo Fisher Scientific systemhttps://www.clinxsci.com/product/mini
_chemiluminescence_imaging_system
?gad_source=1&gad_campaignid=
16224184202&gbraid=0AAAAAoN6
UOOtoB8UD0deumBAMD8Xi-1l-&g
clid=CjwKCAjwgeLHBhBuEiwA
L5gNEXtK2CNSLS1GqllMuNgkrFYD
aW7yK585njQjFja485Fkwj9lRUEKD
BoCgLoQAvD_BwE
Zinc sulfate solutionMerck7733-02-0

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