研究記事

進行非小細胞肺がん患者における異なる凍結保存時間および処理方法下でのPBMCのRNA品質への影響

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DOI：

10.3791/70261

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2026年4月21日

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1Biobank, Jilin Cancer Hospital, 2Medical Oncology Translational Research Lab, Jilin Cancer Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、NSCLC患者のPBMCの凍結保存において、三重分離試薬(TRIzol)と古典溶液(FBS + DMSO)を比較します。TRIzolは最大6か月間十分なRNA完全性を維持し、高品質なRNA保存に推奨されています。

要約

クライオ保存された末梢血単核細胞(PBMC)はRNAシーケンス(RNA-seq)に広く用いられており、そのRNAの質が検査結果に直接影響します。しかし、凍結保存はPBMCs内でRNA分解を容易に引き起こす可能性があり、長期凍結保存中にRNA品質を改善する方法の問題は未解決のままです。進行非小細胞肺がん(NSCLC)患者から採取した新鮮な血液サンプルから採取されたPBMCSを対照群として使用しました。PBMCサンプルのRNA保存効果は、古典的な細胞凍結保存溶液(90%胎児用牛血清[FBS]+10%ジメチルスルホキシド[DMSO])と一般的なRNA抽出試薬(TRIzol)を-80°Cで1、3、6ヶ月間比較しました。RNA濃度、純度、完全性(RNA完全性数値[RIN]で測定)は、多サンプルマイクロボリュームUV-Vis分光光度計および自動マイクロ流体電気泳動バイオアナライザーを用いて評価され、高品質RNAサンプルの保存に向けた理論的基盤を提供しました。本研究は、PBMCにおけるRNAの濃度、純度、完全性が凍結保存期間の延長とともに低下することを示しました。これら2つの処理方法はRNA濃度には影響を与えませんでしたが、RNAの純度と完全性には影響を与えました。TRIzolで6か月間クライオ保存されたPBMCのRNA完全性は満足のいくままでした。私たちの結果は、TRIzolが効果的なクライオパージョンに寄与し、高品質なRNAを維持することを示しています。

概要

NSCLC患者におけるPBMCのRNA-seqは、免疫療法の有効性評価において重要な役割を果たします。非小細胞肺がん(NSCLC)は世界的に一般的な悪性腫瘍であり、患者の約70%が進行期で予後が悪い状態で診断されます1,2。免疫療法はNSCLCの治療パラダイムを革新し、革新的な治療戦略を提供しています 3,4。免疫チェックポイント阻害剤(ICI)の治療において、NSCLC患者から得られる末梢血単核細胞(PBMC)のRNAシーケンス(RNA-seq)は免疫療法の臨床的効果の動的な変化を監視できます5。RNA-seqのサンプル源には腫瘍組織とPBMCsが含まれます。PBMCは臨床試験および基礎科学研究の両方で重要な生物学的標本として機能しています。クリオプロ温は、細胞や組織を静止状態に保ちつつ、その生物学的な可能性や特性を保つ、長期サンプル保存の主要な方法です。その結果、PBMCの低温保存は実現可能で広く採用されたアプローチとして浮上しています。クライオ保存PBMCはサンプルのバッチ分析を容易にし、実験室内外の変動を最小限に抑え、資源利用を最適化します8,9。例えば、凍結されたRPMI-1640培地に40%胎児乳液(FCS)および20%ジメチルスルホキシド(DMSO)を補足してPBMC凍結保存を行う研究では、CD39とCD73の組み合わせを発現するT細胞とB細胞の割合が保存10から6か月以内に比較的安定していることが示されています。ある研究では、市販の3つのクライオ保存キットと2種類のクライオプロテクション剤(90% RPMI-10% DMSO、90% 血漿-10% DMSO)を比較し、両方法で細胞生存率(81.0%)および回復率(73.7%)が類似していることが示されました。しかし、すべてのクライオ保存PBMCは新鮮サンプルに比べて生存率が著しく低下しました5。さらに研究により、TRIzol試薬中に再懸濁されたPBMC沈殿物が即座に-80°Cで凍結されることが示されました。 1〜2日後、PBMCCのRIN値が全血サンプルよりも高くなっていることを観察しました11。

別の研究では、TRIzol、RNAlater、その他の試薬で処理された白血球サンプルを比較し、すべての方法がRNA完全数(RIN)値>7を達成していることが示されました。RNAの完全性は自動マイクロ流体電気泳動バイオアナライザーを用いて評価され、RINはRNA品質の定量的指標として算出されました。RIN ≥7を含むサンプルはRNA-seq解析に適していると考えられました12。特に、白血球+RNAlater群は白血球+TRIzol群12に比べてRNA収量が有意に低いことが示されました。しかし、現在のPBMCクライオ保存に関する研究は主に解凍後の細胞生存率および免疫細胞表現型解析に焦点を当てています。異なる保存条件下でのRNA品質の体系的かつ長期的な評価には限定的な注目が集まっています。さらに、RNAの完全性を保つためのPBMCサンプルの標準化プロトコルも未発達です(13,14,15)。このギャップは特にNSCLC免疫療法において重要であり、縦断的に採取されたPBMCからの高品質RNAが、信頼性の高いバイオマーカー発見と治療反応のモニタリングに不可欠です。

本研究では、凍結保存法の選択がPBMC由来RNAの長期的な完全性と品質に有意な影響を与え、最適化されたプロトコルがRNA-seqのような感度アッセイへのRNA適合性を維持できると仮説を立てます。これに対処するため、進行したNSCLC患者から採取した血液サンプルから新たに分離されたPBMCを対照群として用いました。PBMCサンプルのRNA保存効果は、-80°Cの環境下で2つの処理法(90% FBS + 10% DMSOおよびTRIzol)で1、3、6ヶ月間比較されました(図1)。RNA濃度、純度、および完全性(RINで測定されたもの)は、多サンプルマイクロボリュームUV-Vis分光光度計と自動マイクロ流体電気泳動バイオアナライザーを用いて評価されました。本研究は、高品質なRNAサンプル保存の理論的基盤を提供し、腫瘍精密医療におけるトランスレーショナルリサーチとサンプル保存の進展を目指しています。

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プロトコル

本研究におけるヒト組織サンプルおよび臨床検体を用いたすべての手技は、機関ガイドラインに従い、吉林がん病院倫理委員会(倫理承認番号202507-002-01)により承認されました。サンプル採取前に、すべての参加者またはその法定後見人から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。吉林がん病院の進行非小細胞肺がん(NSCLC)患者19名から末梢血液サンプル(患者1人あたり10mL)を採取し、合計133点のRNAサンプルを得ました。実験室の安全を確保するため、有害化学物質を含むすべての作業は生物安全キャビネット内で行われました。

実験で使用された器具、試薬、消耗品の詳細な情報は 材料表に記載されています。

PBMCの孤立
末梢血液サンプルは採取後2時間以内にPBMC分離のために処理されました。PBMCは、ブレーキを無効にした室温で400× g のフィコル・パク密度勾配遠心分離法で25分間分離・精製されました。遠心分離後、中間の乳白色リンパ球層(PBMCを含む)を慎重に吸引しました16。重要なのは、各サンプルおよび各グループでPBMCの入力濃度を厳格に標準化し、すべての実験条件下で一貫した細胞数を確保し、細胞入力や処理による変動を最小限に抑えたことです。これにより、観察される差異は技術的なばらつきではなく、異なる保存方法の実際の効果を反映していることが保証されます。各患者に対して、分離されたPBMCは7本のチューブに分けられ、1本のチューブで即時のRNA抽出に使用され、濃度、純度、完全性が評価されました。残りの6本のチューブは-1°C/分の冷却速度でクライオ保存され、3本は90% FBS + 10% DMSOの1mLで処理され、残りの3本は1mLのトリゾールで処理され、その後-80°Cで保存されました。RNA抽出と品質評価は、1、3、6か月の冷凍保存後に行われました。

RNA抽出
サンプルは-80°Cの貯蔵から取り出し、4°Cで完全に解凍されるまで解凍されました。90% FBS+10% DMSOまたはTRIzolの冷凍保存溶液で保存されたサンプルは、PBSで一度洗浄し、200 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上澄液は細胞ペレットを保持するために廃棄されました。TRIzolを用いて全RNAを抽出しました。具体的には、処理済みサンプルを収めたマイクロ遠心分離機チューブにトリゾール試薬を逆さま混合し、室温で5分間培養して完全な溶解を確実にしました。その後、200μLのクロロホルムを加え、振って十分に混ぜて室温で15分間培養しました。2400 × g で4°Cで15分間遠心分離した後、上部水相を慎重に吸引し、新しいエッペンドルフ管に移しました。その後、イソプロパノール(0.5 mL)を加え、よく混合して室温で5〜10分間培養しました。2400 × g で4°Cで10分間遠心分離した後、上清液は廃棄され、RNA沈殿物はチューブの底に残されました。

沈殿物は75%エタノール(1 mL)に優しく振って再懸浮させ、その後1600 × g で4°Cで5分間遠心分離しました。 上澄液は廃棄され、RNAペレットは室温で5〜10分間自然乾燥させました。最後に、RNAサンプルは50μLのDEPC処理水に溶解し、55〜60°Cの水槽で5〜10分18分間培養しました。RNA濃度と純度の検出。RNA濃度と純度は、多サンプルマイクロボリュームUV-Vis分光光度計を用いた紫外線吸収法(測定範囲:2.5–3000 ng/μL)を用いて測定されました。RNA濃度は260 nmの吸収度値に基づいて決定され、RNA純度はA260/A280比率で評価されました。測定ソフトウェアがリリースされました。メインインターフェースで「核酸」をクリックした。検出プラットフォームは二重蒸留水で2回洗浄され、その後1.5μLのRNAサンプルをピペットで注入しました。サンプルタイプとして RNA-40 を選択し、「測定」をクリックし、濃度とA260/280純度値を記録しました。A260/A280比率が1.9から2.1の間であれば高いRNA純度を示し、1.8未満はタンパク質汚染、2.2を超えるとRNA分解または残留イソチオシアネートの可能性を示しました。

RNA完全性検出
RNA完全性(RIN)は、自動マイクロ流体電気泳動バイオアナライザーおよび検出キットを用いて評価されました。RINは1から10の範囲で、1は高度に分解されたRNA、10は完全なRNAを示します。分析のために、1.2 μLのRNAをPCRチューブに入れ、70°Cで熱サイクラーで2分間熱変性させた後、すぐに氷上に置きました。その後、1μLの変性RNAをチップの検出井戸に加え、分析20を行いました。ソフトウェアを起動し、「アッセイ」を選択し、「RNA」をドロップダウンメニューから選びました。「Eukaryote Total RNA Nano Series II.xsy」というプログラムは、使用された試薬に基づいて選定されました。「スタート」が押されて探知を開始した。約10分後、はしごのピーク番号とピーク高さの正常性を確認しました。

統計的手法
すべてのデータに対して正規性検定が実施されました。正規分布データは平均±標準偏差(SD)で表され、正規分布でないデータは中央値(四分位範囲、IQR)で表されました。正規分布データにはペアt検定、非正規分布データには関連標本非パラメトリック検定を用いて2群間の比較を分析しました。3群以上の比較には、正規分布データには分散の反復測定分析が用いられ、正規分布でないデータには関連標本非パラメトリック検定が用いられました。すべての統計解析はSPSS 19.0およびGraphPad Prism 9.*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001 を使用して実施されました。

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結果

PBMCサンプルにおける異なる凍結保存時間および処理方法がRNA濃度に与える影響
異なる凍結保存時間の影響:進行したNSCLC患者の新鮮なPBMCサンプルが対照群として使用されました。サンプルはTRIzolまたは90% FBS + 10% DMSOで処理され、-80°Cで1、3、6ヶ月保存されました。RNA濃度を測定するために総RNAを抽出しました。TRIzol処理サンプルの4群におけるRNA濃度は以下の通りで、フレッシュ523.5(485.0)ng/μL、1か月間279.3(261.7)ng/μL、3か月間217.9(186.9)ng/μL、6か月間195.8(294.8)ng/μLで、これらのグループ間の差は統計的に有意(P = 0.0196)(図2A)。90% FBS + 10% DMSOで保存されたサンプルのRNA濃度は以下の通りで、新鮮523.5(485.0) ng/μL、1か月間221.3(201.7) ng/μL、3か月間156.6(172...

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ディスカッション

生物学的サンプルにおけるRNA品質に影響を与える要因は多岐にわたります。前分析変数、輸送条件、常温での処理時間、組織壊死、温度および凍結生成物、アリコートのサイズと数、貯蔵期間などがRNA品質に大きな影響を与えます。同一サンプルの場合、凍結保存時間や処理方法の違いがRNAの品質に大きな影響を与えることがあります。過去の研究では、RNAの完全性が極めて重要であることが強調されており、RIN値が低いほど断片化されたRNA分子の割合が高くなり、下流の実験結果に大きな影響を与える可能性があります。

本研究は、TRIzolが進行したNSCLC患者のPBMCの長期(-80°C)保存において、従来の90% FBS + 10% DMSO凍結保存液に代わることを提案し、RNA-seqに適した高品質RNAを効果的に保存できることを提案します。標準化されたPBMC RNA品質評価プロトコル(分離、抽出、品質検出を含む)を確立し、1、3、6か月の凍結保存後のRNA濃度、純度、完全性を両溶液間...

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開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

実験への協力と基金への支援に感謝し、参加者の皆様に感謝申し上げます。本研究は吉林省科技局(助成金番号YDZJ202501ZYTS691)、吉林省衛生委員会(助成金番号2023jc064)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Agilent 2100バイオアナライザーアジレントG2939BRNA完全性の検出、RNA完全性数値(RIN)の生成による品質評価
アジレント RNA 6000 ナノキットアジレント5067-1511     Agilent 2100バイオアナライザーと連携し、RNA完全性のための専用試薬とチップを提供します
遠心分離機およびnbsp;                            エッペンドルフ  5424RRNA抽出のために
遠心分離機およびnbsp;                     エッペンドルフ  5810RPBMCの抽出
クロロホルム                 中国国家製薬集団有限公司20191031トリゾール法によるRNA抽出には、RNAを含む水相と不純物を含む有機相を分離するために用いられます
ジメチルスルホキシド北京定国長生DH105-2PBMCの凍結保存ソリューションとして、-80 & degでの長期保存を可能にします。C
チューブコーニングMCT-150-Cサンプル貯蔵、試薬混合、遠心分離、その他の実験作業のために
エタノール山東列康25071901Aトリゾール法によるIIn RNA抽出、残留RNA沈殿を洗浄して除去する
胎児用牛血清XpbiomedC04001-500PBMCのクライオパーソナリティソリューションとして、長期保存を可能にします。
フィコル分離解北京定国長生バイオテクノロジー有限公司CC0161密度勾配遠心分離によるPBMCの分離および精製のために
GeneTouch(Plus)サーマルサイクラーバイオアーTC-EA-48DARNAの熱変性(70 & deg;Cで2分間、その後バイオアナライザーで検出します
イソプロパノール中国国家製薬集団有限公司20210929トリゾール法によるRNA抽出において、RNA沈殿に用いられます
ナノドロップ8000分光光度計GeneCompanyND-8000RNA濃度(260 nmでの吸収度に基づく)および純度(A260/A280比率に基づく)については、紫外線吸収法を用いて測定します
PCRチューブコーニングPCR-02-CRNAの熱変性(70 & deg;Cで2分間、その後バイオアナライザーで検出します
リン酸塩緩衝塩水 プロセルシステムPB180327PBMC、またはその後の全RNAの直接溶解および保存のために
三重分離試薬 アドシンADS60154PBMC、またはその後の全RNAの直接溶解および保存のために

参考文献

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