本研究は、経カテーテル腎動脈塞栓術および急速心房ペーシングを用いて慢性中等度腎機能不全と心房細動を組み合わせた新しいin vivoビーグルモデルを確立し、この組み合わせが左心房内皮の機能を大幅に損ない、凝固促進活性を高め、炎症およびRAAS介在経路を通じて血栓症リスクを増加させることを示しました。
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研究記事
* These authors contributed equally
本研究は、経カテーテル腎動脈塞栓術および急速心房ペーシングを用いて慢性中等度腎機能不全と心房細動を組み合わせた新しいin vivoビーグルモデルを確立し、この組み合わせが左心房内皮の機能を大幅に損ない、凝固促進活性を高め、炎症およびRAAS介在経路を通じて血栓症リスクを増加させることを示しました。
心房細動(AF)と腎不全(RI)の同時出現は、臨床的に複雑な現象であり、高い有病率を示しています。本研究は、ビーグルの左心房内皮機能に対する慢性中等度RIとAFの併用が与える影響を調査しました。慢性RIは、左腎動脈主枝のゼラチンスポンジ顆粒を用いた経カテーテル塞栓術によって誘発され、動物は慢性腎実質損傷の発生を待つために3か月間維持されました。その後、連続的な急速心房ペーシング(基本周期長60ms、電圧、拡張期ペーシング閾値の4倍、180分)によって心房細動が誘発されました。組織学的変化はヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて評価されました。血漿および心臓組織における内皮機能、凝固、線維溶離、炎症、レニン–アンジオテンシン–アルドステロン系(RAAS)活性に関連するパラメータを、酵素結合免疫吸着アッセイ、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、ウェスタンブロッティングを用いて調査しました。結果は、中等度のRIを伴う慢性腎損傷モデルの確立に成功し、血漿クレアチニン、尿素窒素の有意な上昇、クレアチニンクリアランスの低下によって確認されました。左心房内皮機能は、RIおよびAFの併用を伴うビーグルで有意に障害され、凝固促進効果の強化と線維溶解の減少が伴いました。炎症マーカーはRI手技またはAF誘導後に上昇し、RI+AF複合群ではさらに増加しました。さらに、RI後にレニンおよびアルドステロン値の増加を示すRAAS活性が上昇し、AFとの併用時にはさらに増加しました。まとめると、本研究はビーグルにおける慢性中等度のRIとAFを組み合わせた 生体内 動物モデルを確立し、この組み合わせが左心房内皮の機能を著しく乱し血栓リスクを高めることを示しました。
持続性心律不整脈の中で最も一般的な形態である心房細動(AF)は、不利な臨床結果と密接に関連しています。AFの全身的な病態生理的特徴により、この不整脈は認知機能低下、うつ病、全身塞栓症など、さまざまな併存疾患と複雑な病態生理学的クロストークを頻繁に呈します。慢性腎疾患(CKD)は、AFの発症および血栓塞栓症の発生において独立したリスク因子として特定されています。慢性腎腎臓病と診断された患者の約15%から20%が心房細動に影響を受けており、腎置換療法を受けている患者のうち心房細動を発症する割合は15%から40%の範囲です2。一方で、AFと診断された患者の約30%から60%が軽度から中等度の腎不全(RI)を同時に呈しています3。したがって、AFとRIの同時出現は複雑な臨床現象となり、患者集団で高い有病率となっています。AFとRIの双方向関係はAFの発症リスクを著しく高め、腎障害の進行を悪化させ、最終的には臨床転帰の悪化に寄与します。
過去の研究では、ラットを用いてRIモデルを確立することが多かったです。しかし、心臓の大きさが小さいため、心臓の電気生理学的実験には適していません。一方、犬は中大型動物モデルの腎不全に頻繁に用いられ....
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本研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の『実験動物のケアと利用に関するガイド』(出版物番号85-23、1996年改訂)の推奨事項に厳密に従って実施されました。この研究プロトコルは北京安鎮病院の施設動物ケア・利用委員会(承認番号81700293)によって承認されました。研究プロトコルは当院の施設動物ケア・利用委員会によって審査・承認されました。動物の苦しみを最小限に抑え、研究で使用される動物の数を減らすためにあらゆる努力がなされました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. 動物モデルと実験設計
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慢性中等度RIおよびAFの動物モデル
実験設計とタイムラインの概観は図1に示されています。図2A,Bに示された左腎動脈血管造影の代表画像は、経カテーテル塞栓術後に小腎動脈枝が正常に閉塞され、繰り返し血管造影時に遠位動脈の不透明化が見られないことが示されました。RI手術から3か月後、ビーグルが生贄にされ、腎臓が摘出されて写真撮影されました。左腎臓は右腎に比べて多焦点で不規則な蒼白領域で著しく縮小していることが観察されました(図2C,D)。HE染色による組織学的検査により、RI群の球体が対照群と比べて著しく損傷しており、RI手技後に大多数のネフロンで機能喪失が見られたことを示しています(
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本研究では、中等度のRIとAFを組み合わせた 生体内 動物モデルを確立し、これらの病的条件下での左心房内皮機能障害の病因を探りました。本研究の主な成果は以下の通りです。まず、ビーグル犬における左大腎動脈の3か月間の塞栓術は中等度のRIを成功裏に誘導しました。次に、ビーグルにAFモデルが実質的に確立されました。第三に、RIおよびAFの両方を持つ動物では左心房内皮機能が有意に低下し、凝固促進効果の強化と線維溶解の低下が伴い、血栓症のリスク増加につながる可能性があります。第四に、慢性中等度のRIとAFの組み合わせは、炎症反応の有意な促進とRAAS活性の強化と関連していました。
RIとAFを併用した患者における血栓症および出血のリスク評価は臨床実践において重要なテーマです。最近の研究では、腎機能と心房細動の複雑な相互作用が血栓塞栓症に影響していることも強調されています12。適切なRI動物モデルの不足は、このテーマに関する基礎研究のボトルネックとなっています。.......
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著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。
この研究は、非感染性慢性疾患国家科学技術主要プロジェクト(No. 2024ZD052500、No. 2024ZD0521504)、中国国家自然科学基金(助成金番号81700293およびNo.81970272)、北京安鎮病院高水準研究資金(資金プロジェクト番号2025AZB5005)の支援を受けました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 6-0 ポリプロピレン縫合糸 | Ethicon (Johnson & Johnson) | 8706H | 大腿動脈修復用 |
| 5F 多目的カテーテル | Cordis (Cardinal Health) | 521-550S | 腎動脈カニューレ挿入と塞栓術用 |
| 6F 四極電極カテーテル | St. Jude Medical | 401443 | 右心房ペーシング用 |
| 6F 血管導入鞘 | Terumo | RS*A60K10SQ | 大腿動脈アクセス用 |
| ABI 7500 リアルタイムPCRシステム | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 4351105 | qRT-PCR 熱サイクリングと蛍光検出用 |
| 吸収性ゼラチンスポンジ顆粒（直径50 mg） | Jinling Pharmaceutical | — | 経カテーテル腎動脈塞栓術用; 造影剤と生理食塩水(1:1)でスラリーとして調製 |
| ADMA ELISAキット（犬用） | Cusabio | CSB-E09297c | 血漿非対称ジメチルアルギニン測定用 |
| アルドステロンELISAキット（犬用） | Cusabio | CSB-E08014c | 血漿アルドステロン測定用 |
| BCA タンパク質アッセイキット | Thermo Fisher Scientific | 23225 | タンパク質濃度定量用 |
| ビーグル犬（オス、4–5歳、10–12 kg） | 上海交通大学農業実験動物農場有限公司 | — | 健康なオスのビーグル犬; 標準条件で個別に収容 |
| Cアーム蛍光撮影システム | GE Healthcare | OEC 9900 Elite | カテーテル挿入と血管造影中の蛍光撮影ガイダンス用 |
| 化学発光イメージングシステム | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | ウェスタンブロットバンド可視化用 |
| クレアチニンELISAキット（犬用） | 南京建成生物工程研究所 | C011-2-1 | 血漿クレアチニン測定用 |
| カフ付き気管チューブ（ID 7.0–8.0 mm） | Covidien (Medtronic) | 86449 | 気管挿管と機械的人工呼吸用 |
| DF-5A 心臓刺激器 | 蘇州東方電子技術研究所 | DF-5A | 急速心房ペーシング用; 設定: BCL 60 ms、パルス幅 2 ms、電圧 4×閾値 |
| ECL ウェスタンブロット基質 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | ブロット可視化用強化化学発光キット |
| EDTA 抗凝固チューブ | BD Vacutainer | 367835 | 血液採取（血漿分離）用 |
| eNOS 一次抗体（ウサギ） | Cell Signaling Technology | 32027 | 希釈 1:1000; ウェスタンブロッティング用(~130 kDa) |
| エオジンY溶液（水性） | Solarbio | G1100 | H&E 反染用（2分） |
| フォーリー尿道カテーテル（8 Fr） | C.R. Bard | 0165SI08 | CCr測定中の定時尿採取用 |
| GAPDH 一次抗体（ウサギ） | Cell Signaling Technology | 5174 | 希釈 1:1000; ウェスタンブロッティング用内部コントロール(~36 kDa) |
| GraphPad Prism（バージョン8.0） | GraphPad Software | — | https://www.graphpad.com; 統計分析用（単因子分散分析、Dunnettの検定） |
| ヘマトキシリン溶液（Harris） | Solarbio | G1140 | H&E 核染色用（5分） |
| ヘパリンナトリウム注射液（非分画） | 常州千紅バイオファーマ | H32022088 | カテーテル挿入中の抗凝固用; 10 mL の生理食塩水に4000 IUを希釈 |
| HRP結合ウシ抗マウスIgG二次抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | 希釈 1:5000; ウェスタンブロッティング用 |
| HRP結合ウシ抗ウサギIgG二次抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | 希釈 1:5000; ウェスタンブロッティング用 |
| hs-CRP ELISAキット（犬用） | Cusabio | CSB-E08557c | 血漿高感度C反応性蛋白測定用 |
| IL-6 ELISAキット（犬用） | R&D Systems | CA6000 | 血漿インターロイキン-6測定用 |
| ImageJ ソフトウェア（バージョン1.53） | 米国国立衛生研究所 | — | https://imagej.nih.gov/ij/; ウェスタンブロット密度分析用 |
| iNOS 一次抗体（ウサギ） | Abcam | ab178945 | 希釈 1:1000; ウェスタンブロッティング用(~130 kDa) |
| ラクテートリンガー溶液 | Baxter | 2B2324 | 静脈内液; 処置中は5–10 mL/kg/hで注入 |
| 光学顕微鏡 | オリンパス | BX53 | HE染色腎臓切片の組織学的検査用 |
| 機械式人工呼吸器（獣医用） | Midmark | Matrx Model 3000 | 一回換気量15 mL/kg; 呼吸数12–15回/分 |
| マイクロプレートリーダー | BioTek | Synergy HTX | 450 nmでのELISA吸光度測定用 |
| 中性緩衝パラホルムアルデヒド（10%） | Solarbio | P1110 | 腎臓組織固定用（24時間） |
| NO ELISAキット（犬用） | 南京建成生物工程研究所 | A012-1-2 | 血漿窒素酸化物測定用 |
| 非イオン性ヨウ素造影剤（イオヘキソール） | GE Healthcare | Omnipaque 350 | 腎動脈血管造影用; 注入量は3 mL/sで5–8 mL/注 |
| PAI-1 ELISAキット（犬用） | Cusabio | CSB-E13043c | 血漿プラスミノーゲン活性化阻害因子-1測定用 |
| PAI-1 一次抗体（ウサギ） | Abcam | ab66705 | 希釈 1:1000; ウェスタンブロッティング用(~45 kDa) |
| パラフィンワックス | ライカバイオシステムズ | 39601006 | 組織埋め込み用 |
| PrimeScript |