ミウリがん腫瘍内免疫療法研究における皮内腫瘍の着床モデル

サマリー

腫瘍内免疫療法への関心が高まる中、利用しやすく実用的な腫瘍モデルの選択が不可欠です。皮下腫瘍は確立しやすいですが、可視化や操作は困難です。本プロトコルでは、視認性とアクセス性を向上させる皮内腫瘍の生成方法を説明しています。

要約

再現可能なマウス腫瘍モデルの確立は、がん生物学や免疫療法戦略の評価に不可欠です。腫瘍内免疫療法は、既存腫瘍を免疫刺激試薬で治療し、局所免疫抑制を逆転させ全身抗腫瘍免疫を刺激します。マウスのがん研究の多くは腫瘍を皮下空間に定めており、腫瘍内注射の可視化が困難であるため、実験的な腫瘍内免疫療法には本質的な課題があります。腫瘍細胞への皮内注射は、腫瘍を可視化できる腫瘍を生成する信頼性の高いアプローチを提供し、腫瘍内注射や成長動態および治療反応のモニタリングを支援します。ここでは、C57BL/6マウスにおけるマウスB16F10メラノーマモデルを用いて、皮内腫瘍の確立と治療に関する再現可能な方法論を提示します。腫瘍細胞懸濁液は皮内注射され、腫瘍着床から7〜10日後、腫瘍が~60 mm³に達したら、免疫刺激剤の腫瘍内注射や電気穿孔、加熱などの物理的治療を直接施すことができます。これにより、正確な治療投与とキャリパーによる腫瘍増殖の測定が可能となり、皮下腫瘍の複数治療による可視化できない変動という課題を回避できます。この技術に関する詳細な洞察を提供することで、本記事は再現性を支援し、腫瘍内免疫療法の前臨床研究を推進することを目指しています。

概要

マウス腫瘍モデルはがん研究において不可欠なツールです。最適なマウスモデルでは、遺伝的および形態学的レベルの両方で人間の腫瘍に非常に近い腫瘍を誘導することが可能である^。これにより、腫瘍内免疫療法(ITIT)を含むさまざまな分野での新規治療アプローチの評価と効率化が可能となります。ITITは、腫瘍微小環境(TME)に直接免疫刺激剤を投与するがん治療の新興分野です。この局所的な投与は局所免疫活性化を促進し、免疫抑制性腫瘍の微小環境を逆転させ、全身性抗腫瘍免疫応答(アブスコ^パル効果)を引き起こすことが可能です。しかし、腫瘍内投与の効率、正確性、一貫性は、異なる腫瘍モデルにおける注射パラメータの可視化と制御能力に依存します。

ほとんどの前臨床がん研究では皮下腫瘍の着床が用いられます。しかし、この方法は腫瘍を手術なしでは注射時に直接確認できないため、腫瘍内治療には限界があります。多くの腫瘍内免疫療法戦略は、試薬を小さなマウス腫瘍に正確に投与する必要があり、その作業を複数回行うことも多いです。視覚的な確認がなければ、注射の精度や皮下腫瘍内の試薬保持は制御が不十分な変数となります。これにより、実験データの誤解やばらつきが生じる可能性があります。³.

皮内腫瘍移植は、腫瘍観察、測定、腫瘍内注射において直接的でアクセスしやすく、可視化可能かつ再現可能な代替手段を提供し、一貫性を高めます。さらに、皮下注射ではなく皮内に植え付けられる腫瘍は免疫原性を高め、腫瘍細胞の腫瘍原性を抑制することが研究で示されています⁴。皮内注射腫瘍はリンパ節への樹状細胞輸送を迅速かつ強力に誘導し、腫瘍特異的細胞傷害性T細胞の早期かつより強固な活性化をもたらしました⁴。本研究では、C57BL/6マウスにおける皮内B16F10メラノーマ腫瘍の確立と、その後の腫瘍内治療を行う詳細かつ再現性の高いプロトコルを記述しています。

プロトコル

すべての手続きは、施設動物ケア・利用委員会(IACUC)ガイドラインの承認と遵守のもとで実施^{されました。}すべての動物処置はダートマスの動物施設で行われました。生後6〜8週のメスのC57BL/6マウスは、標準的な条件で換気されたラックに餌と水を置いて飼育されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. シェービングマウス

注: すべての職員は、これらの処置を行う前に、生きた動物の取り扱いと麻酔に関する機関的な訓練を修了しなければなりません。

1. 皮内注射前に、以下のように各マウスの脇腹を剃ります。右側面は注射と前述の処置に使われました。腫瘍細胞を注射する前日にマウスを剃ってください。
2. マウスを安定した面に置いてください。左手の親指と人差し指でネズミの首筋の皮膚をつかみ、体の左側を優しく手のひらに引き寄せて右側を露出させます。薬指や小指で左脚と尾を押さえ、右脇腹を完全に露出させます。
3. 後ろ脚から下肋骨までの毛を剃り、注射のためのクリアな部分を作ります。
4. 追加の練習スペースが必要な場合は両脇腹を剃ることもあります。
   注意:初心者は髭剃りや適切な無精ひげの練習時にネズミに麻酔をかけることができます。

2. 造影剤注射の練習

注意:練習は生きた(麻酔済み)マウスと安楽死マウスの両方、そしてどちらの性別でも行うことができます。オスのマウスは一般的にメスに比べて皮膚が厚く柔らかく、技術的に難しいです。このため、オスで練習することは熟練度を伸ばすのに役立ちます。

1. 食用色素とリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を1.5mLのエッペンドルフチューブで混ぜ、溶液が濃く見えるまで続けます(本研究では青色着素が使用されました)。
2. 練習用マウスを入手し、施設動物ケアのガイドラインに従って麻酔をかけてください。
3. 麻酔をかけたマウスを鼻のコーンの下に置き、体を傾けて右側脇腹を露出させます。足パッドを優しくつまんで効果がないことを確認すると、十分な麻酔がかかっているか確認してください。
4. 29 Gの針で0.3 mLのインスリン注射器に30 μLの染料溶液を注入します。すべての気泡を取り除いてください。
5. 利き手でない方の手で、脚や皮膚を優しくつまんで伸ばして滑らかで張った表面を作ります(皮膚を上に持ち上げないように)。針の ベベルアップ を皮膚に対して浅く平行な角度で真皮に挿入します。針を表面下に露出させて、皮膚の位置を確認してください。
   注: 練習中は、針の経路から指を離しながら安定した皮膚の緊張を保つために、さまざまな握り方を試してください。針を皮膚に~ 2mm 差し込みます。逆流を減らすために、針を ~3mm挿入し、注射前に少し引き抜いて「ポケット」を作ります。これにより、注入部位に染料が留まります。
6. 30μLの染料溶液をゆっくりと注入し、皮膚の下に小さくはっきりとした「泡」ができるまで続けます
   注: 目に見える泡がないことから、注射は皮内投与ではなく皮下投与されたことを示唆しています。ベベルを上向きに保つことで、正確な皮膚の位置を確保し、過度に深い注射を防ぎます。
7. 皮内泡が安定して形成されるまで練習を続けてください。片側につき最大6回から8回の注射が可能です。
8. 練習注射を終えた後、承認された施設動物ケア・使用委員会(IACUC)のプロトコルに従ってマウスを安楽死させます^。

3. 注射用腫瘍細胞の準備

注意:細胞関連のすべての手順は無菌フード内で行ってください。マウス腫瘍系統によって成長が異なることに注意してください。

1. 皮内注射の数日前に腫瘍細胞(本研究で使用されたB16F10)を解凍します。
2. 適切な新鮮培地を維持しながら、細胞を70%–80%の合流率に培養します
   注意:100%コンフルエンスは増殖を止め、腫瘍の成長を妨げます。
3. 細胞を7×10⁶ 細胞/mLで採取し、1xPBS、血清フリーRPMI、または細胞培養に使用する他の培地で準備します。
   注:実験室で使用されているB16F10腫瘍モデルは、30μLの2×10⁵ 細胞を使用します。30μLの注射量は適切ですが、必要に応じて細胞数を調整して望ましい腫瘍モデルを確立できます。細胞はチューブの底に沈殿し集まるため、細胞の濃度を一定に保つために、定期的に優しく混合して懸浮させてください。
4. 処理後は細胞を氷に保管し、迅速に注射を進めてください。長時間の氷での保存は細胞の生存率を低下させ、それが生細胞の供給数を減少させ、腫瘍の形成に悪影響を及ぼす可能性があります^。
   注意:細胞はすぐに採取され、実験室で使用されます。注射は細胞処理から20〜60分以内に行われ、氷に置かれます。大規模なコホートで作業する際は、氷上での時間を最小限に抑えるためにパートナーを活用しましょう。

4. 皮内注射

1. 実験用マウスに麻酔をかけてください。
   注:検査室ではイソフルランガスによる麻酔が使用されますが、注射麻酔も使用可能です。
2. 麻酔誘導後、マウスを鼻のコーンの下に置き、体を右脇腹を完全に露出させる位置にします。
3. 均一に混ざるように、セルの懸濁液を優しく反転させます。
4. 29 Gと1/2インチの針で0.3 mLの注射器に細胞懸濁液30 μLを抽出します。気泡を取り除きましょう。
5. 利き手でない方の手で、脚や皮膚を優しく横に伸ばして滑らかできつくします(上に持ち上げるのは避けてください)。針のベベルアップを浅く平行な角度で真皮に挿入します。針は皮膚の下に見えるようにして、深く入りすぎないことを示します。
   注意:針の深さは皮膚に~2mm入り込む必要があります。細胞の逆流を防ぐために、針を皮膚に~3mm挿入し、針を少し引いて細胞を注入するための「ポケット」を作ります。これにより逆流が大幅に減少します。
6. 細胞懸濁液の30μLを非常にゆっくりと注入し、皮膚の下に小さな目に見える「泡」ができるまで続けます。針を抜く前に5〜10秒待ってください。
   注意:針を急に抜くと圧力で溶液が皮膚から抜けてしまうことがあります。
7. これをマウスごとに繰り返します。針の鈍化を防ぐために、ケージごとに4〜5匹のマウスを注射器を交換してください。
8. すべてのマウスが麻酔から完全に回復するまで監視してください。
9. マウスの腫瘍形成を監視してください。

5. 腫瘍内注射

注意:腫瘍は通常、着床後7〜10日で適切な大きさに達し次第治療準備が整います。実験室で適切なサイズは~50 mm³以上で、式は以下の通りです:体積 = (長さ/2) * (幅×幅)^7,8。

1. すべての治療溶液を事前に準備してください(例:本研究では1倍のPBSが使用されました)。特定の処理に応じた氷や室温で溶液を保管してください。
2. 施設のガイドラインに従って麻酔を誘導してください。
3. 麻酔を維持するためにマウスを鼻のコーンの下に置き、腫瘍が露出するように位置を整えてください。
4. 必要な量(例:ここで使用した30μL)を29G1/2インチの針で0.3mLのインスリン注射器に取り込みます。気泡を取り除きましょう。
   注:治療の選択肢や最適な条件によって体積は異なります。
5. 針を腫瘍に水平に挿入し、腫瘍の中心部に向かって進みます。
   注意:上部や急な角度からの挿入は避けてください。注射が深すぎたり周囲の組織に入りすぎたりする恐れがあります。説明された治療は単一注射で行われました。投与量と頻度はすべて、選択する治療や最適な条件に依存します。小さな腫瘍では1回の投与で十分な分散ですが、大きな腫瘍の場合は腫瘍全体に均等に分散させるために複数回の注射が必要になることがあります。
6. 治療はゆっくりと着実に注射してください。逆流や漏れを最小限に抑えるために、針をゆっくり抜く前に10秒間休憩してください。一部の腫瘍は内圧が高いため、注射が針穴から漏れ出さないように注意が必要です。
7. この手順を各マウスごとに繰り返します。4〜5匹のマウスをケージで回すたびに、また処理グループを変更する際には、交差汚染を防ぐために注射器を交換してください。
8. 麻酔後はマウスが可動域と正常な呼吸を取り戻すまでモニタリングしてください。治療反応や全体的な健康状態について、毎日のモニタリングを続けてください。
   注意:異なる細胞株によって腫瘍の潰瘍の原因となる時期が異なる場合があることに注意してください。各実験および各IACUCプロトコルには明確なエンドポイントと除外基準が記載されています。実験室ではマウス実験のエンドポイントは1500 mm³ であり、発生した潰瘍は承認され、研究から除外されません。

結果

造影剤注射の練習では、注射部位に目に見える「バブル」が形成される様子を観察することで、安楽死せずに成功した皮内投与を検証できます。適切に行われた皮内注射は大きく、明確に浮かび上がった「バブル」(図1A–F)を生じさせます。小さく平らな気泡は、注射が部分的に皮下に施されている可能性を示唆しています。「泡」が形成されず、染料や細胞が皮膚の下に広がっている場合、注射は皮下投与であった可能性が高いです(図1G–J)。動物が練習注射後に安楽死された場合、皮膚を開けて皮下腔に漏れた注射を確認できます。

皮内注射から約5日後に腫瘍が見え、7〜10日後には治療に適している状態になります。腫瘍が皮下腫瘍でないことを確認するためには、2つの検証方法が用いられます。まず、触診は利き手でない手でネズミの首根を優しく撫で、利き手で腫瘍を触診する方法です。皮...

ディスカッション

このプロトコル(図4)の成功は、皮下層ではなく真皮への注射を確実にするために、一定の皮内注射深度と正確な針の配置を維持することにかかっています。針の角度が急すぎたり注射圧力が高すぎると、染料や腫瘍細胞が皮膚を通って皮下空間に沈着することがあります。注射後は、針をゆっくりと抜く前に一時停止することで、側面の漏れやダブルト腫瘍(「雪だるま」状の出現)の発生を防ぐことができます。注射やマウスの扱いをする際は、誤って針刺しのリスクを最小限に抑えるように、常にしっかりと握るようにしてください。トラブルシューティングには、正しい皮内注射位置を示す「バブル」の存在を確認し、使用前に注射器に気泡がないか確認してください。しっかりとした皮膚の張力を維持することで精度が向上し、注射器を定期的に交換することで針の鈍さを防ぎ精度を低下させます。皮膚が厚く柔軟性に欠けるオスのマウスで練習することで、一貫した技術を身につけることができます。

新たに調製された腫瘍細胞の懸浮液の使用も重...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL Natural Centrifuge Tube	USA Scientific	1615-5500
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	430825
Fluriso	Vet One	13985-528-60	イソフルラン
Food Coloring	Durkee		練習用
Insulin syringe 0.33 x 12.7 mm	Exel	26018
Mini Arco	Wahl	08787-450A	マウスを剃るためのクリッパー
PBS, 1X w/o calcium & magnesium	Corning	06325002	pH 7.4 +/- 0.1
RPMI 1640, 1x	Corning	12225004
SomnoFlo Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	麻酔機