ナノディスク内の膜タンパク質を安定化する技術

サマリー

本研究は、膜タンパク質であるTWIK関連酸感受性K⁺ チャネル2(Task2)をナノディスクに再構成する手順を概説します。この成功した組立は、単一粒子クライオ電子顕微鏡検査によって確認され、明確に定義された二次元のクラス平均が得られました。

要約

多くの膜タンパク質は、洗剤ベースの環境で抽出すると安定性が低く、活性が低下し、サンプルの異質性を示し、高分解能のクライオ電子顕微鏡解析に大きな課題をもたらします。ナノディスク技術は、膜足場タンパク質(MSP)とリン脂質を用いて標的タンパク質をネイティブ様脂質二重層に再構成することで、これらの制限に対処しています。本研究では、適切な洗剤の存在下でヒトカリウムチャネルTask2を発現、溶解、精製し、ナノディスク組み立ての前に行いました。その結果生まれたプロトコルは、Task2ナノディスク再構成のための再現可能なワークフローを確立し、主要な検証ステップによって示されています。すなわち、粒子拡大を確認するサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)プロファイルの明確なシフト、SDS-PAGE上でTask2とMSPの共移行、そして目に見える二次構造特徴を伴う明確な2Dクラス平均です。初期の3D再構築により、ナノディスクに埋め込まれたタンパク質の完全性がさらに確認されました。サンプルの純度、均質性、粒子品質を向上させることで、このアプローチはTask2の高解像度構造研究のための堅牢なプラットフォームを提供し、他の膜タンパク質にも適用可能な方法論的枠組みを提供します。

概要

膜タンパク質は細胞のシグナル伝達、代謝物輸送、細胞構造の完全性維持、免疫応答において重要な役割を果たします。膜タンパク質の調節異常はさまざまな疾患に関与しており、これらは医薬品開発の重要な標的となっています^。クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の登場により、大きく動的な膜タンパク質の構造的研究が可能になりました^。高解像度構造を得る主な課題は、これらのタンパク質を本来の脂質二重層から抽出しつつ、その本来の立体構造と生化学的機能を保持することです。さらに、膜タンパク質の非常に動的な構造化や抗体スクリーニングの複雑さは、標的的特有の創薬にさらなる障害をもたらします^3,4。従来の膜タンパク質抽出法では、疎水性脂質二重層の性質を模倣するために洗剤が用いられることが多いです。しかし、この方法はしばしば膜タンパク質の安定性を乱し、凝集や部分展開を引き起こすこと^{もあります。}さらに、洗剤はタンパク質の構造を安定化させるために重要な必須脂質分子を除去し、タンパク質の構造を変化させたり機能を損なったりする可能性があり、その結果、抗体スクリーニングやその他の後続的応用への応用が制限される可能性があります⁶。

ナノディスク技術は、スリガーらによって最初に導入^{されました。}この自己組織化構造は、通常、アポリポタンパク質A1(ApoA1)誘導体、すなわちMSPと合成または天然脂質によって形成され、膜タンパク質^7,8,9の安定した環境を提供します。MSPは脂質二重層の疎水性縁を囲んで円盤状の構造を形成します。この構造は、アシル脂質の尾部と相互作用する疎水性表面を持ち、膜タンパク質を安定化させ、外側に向いた親水性の表面を持ち、膜タンパク質が^水溶液に溶けやすい状態を保つことを可能にします。ナノディスクは膜タンパク質研究のための多用途なプラットフォームとして機能します。精製膜タンパク質をほぼ天然脂質環境に保存することで、従来の洗剤ベースの方法の限界を克服し、タンパク質の構造と生物学的機能をin vitroで維持します。その結果、この方法は膜タンパク質の構造研究において強力なツールとなっています。従来の洗剤環境と比べて、ナノディスク内の脂質二重層は膜タンパク質の構造的サポートを提供し、その本来の立体構造を安定化させます。これは、Gタンパク質結合受容体やイオンチャネルなど、不活性化しやすいタンパク質にとって重要な特徴です¹¹。さらに、組み立て後のナノディスク粒子の高度に均一な性質は、高品質なクライオEMデータや信頼性の高い表面プラズモン共鳴/バイオ層干渉計の運動学データの取得に強力な支援を提供します¹²。

過去10年間で、ナノディスク技術は自然脂質環境下での膜タンパク質研究の強力なツールとなりました。例えば、Vilelaらは再構成条件の最適化と最終成分の品質検証を通じて、ナノディスク組立の体系的な枠組みを^{確立しました。}具体的には、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)と定量的指標(組み立て効率やピーク対称性を含む)を組み合わせ^{、サンプルの}均質性を客観的に評価しました。現在、ナノディスクは多用途なプラットフォームとなっています。単一粒子クライオEMを用いて組み立てられたナノディスク再構成タンパク質を検出することで、膜タンパク質の高分解能構造が得られ、その応用可能性が確立されています。MSPバンドの二重環密度特徴は、^10、14、15の結合成功の決定的な構造的証拠です。さらに、ナノディスクは脂質二重層環境における膜タンパク質の機能解析や溶液核磁気共鳴研究への応用においても貴重なツールとなります(^16,17)。

このプロトコルは、ヒトのTask2膜タンパク質をナノディスクに組み立てる方法を記述しています。Human Task2は、2孔ドメインK⁺(K₂P)チャネルファミリーのpHゲートメンバーです^18,19。他のK₂Pチャネルと同様に、Task2はドメインスワップドホモダイマーであり、各プロトマー鎖は4つの膜貫通ヘリックス(TM1–TM4)、2つのリエントラント孔ヘリックス(PH1およびPH2)、2つの選択性フィルター(SF1およびSF2)、および2つの細胞外キャップ形成ヘリックス(CH1およびCH2)を含みます。標的タンパク質は、C末端の166アミノ酸を欠いたTask2の切り詰め型であり、この領域はほとんど構造化されていないと予測されていましたが、タンパク質発現と生化学的安定性の向上が認められました。再結合されたTask2の分子量はGFPタグ付きで約72 kDaです。事前に洗剤で溶解・精製されていました。脂質およびMSPと、正確に計算された化学量論比で組み合わされました。バイオビーズを用いた洗剤除去後、サンプルはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)でさらに精製され、クライオEMに適した調製剤が得られました。その後、単一粒子のクライオEMデータから二次元(2D)クラス平均値を生成し、サンプルの完全性を検証しました。

プロトコル

1. 脂質ストックの調製

1. 脂質調製
   1. 3種類のリン脂質を用いて脂質混合物を製製します:1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールミン(DOPE)、2-オレオイル-1-パルミトイルグリセロ-3-ホスホコリン(POPC)、および1-パルミトイル-2-オレオイルホファチジルセリン(POPS)。
   2. これらの脂質を事前に調製した塩基溶液をクロロホルムに含み、それぞれ25 mg/mLの濃度で使用します。
      注意:クロロホルムを取り扱う際は個人用保護具の着用が義務付けられ、すべての処置はフムフード内で行われなければなりません。クロロホルムは専用の化学薬品キャビネットに保管してください。
   3. クロロホルムの揮発性のため、マイクロシリンジで測定する際は、使用前に脂質ストック溶液の体積が最初に記録された体積と一致しているか確認してください。蒸発が発生した場合は、純粋なクロロホルムを元の体積まで補充し、十分に混ぜます。
      注意:各測定前にマイクロシリンジをクロロホルムで2回すすいでください。
   4. 100μLの脂質混合物を、DOPE:POPC:POPS = 2:1:1の質量比で準備します。この比率に基づき、V_DOPE50μL、V POPC25μL、V_POPS25μLを組み合わせます。計算された数値に従って対応する体積を測定します。ガラスの試管に入れてよく混ぜます。
   5. ガラス試験管を水浴に入れてクロロホルムの揮発を抑え、周囲温度を安定させます。
2. 脂質膜の製造
   1. クロロホルムを窒素ガスの穏やかな流れで蒸発させ、すべての液体が除去され、試験管の底に透明で均質なゲル状の膜が形成されます。
      注意:ガラス管の底部に均一で乾燥した脂質膜が見え、残留液滴がないことを確認してください。過剰な窒素流は泡を起こし、クロロホルムの完全な乾燥を妨げる可能性があるため避けてください。)
   2. 約2mLのn-ペンタンをガラスの試験管に滴りごとに加えます。その後、1.2.1で説明された窒素乾燥法で溶媒を蒸発させ、乾燥した透明な脂質膜を得る。n-ペンタンは化学的不活性性と有機溶媒との適合性からガラス試験管内で蒸発します。ガラスは多くのプラスチック実験器具に伴うプラスチックの浸出や劣化のリスクを避け、フィルム形成時の脂質純度を保ちます。
      注意:n-ペンタンは専用の試薬キャビネットに保管し、使用時は適切な個人用防護具を着用しながら排気フード内で慎重に取り扱う必要があります。
   3. 試験管のキャップを緩めて真空乾燥機に入れます。乾燥器を排出し、残留溶媒を除去するために真空状態で保温してください。乾燥器の底に自己表示シリカゲルを置いて水分を吸収します。
      注意:残留クロロホルムとN-ペンタンを蒸発して乾燥させ、フームフードで乾燥させます。
3. 脂質水和とストック溶液の調製
   1. 真空乾燥器から脂質膜を除去し、洗剤不使用低塩バッファー(LSB)250μLを加えて水和させます(補足表1)。これにより最終的な脂質濃度は10 mg/mLとなります。
      注:Task2はカリウムイオンチャネルであるため、カリイオンベースのバッファーを選択しました
   2. 脂質を再懸濁後、脂質を均等に4本のガラス管に分け、懸濁液を超音波処理して透明化し、リポソーム形成が成功したことを示すまで処理します(約1.5時間)。60%振幅でソニックを4秒オン、6秒オフのサイクルで行う。
   3. 精製脂質溶液をプールし、1.5mLを個別のマイクロ遠心分離機チューブに分割します。各チューブのヘッドスペースをすぐに窒素ガスで洗浄し、使用まで-80°Cで保存してください。

2. MSPの過剰発現と精製

1. MSPの原核生物的発現
   1. プラスミド形換え:MSP1D1プラスミドに7×Hesタグを搭載し、大 腸菌 BL21(DE3)のコンパテント細胞を形質転換します。形質転換混合物をカナマイシン(50 μg/mL)を含むLuria-Bertani(LB)寒天プレートにプレートし、37°Cで一晩培養して単一コロニーを得る。
   2. 培養増幅:単一のクローンを選び、カナマイシンを含むLB培地5mLに接種し、37°Cで一晩振って培養します。一晩培養を液体LB培地に1:100の比率で接種し、37°Cで振って600 nm(外径₆₀₀)での光学密度が2.0–3.0に達するまで増殖します。
   3. タンパク質発現誘導:イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度0.5–1 mMに添加してMSP発現を誘導します。16°Cで16〜20時間、振って培養を続けます。
2. 細胞破壊
   1. ペレット採取:細菌培養を4°Cで10分間遠心分離します。上清液を捨て、細胞ペレットを残します。
   2. 細菌溶解:1Lの培養から抽出したペレットを100〜150 mLの溶解バッファーに再懸浮させます(補足表1)。均一な懸液になり、塊が目立たないまで徹底的に均質化します。PMSFをサスペンションに加えてプロテアーゼを阻害し、泡立ちを減らしましょう。
   3. 超音波検査:冷蔵した超音波細胞破壊装置を使って細菌を分解します。出力を35%に設定し、3秒のパルスと6秒の停止を繰り返します。過熱を防ぐために、累積超音波検査時間15分ごとに2分間の休憩を設けてください。溶解液が透明で淡い茶色になるまで続けます。
   4. 補足:溶解液を30,000gで45分間45分遠心分離し、その後の工程のために上清液を採取します。
3. MSP精製
   1. Ni-NTA樹脂製剤:Ni-NTA樹脂3〜5 mLを取り、重力カラム(サイズ:26.4×134.8 mm)に詰めます。樹脂を蒸留水3カラム容量(CV)で洗浄し、ウォッシュバッファー1(補足表1)3CVで平衡させます。
   2. MSPの樹脂結合:細胞溶解液の遠心分離後、上清液と平衡状態のNi-NTA樹脂を混合します。最終濃度5 mMにイミダゾールを加え、4°Cで暗闇で優しく回転させながら2時間培養します。
   3. 不純物除去のための洗浄:洗浄バッファー1、洗浄バッファー2(補足表1)、ウォッシュバッファー3(補足表1)の勾配で、それぞれ少なくとも50mLを使い順に洗浄します。流路の280nm(A₂₈₀)でのUV吸収を監視し、A₂₈₀ 値が0.01を下回るまで洗い続けます。
   4. 洗脱:標的タンパク質を洗脱バッファー(補足表1)で洗脱し、洗出液の分割を収集します。洗脱プロセスを続け、溶出液のA₂₈₀が0.01を下回るまで分画を集め続けます。
   5. プロセスモニタリングと分析:上清液、沈殿液、フロースルー、洗浄分率、溶出分率などの主要な精製段階からサンプルを採取します。SDS-PAGEで解析し、精製効率を評価してください(補足図1)。
   6. バッファー交換のための透析:プールしたエリュートを透析チューブに移し、透析バッファー(補足表1)と共に4°Cで一晩優しくかき混ぜて透析します。
   7. 超ろ過と濃縮:透けろ過装置を用いて透析溶液を濃縮し、最終MSP濃度2〜5 mg/mLにします。精製・濃縮されたMSPは、現在、膜タンパク質ナノディスクの組み立てに使用可能となりました。

3. バイオビーズの活性化

1. 計量
   1. 分析用バランスを使って約250mgのバイオビーズを50mLの遠心分離機チューブに重さを量ります。
2. メタノール洗浄
   1. チューブにメタノールを25〜30mL加えます。暗闇で混合物を十分に回転させたり渦巻かせたりしてから、20分間孵化させます。培養後は上澄液を慎重に捨てます。
   2. このメタノール洗浄工程を合計3回繰り返します。
      注意:メタノールの揮発性のため、この処置は適切な個人用防護具を着用したフームフード内で行う必要があります。使用済みメタノールを回収し、生物廃棄物として処理してください。
3. 水性ウォッシュ
   1. ビーズに25〜30 mL ddH_2Oを加えます。チューブを振るか回転させて混ぜ、20分間培養します。
   2. 上清液は捨てる。この水洗いの手順を3回繰り返します。
4. LSBとの平衡
   1. ビーズに25〜30mLの洗剤フリーLSBを加えます。チューブを回転テーブルの上で振るか回転させて20分間混ぜて培養します。
   2. 上清液は捨てる。このLSB平衡ステップを3回繰り返してビーズを完全に調整します。
5. アリクオートと保管
   1. 活性化されたバイオビーズを1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブ3本に均等に分けます。少量のLSBでビーズを湿らせたままにしてください。
   2. チューブはアルミホイルで包んで光から守り、すぐに使えるように氷の上に保管してください。

4. ナノディスクの組み立て

1. 脂質とMSPの調製
   1. 脂質ストックの説明:あらかじめ準備された脂質ストックのアリコートを1つ取り出し、解凍します。すぐにチューブを7,000 x g で4°Cで5秒間遠心分離し、底部の内容物を集めます。
   2. 水浴で超音波処理を行い、過熱を防ぐために5〜10分ごとに透明度と温度を監視します。60%振幅で超音波処理を行います。脂質ストックを透明で透明になるまで超音波処理します。
   3. MSP解凍:準備済みMSP溶液の1アリコートを氷水浴で解凍します。
2. 化学量論比に従ってバッファーを準備します。
   1. 膜タンパク質の定量化:精製膜タンパク質(Task2)を0.025% DDM/0.005% CHSで分離し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で分離します。500μLのサンプルを、流量0.5 mL/minでSuperose 6 Increaseカラム(Cytiva)に注入します。14.8 mLで溶出したピークを採取し、濃縮します(図1)。ナノドロップを使ってタンパク質濃度を測定します。
   2. タンパク質モル量を計算する:標的膜タンパク質のモル量(n)を、式n = C × V(ここでCはモル濃度、Vは体積)を用いて計算します。
   3. MSPおよび脂質体積の決定:標的タンパク質のモル量論比に基づいてMSPおよび脂質ストック溶液の必要な体積を計算します:MSP : 脂質 = 1 : 5 : 250。
   4. マスターミックスの準備:計算結果に基づき、対応する脂質とMSPの体積を組み合わせて300μLのマスターミックスを準備します。
      注意:この混合物には洗剤が含まれており、タンパク質溶液中の濃度と一致し、早期凝集を防ぐために注意してください。
3. 洗剤除去とナノディスクの組み立て
   1. 再構成混合液を用いた初期培養:準備済み混合バッファー(補足表1)を氷の上で10分間培養します。その後、混合液50μLを濃縮タンパク質溶液にゆっくり加え、均一性を確保するためにピペッティングで優しく混ざります。
   2. タンパク質-脂質混合物の平衡:混合物を氷の上に1時間置きます。15分ごとにチューブを優しく逆さまにしてよく混ぜます。
   3. バイオビーズによる初回培養:混合物を7,000 x g で4°Cで5秒間短時間遠心分離し、チューブ底部のタンパク質溶液を採取します。事前に活性化されたバイオビーズを1アリコート取り、残留LSBを吸引し、タンパク質溶液をビーズに加え、暗闇で回転させて1時間培養し、標的タンパク質の光による分解を防ぎます。
   4. バイオビーズを用いた二次培養:混合物を7,000 x g で4°Cで5秒遠心分離し、上清液を2つ目のバイオビーズ(LSBも吸引したもの)に慎重に移し、暗闇で4〜8時間または一晩、やさしく逆回転させてよく混ぜます。
   5. バイオビーズによる最終培養:一晩の培養後にタンパク質溶液を回収し、短時間遠心分離機をかけて上澄液を事前活性化されたバイオビーズの3番目で最後の部分に移します。暗闇の中、4°Cで回転させて1時間培養します。
   6. 短時間の遠心分離後、上清液を清潔なマイクロ遠心分離機チューブに移し、17,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離機で凝集体を除去します。
      注意:使用済みバイオビーズは生物廃棄物として処分してください。
   7. ナノディスクの精製:ナノディスク-Task2複合体をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で精製します:500μLのサンプルを0.5 mL/minの流量でSuperose 6 Increaseカラムに注入し、15 mLで溶出したピークを収集します(図2)。
   8. 最終生成物の濃度:SEC洗脱のピーク分数をプールし、最終的なナノディスク-Task2濃度1.2–1.5 mg/mLに濃縮し、クライオEM試料の準備に適しています。

5. ナノディスクの組み立てが成功しているか確認する

1. SDS-PAGE分析:SEC精製分画からサンプルを抽出します。
   1. 12%SDS-PAGを用いてサンプルを分析し、主要成分(例:MSPやターゲット膜タンパク質)の存在を確認し、ナノディスク組み立ての成功を示します(図3)。
2. クライオEMサンプルの準備と分析。
   1. 成功裏に組み立てられたサンプルを最終濃度1.2〜1.5 mg/mLに濃縮し、クライオEMサンプルの準備を行います。
   2. まず、17,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。3μLの液滴を、新たにグロー放電されたクアンティフォイルR1.2/1.3金グリッド(300メッシュ、穴あきカーボン)に沈着させます。
   3. 湿度100%の4°Cで5秒間孵育します。Vitrobot Mark IVでグリッドを4秒点点し、液体窒素温度で液体エタンに浸して冷凍します。
   4. 300 kVで動作し、Falcon G4i直接電子検出器を搭載したTitan Krios G4クライオEMでEPUソフトウェアを用いて超高解像度の映画スタックを収集できます。
   5. 露光時間を2.78秒に設定し、これはピクセルサイズ0.73 Å(165k ×)と、EERの映画スタックあたり約50 e⁻/Ų の累積被量に対応します。

結果

脂質ストックの成功した調製は、超音波処理後に透明で透明な溶液が形成されることで示されました。MSPでは、ニッケル親和性クロマトグラフィーで約3 mg/mLの高純度生成物が得られました。ナノディスクの組み立てはSECによって確認され、特徴的な洗脱プロファイルが示されました(図2)。ナノディスク組み立て前に得られたTask2 SECプロファイル(図1)と比較して、タンパク質ピークは組み立て後により高い洗脱体積(後の洗脱)にシフトします。 図2に示すように、SECプロファイルは2つの主要なピークを示しています。組み立てナノディスク複合体は15.1 mLで溶出し、遊離MSPは18.0 mLで脱出します。組み立て効率はピーク面積を積分することで定量化しました。組み立て済みナノディスクピークの面積は147.2、遊離MSPピーク面積は31.5で、組み立て効率は82.4%(組み立てナノディスクピーク面積/総タンパク質ピーク面積で計算)に相当します。この定量的結果は、M...

ディスカッション

この方法は、洗剤除去を通じて洗剤で溶解した膜タンパク質をナノディスクに再構成し、より自然な脂質二重層環境を提供することを提案しています。この組立プロセスの成功は、いくつかの重要な要素にかかっています。その中でも特に重要なのは、膜タンパク質、MSP、脂質の化学量論的比率です。化学量論的比率が不適切な場合、タンパク質の凝集や組み立ての失敗を引き起こすことがあります。例えば、1:2:50の比率でナノディスクを組み立てる最初の試みでは、Task2の完全な集約が実現しました。したがって、化学量論比の最適化は成功する組み立てに不可欠です。脂質ストックの調製と適切なMSPの選択も同様に重要です。脂質組成は、自然の膜を模倣した均一で透明な溶液を形成するよう最適化されなければなりません。さらに、ナノディスク直径を決定するMSPバリアントの選択は、標的膜タンパク質のサイズに合わせて調整^{する必要があります。}タンパク質の直径より大きいナノディスクを生成するMSPを選ぶことは、その潜在的な立体構造的ダイナミクスを受け入れ安定させるために不可欠です。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バイオビーズ	バイオラッド	1523920
コレステリル・ヘミサシネート	アナトレース	第210章
クロロホルム	シノアエージェント		フームフードでの使用
すごい	アヴァンティ	850725P
メタノール	シノアエージェント
n-ドデシル-ベータ-D-マルトシド	アナトレース	D310
N-ペンタン	アダマス		フームフードでの使用
POPCは	アヴァンティ	850457P
ポップス	アヴァンティ	840034P
SEC	バイオラッド		正しい使用にはメーカーのプロトコルに従ってください
スネークスキン透析チューブ	熱力学	68011
スーパーローズ 6 インデュース10/300 GL	シチバ	29091596
超ろ過スピンカラム Amicon Ultra-15	ミリポール	UFC905008