フルクタス・ザンティイ エキスは軟骨の完全性を保つことで変形性関節症を緩和します

サマリー

本研究プロトコルは、統合的なマルチオミクス解析およびin vivo実験を通じて、Fructus Xanthii抽出物の変形性関節症における軟骨保護効果を体系的に調査することを目的と設計されました。

要約

変形性関節症(OA)は進行性の変性関節疾患であり、現在の薬理学的および外科的介入は主に症状の緩和にとどまっており、基礎的な病理学的変化を逆転させることはほとんどなく、新しい治療薬の緊急性を強調しています。このプロトコルは、 Fructus Xanthii 抽出物がOAに対して持つ軟骨保護効果の可能性を調査することを目的としました。まず、超高性能液体クロマトグラフィーと高分解能タンデム質量分析法(UHPLC-HRMS/MS)を用いて非標的メタボロミクスプロファイリングを行い、抽出物の化学成分を特性評価しました。ネットワーク薬理学とトランスクリプトミックマイニングを組み合わせた統合戦略を用いて、抽出物の生体活性成分および推定標的を特定し、OA関連の調節不全遺伝子との交差解析でコアターゲット遺伝子を得ました。遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析を行い、抽出物によって調節される主要な生物学的プロセスおよびシグナル伝達経路を注釈しました。in vivo 検証のために、ゼブラフィッシュ軟骨損傷モデルおよびマウスOAモデルを用いて抽出物の軟骨保護効果を評価しました。さらに、RNAシーケンシング(RNA-seq)が採用され、治療後の軟骨細胞におけるトランスクリプトム変化の解析に取り組み、OA関連経路や遺伝子発現プロファイルに焦点を当てました。その後、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を実施し、RNA-seqでスクリーニングされた主要タンパク質/受容体の発現レベルを検証し、 Fructus Xanthii 抽出物がコアOA標的に与える調節効果をさらに確認しました。この統合されたマルチオミクスおよび実験プロトコルは、 Fructus Xanthii 抽出物をOA介入の有望な植物候補として探求するための体系的なアプローチを提供します。

概要

変形性関節症(OA)は、関節軟骨の進行性劣化、軟骨下骨硬化症、滑膜炎症、骨形成を特徴とする変性関節疾患です^。グローバル・ブレデント・オブ・アズム(GBD)調査によると、1990年から2020年の間に204か国・地域でOAの有病率が着実に増加^{しており、この}傾向は世界の人口高齢化とともに加速すると予想されています^。現在の推計によると、世界中で2億5千万人以上が影響を受けており、個人の福祉、医療システム、社会経済的構造に大きな負担をかけています⁴。現在の治療法は主に症状緩和を目的としており、最も一般的な介入は非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)やヒアルロン酸(HA)を用いた関節内粘剤補給です。しかし、これらのアプローチは臨床的利益が限定的であり、かなりの副作用と関連しています^5,6。これは効果的な変形性関節症治療薬(DMOADs)の重要性を強調しています。

伝統中国医学(TCM)は、骨性関節症(OA)の管理に長く用いられてきました。これは「骨二」という「二重症候群」の亜型の概念^{に基づいています。}この枠組みでは、OAの病因は主に肝腎のエッセンス不足、気と血液の不足、そして風・寒・湿気による侵入に起因すると^{されています。}したがって、治療法は風湿気の除去、寒気の拡散、副次汚染の除去に焦点を当て^ます。中医学治療は、その多標的効果、良好な副作用プロファイル、臨床的に有意な有効性で知られています¹⁰。Buqi Tongluo Capsule(BQTL)やFuzi Decoction(FZD)などの注目すべき製剤は臨床で明確な抗OA効果を示しており、Du Huo Ji Sheng Tang(DHJST)はNLRP3インフラマソーム経路を抑制することでOA症状を緩和し、何世紀にもわたる実証的利用に裏付けられています。同様に、申進積雪混合物(SHM)はIL-1βやTNF-αなどの炎症促進メディエーターのダウンレギュレーションを通じて痛みや軟骨の変性を緩和^します。モノマーレベルでは、薬用植物由来のイカリイン(シアノサイドA、CyA)やエリアニンなどの化合物が、軟骨細胞の増殖を促進し、炎症性サイトカインの放出を抑制し、関節の恒常性を維持することが報告されています^14,15。TCMは総合的に、抗炎症、軟骨保護、症状緩和の特性を持つ包括的な治療アプローチを提供します。しかし、そのメカニズムの複雑さや標準化に関する課題から、継続的かつ厳密な研究が必要です。

Fructus Xanthii(コンポシタエ)の乾燥熟果実、通称「蒼二子」は、抗菌、抗炎症、抗酸化、鎮痛、抗腫瘍、免疫調節効果など幅広い薬理学的活性を示すことが記録されています¹⁶。フルクタス・ザンティイから単離されたフェノール酸は、関節リウマチ(RA)における滑膜過形成を効果的に減少させます¹⁷。その中でも、代表的なカフェオイルクニン酸誘導体であるクロロゲン酸(CGA)は、RANKL媒介の破骨細胞形成を抑制しつつ、骨芽細胞の増殖と分化を刺激し、骨格恒常性を維持することがわかっています¹⁸。同じ抽出物内で同定される他のフェノール酸、例えばネオクロロゲン酸(5-CQA)、クリプトクロロゲン酸(CCA)、プロトカテチ酸も抗菌、抗炎症、抗腫瘍、抗酸化特性を示します(19,20,21)。フェノール酸に加え、蒼二子に含まれるさまざまな二次代謝物がこれらの生物活性に寄与しています 16,20,22,23,24,25。しかし、フルクタス・ザンチイ抽出物のOAにおける正確な役割と基礎メカニズムは、依然としてほとんど解明されていません。

非ターゲット液状クロマトグラフィー-タンデム質量分析法(LC-MS/MS)メタボロミクスは、仮説なし、高スループット、そしてグローバルカバレッジ能力を特徴としています。これにより数千の代謝物特徴を同時に検出でき、代謝ネットワークの全景を把握し、事前標的指定なしで新規バイオマーカーや異常代謝経路の体系的発見を可能にします^26,27。高分解能質量分析技術と組み合わせることで、この手法は血清、滑液、尿、軟骨組織など様々な種類の生物学的サンプルの包括的解析に適しており、変形性関節症(OA)研究において顕著な利点を示しています。一方で、OAの病理進行に密接に関連する異なる代謝物(滑液や滑膜組織で同定される様々な代謝物クラスなど)を包括的にスクリーニングし、エネルギー代謝、軟骨修復、骨形成、脂質代謝などの主要経路にマッピングすることで、OAの病因の理解を深めます。一方で、トランスクリプトミクスやプロテオミクスなどのマルチオミクスデータを統合することで、代謝リプログラミングが軟骨変性、炎症反応、関節構造損傷に果たす役割を明らかにし、早期診断バイオマーカーの特定、疾患進行の評価、胆汁酸、トリプトファン、脂肪酸代謝の調節などの標的代謝介入戦略の開発に重要な証拠を提供し、その翻訳の可能性が強調されます。OAの精密タイピングと個別化治療に関する研究。

ゼブラフィッシュは複数の利点から優れたモデル生物として機能します。そのゲノムはヒトのゲノムと高度に保存されており、約70%のヒトタンパク質コード遺伝子と相同性を共有しています(^28,29)。急速な発育、体外受精、透明胚による生体内イメージングの便利性、高い繁殖率、低メンテナンスコスト(30,31,32,33)などの主要な特徴を示します。骨格研究において、ゼブラフィッシュは骨形成、石灰化過程、再生能力を明確に可視化し、骨粗鬆症や軟骨損傷などの病理的状態を模擬するために利用されます。しかし、関節軟骨の変性、滑膜炎症、軟骨下骨の変異を特徴とする複雑な全関節疾患である変形性関節症(OA)の研究においては、ゼブラフィッシュモデルの応用は比較的限定的です。

本記事では、UHPLC-HRMS/MSベースの非標的代謝学、ネットワーク薬理学、トランスクリプトミング、 および生体内 での実験検証を統合し、Xanthium sibiricum抽出物をOA介入の有効な植物候補として探るプロトコルを提示します。目的は、OAに関連するXanthium sibiricum抽出物のバイオアクティブ成分、潜在的標的、および多オミクス統合および計算解析を通じてコア調節経路を特定するだけでなく、 in vivo モデルを通じてOAに対する軟骨保護効果の検証や軟骨細胞トランスクリプトームにおける調節メカニズムのさらなる解明です。

プロトコル

臨床サンプルとマウスを対象としたすべての実験は、山東省医療バイオテクノロジー研究センター倫理審査委員会が承認したプロトコルに従って実施されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. ヒトの関節軟骨細胞の単離と培養

ヒトの関節軟骨標本は、山東第一医科大学第一附属病院で関節鏡手術または全関節置換術を受けた患者から採取されました。軟骨の断片は外科的切除から30分以内に氷の上で検査室に運ばれました。組織は氷のように冷たいドルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS;3〜5回洗浄)で徹底的に洗浄され、その後無菌外科用ハサミで約1 mm³ の断片に細かく刻まれました。順次酵素消化が行われ、まず37°Cで0.25%トリプシンEDTAを用いて30分間の前消化を行った。 消化過程は軟骨断片が薄くなり、サイズが小さくなり、透明になるまで監視され、その後、室温で遠心分離(200 × g、5分)で軟骨片を採取しました。その後、0.2%のII型コラーゲナーゼを持続的な穏やかな攪拌のもとで8時間、37°Cで一晩消化しました。消化過程は、肉眼的に見える軟骨断片が完全に溶解するまで監視されました。放出された細胞は室温で遠心分離(200 × g、5分)で採取され、完全なDMEMに再懸濁され、10%胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシンを補足して、75 cm² 培養フラスコにシードされました。細胞は5%の_CO2を含む加湿大気中、37°Cで維持されました。接着した軟骨細胞は0.25%のトリプシン-EDTAを用いて剥離し、結合細胞が培養フラスコ表面の80%の合流点に達した時点で細胞は1:3の比率でサブ培養されました。

2. フルクタス・ザンティイ抽出物の製剤

Xanthium strumarium L.(Fructus Xanthii)の乾燥熟果実は、華北の自然分布集団から採取され、上級薬理学者によって鑑定されました。標本は山東第一医科大学の標本館に収蔵されました。20gの細かい粉末状のフルクトゥス・ザンティを抽出指ぬきに入れ、95%エタノール(約250 mL)を用いて徹底的なソックスレット抽出を行い、7〜8回のサイフォンサイクルが完了しました。エタノリック抽出物はろ過され、ろ過液はロータリーエバポレーターを用いて45°Cの低圧で乾燥まで濃縮されました。得られた残渣は60 mLの二重蒸留水に再懸浮し、分離漏斗で60 mLの酢酸エチルと順次分配されました。混合物は激しく振られ、4°Cで24時間の位相分離が行われました。水層は収集され、凍結乾燥され、−80°Cで保存され、さらに使用されました。

3. 非標的型LC-MS/MSメタボロミクスの標準化されたワークフロー

1. UHPLC-HRMS/MSベースの非標的メタボロミクス解析
   非標的メタボロミクスプロファイリングは、超高性能液体クロマトグラフィー・高分解能タンデム質量分析(UHPLC-HRMS/MS)プラットフォーム上で実施されました。代謝物は冷却されたメタノール水系を用いて急速に焼入れ・抽出されました。クロマトグラフィー分離は、40°Cで維持されたC18/T3クロマトグラフィーカラム(100 × 2.1 mm、1.8 μm)を備えたUHPLCシステムで達成されました。 0.3mL/minの流量で0.1%の甲酸(A)と0.1%のアセトニトリル(B)からなる二元勾配(0–28分)を適用しました。質量分析検出は、極性切り替え可能な全MS2(フルMS/dd-MS2)モードで動作するハイブリッド四重柱オービトラップ機器で行われ、全走査範囲はm/z70–1,050、解像度は120,000(FWHM、m/z 200)でした。高エネルギー衝突解離(HCD)断片化は20、40、60 eVで行われ、動的排除は10秒に設定されました。
2. 生データはProteoWizardを使ってmzXML形式に変換されました。ピークピッキング、保持時間アライメント、脱同位体化は、HRMS最適化パラメータ(ppm = 5, bw = 5, snthresh = 6)を用いてXCMS Online上で実施されました。サンプル間で50%以上の欠損値を持つ特徴は除外し、残りのピーク領域は総イオン電流(TIC)に正規化されました。代謝物は、正確な質量、MS2スペクトル、保持時間を社内のリファレンスライブラリと照合し、質量誤差許容度≤5 ppm、ドット積スコア閾値≥80を用いて注釈付けしました。
   注:ワークフロー全体を通じて厳格な標準作業手順が守られました。サンプルは採取直後に液体窒素(−80°C)でスナップ冷凍され、ドライアイスチェーンで輸送され、ランダム抽出、注入、バッチ処理の手順で処理されました。計器ドリフトを監視するために、10サンプルごとにプール品質管理(QC)サンプルを挿入しました。

4. ネットワーク薬理学解析

1. ネットワーク薬理学に基づく有効成分スクリーニングとターゲット予測
   フルクタス・ザンティイの有効成分はTCMIDデータベース(https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php)およびHERBデータベース(http://herb.ac.cn/)から取得されました。回収された化合物は、推奨されるADME閾値である経口バイオアバリアフリー≥30%および薬剤類似度≥0.18に基づいてろ過されました。適格化合物の予測されるヒト標的は、2つのデータベースから得られました。スクリーニング結果を収集・整合し、Fructus Xanthiiに関連する15種類の有効化合物と151のユニークなタンパク質標的を特定しました。
2. トランスクリプトミックデータの統合およびOA関連コアターゲットの同定
   正常ながんと変形性関節症(OA)サンプルの間の軟骨組織における差異発現遺伝子(DEGs)をGEO2Rウェブツール(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)を用いて、GEOデータベースのデータセットGSE51588(n=5正常、6/OA)およびGSE169077(n=10、OA40)から抽出しました。OAアップレギュレーション遺伝子は、log2フォールド変化>0.5および調整 p値<0.05の基準を用いて定義されました。OAアップレギュレーション遺伝子と151の Fructus Xanthii関連タンパク質標的との交差点は、Rパッケージのggvennを用いて可視化されました。交差標的のタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークはSTRINGデータベース(https://string-db.org/)を用いて構築されました。PPIネットワークデータはCytoscapeにインポートされ、上位10のハブ遺伝子はMCCアルゴリズムを用いたCytoHubbaプラグインを用いて機能的濃縮解析のためにスクリーニングされました。

5. ゼブラフィッシュにおける最大許容濃度(MTC)の決定

受精後2日目(2 dpf)のトランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫(Tg col2a1a:EGFP)は、1ウェルあたり30頭の密度で6ウェルのプレートにランダムに配布されました。各ウェルには連続的に希釈された フルクタス・ザンティエ キスを含む3mLの曝露培地が補足されました。死亡状態の幼虫や死亡した幼虫は毎日除去されました。幼虫は28°Cで72時間連続曝露され、その後最大耐受濃度(MTC)が幼虫死亡率10%を超えない最高濃度と決定されました。

6. ゼブラフィッシュ骨損傷モデルの確立

Tg col2a1a:受精後2日(2 dpf)時点でEGFPゼブラフィッシュ幼虫は、対照群、モデル群、コンドロイチン硫酸(CS)陽性対照群、 フルクタス・ザンティ抽出 物処理群の4群に割り当てられました。対照群を除くすべてのグループは、骨損傷を誘発するために24時間にわたり黄色 ブドウ球 菌(OD600 = 0.8、1 ×^{10 8} CFU/mL)にさらされました。モデル確立に成功したことは、エピ蛍光顕微鏡下で対照群に比べて頭蓋顔面領域における軟骨特異的な緑色蛍光強度が少なくとも50%減少していることを確認しました。

7. ゼブラフィッシュ幼虫における軟骨特異的蛍光の定量的評価

幼虫は、28°Cで72時間にわたり、段階的に濃度の フルクタス・ザンティ抽出 物または1,000 μg/mLのコンドロイチン硫酸ナトリウム(陽性対照)にさらされました。その後、6ウェルの複製ごとに10匹の幼虫が無作為に選ばれました(グループあたりn=30匹)。選ばれた幼虫は0.016%のトリカインで麻酔され、1%の低融点アガロースパッドに横置きされました。蛍光画像は蛍光カメラを搭載した立体顕微鏡を用いて、2×倍率(励起488 nm、放出525/50 nm)で取得されました。頭蓋顔面領域における軟骨特異的なEGFP強度(セラトヒアルおよびメッケル軟骨を含む)は、画像解析ソフトウェアを用いて定量化されました。統合密度値に対して背景補正を行い、補正値は軟骨保護効果の統計解析のために対照群に正規化されました。

8. C57BL/6JマウスにおけるOA誘導

雄のC57BL/6Jマウス(生後6〜8週、体重20〜22g)は、特定の病原体フリー(SPF)条件下で22°C±2°C、12時間の明暗サイクルで飼育されました。マウスは1週間の順応を許され、その後ランダムな3グループ(n=8名)にランダムに割り当てられました。(1)偽操作対照群、(2)ACLT誘発性OA(ACLT)、(3)ACLTとフルクタス・ザンティイ抽出物介入(ACLT + フルクタス・ザンティ抽出 物)。すべての手術は、事前に検証されたプロトコルに従い、無菌状態で行われました。

マウスは機関承認プロトコルに従い腹膜内ナトリウムペントバルビタール(50 mg/kg)で麻酔され、右膝関節包を露出させるために内側膝蓋側切開が行われました。前十字靭帯は手術顕微鏡で切断され関節不安定性を誘発し、その後関節包と皮膚を6-0吸収性縫合糸で層状に閉じました。偽手術マウスは靭帯切断なしで同じ関節切開術を受けました。関節の安定性が評価され、モデル群マウスの組織学的断片における関節損傷の程度をドロワーテストまたは評価することで、モデル確立の成功が確認されました。

術後鎮痛はブプレノルフィン(0.1 mg/kg、皮下注射)を3日間連続で投与しました。治療薬は1日1回ガヴェージで投与されました。ACLT+ フルクタス・ザンチエ キス群は、100μLの1,000 μg/mLのフル クタス・ザンチイ 抽出物を生理食塩水で希釈したものを投与し、他の2つのグループは100 μLの生理食塩水をビクレット対照群として投与しました。手術後8週間で、マウスは_CO2 窒息による安楽死と頸椎脱臼を行い、膝関節を組織学的解析のために採取しました。

9. 組織病理学的染色

1. 膝関節組織の組織学的準備と染色
   手術後の膝関節は術後8週に 一括 切除され、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を4°Cで48時間固定しました。固定された関節は10%エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA;pH 7.4)で14日間脱灰され、段階的なエタノール系列で脱水され、パラフィンに埋め込まれました。埋め込み関節から連続矢状切片(5μm)を準備し、以下の組織学的染色手順を実施しました。
   1. ヘマトキシリンと嗜酸(H&E)染色
      ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行い、一般的な組織構造、軟骨の完全性、滑膜過形成の評価を行いました。
   2. サフランイン-O/ファストグリーン染色
      軟骨組織内のプロテオグリカン検出のためにサフラニン-O/Fast Green染色が行われました。染色された断片はデジタルカメラを搭載した光学顕微鏡で調べられ、10×倍率と20×倍率で画像が撮影されました。
2. OARSIに基づく軟骨変性の半定量的スコアリング
   軟骨変性の半定量的評価のために、染色切片は後ろ向きに再評価され、国際変形性関節症研究学会の軟骨組織病理評価システムに従って評価されました。このシステムは、関節軟骨変性の等級(0–6、軟骨喪失の程度)およびステージ(0–4:損傷の空間的分布)に基づいて軟骨損傷の重症度を評価します。
   すべての評価に対して事後盲検戦略が採用されました。すべてのセクションは元のグループラベルを外し、匿名のシリアル番号で再コード化されました。経験豊富な病理医2名がグループ分けの知識なしに独立して切片を採点しました。両グループのスコアリング結果間で相互検証が行われました。スコア差が≥1となった場合、不一致の切片は2人の病理医によって共同で再評価され、合意スコアが確立されました。最終的なコンセンサススコアは、組織病理学的結果の客観性、堅牢性、再現性を確保するために、その後の統計解析に用いられました。

10. RNAシーケンス(RNA-seq)

一次ヒト関節軟骨細胞(通路2–3)は、1ウェルあたり5×10個⁵ 細胞の密度で6ウェルプレートにシードされました。細胞は24時間血清不足状態にされ、その後2つのグループに分けられました(各グループにn=3名)、(1)対照群:細胞は載体のみで処理され(0.1% DMSO)、(2) フルクタス・ザンチイ 抽出群:細胞はDMSOに溶けた1,000 μg/mLの フルクタス・ザンチイ 抽出物で処理された。
細胞は24時間処理され、その後製造元のプロトコルに従いTRIzol試薬を用いて全RNAを抽出しました。RNA完全性(RIN ≥7.0)および濃度はRNAアナライザーを用いて評価されました。鎖特異的cDNAライブラリーはRNAシーケンシングライブラリー調製キットを用いて製製され、高スループットの次世代シーケンシング(NGS)プラットフォーム上でペアエンド150 bp(PE150)モードでシーケンスされました。生のFASTQファイルの品質管理はFastQCで行われ、その後アダプターとTrimmomaticによる品質トリミングが行われ、その後下流解析に至りました。

11. RNA-seqデータ処理

Fructus Xanthii抽出物によってダウンレギュレーションされた差異発現遺伝子(対照群と比較;p < 0.05およびlogFC<−0.5)をRNA-seqデータセットから抽出し、上位10のハブターゲットと交差させました。得られたFructus Xanthii抽出物および変形性関節症に関連するコア標的はggvennパッケージを用いて可視化されました。

12. エリサ

2–3番通路の一次ヒト関節軟骨細胞は、6ウェルプレートに5個×10個⁵ 細胞の密度でシードされました。細胞は血清を含まない培地で24時間培養し、静止状態を誘導しました。その後、細胞は以下の3つのグループに分けられました(各グループにn=3個):
(1) ブランクコントロール:細胞は保体(0.1% DMSO)のみで処理;(2) 陽性対照:細胞炎症をIL-1βで誘導し、その後車両(0.1% DMSO)による治療を行った;(3) フルクタス・ザンチイ 抽出群:IL-1βで細胞炎症を誘発し、その後0.1% DMSOに溶解した1000 μg/mLのフルクタス・ザンチイ抽出物で処理した。細胞培養上清液は24時間の培養後に採取され、−80°Cで保存され使用されました。培養上清液中のMMP1およびPGRのレベルは、それぞれヒトMMP1およびPGR特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを用いて測定されました。検査は製造元の指示に従って行われました。

13. 統計解析

すべての統計解析は統計解析およびグラフ作成ソフトウェアを用いて行われ、データは平均±標準偏差(SD)として提示されました。データの正規性はシャピロ–ウィルク検定を用いて評価し、均等分散性はレヴェーン検定で評価されました。グループ間比較は、一方または双方向分散分析(ANOVA)を用いて行われ、その後、必要に応じてTukey検定またはŠidákの事後検定が行われました。ペアワイズ比較は二尾の学生t検定を用いて行われました。ノンパラメトリックデータはマン・ホイットニーU検定を用いて解析されました。両側P値<0.05は統計的に有意とされました。

結果

非標的LC-MS/MSデータの質的評価と代謝的状況

QCサンプルは優れた再現性を示し、正イオンモードと負イオンモードの両方で高度に重なり合うTICクロマトグラムが示され、分析バッチ全体で保持時間ドリフトは0.05分未満に保たれました。生データはXCMSベースの前処理を受け、ピーク検出、積分、保持時間のアライメントが含まれていました。推定代謝物は、正確な質量(≤5 ppm)、同位体パターン、高品質なMS/MSスペクトルを社内のスペクトルライブラリと照合して注釈付けしました。厳密なフィルタリングとTIC正規化の結果、正イオンモードと負イオンモードでそれぞれ2,179件と1,291件の信頼できる特徴が保持され、後の化学計解析のための定量マトリックスが形成されました。

フルクタス・ザンティイ抽出物の化学組成

植物化学的プロファイリングにより、フェノール酸、リグナン、セスキテルペノイド、フラボノイ...

ディスカッション

OAは一般的な変性関節疾患であり、世界的に障害の主な原因の一つ^です。その病因は複雑かつ多因子的であり、関節組織全体にわたる生化学的、細胞的、分子的変化を伴います。かつては関節軟骨の単純な「摩耗」現象と考えられていましたが、現在では軟骨の劣化、滑膜炎症、骨組織形成、軟骨下骨の再構築を特徴とする慢性的な関節全体疾患として広く認識されています 37,38,39。増え続ける証拠は、炎症がOAの病態生理において中心的役割を果たしていることを強調しており、滑膜、軟骨、軟骨下骨から産生される炎症性メディエーターが軟骨の分解と密接に関連している^40,41。世界の疫学データによると、2020年には約5億9500万人がOAの影響を受けており、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4% PFA	Biosharp, China	BL539A	pH 7.4, sterile
C57BL/6 Mice	Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd, China	N/A	Male, 8-10 weeks old, 20-25g
Chondroitin sulfate	MCE, America	HY-B2162	Purity ≥98%
ClusterProfiler (R Package)	Bioconductor	Free access	Integrated in R v4.2.2
Collagenase, Type II, powder	Gibco, America	17101015	≥125 U/mg
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Free access (https://cytoscape.org/)	v3.9.1 (with CytoHubba)
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Free access	Version 3.9.1
DESeq2 (R Package)	Bioconductor	Free access	Integrated in R v4.2.2
DMEM, high glucose	Gibco, America	11965092	Sterile medium
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China	10009218	Analytical grade, 95%
Ethyl acetate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China	10009418	Analytical grade
Fetal bovine serum (FBS)	Cellmax, China	SA102.02	Heat-inactivated
Fluorescence Microscope	Nikon, Japan	Eclipse Ti2-U	Equipped with GFP filter (488nm excitation) & digital camera
GEO Database	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r	GEO2R analysis tool
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC, America	Commercial	Version 9.5.1
Hematoxylin-Eosin(HE) Stain Kit	Solarbio, China	G1120	Ready-to-use kit
HERB Database	Chinese Academy of Sciences	http://herb.ac.cn/	V2.0
Human MMP-1 ELISA Kit	Yamei Biotechnology, China	HJ088	For human, 96-well plate
Human Progesterone Receptor (PR) ELISA Kit	Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., China	ml05997	For human, 96-well plate
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	Free access	Version 1.53t
Light Microscope	Olympus, Japan	BX53	10×/20× objectives & digital camera
Lyophilizer	Christ, Germany	Alpha 1-4 LDplus	Freeze-drying system
Modified Saffron-O And Fast Green Stain Kit	Solarbio, China	G1371	For bone/cartilage staining
Neutral Balsam	Solarbio, China	G8590	Mounting medium
Penicillin-Streptomycin	Gibco, America	15070063	100×, sterile
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sparkjade, China	CR0013-500ML	pH 7.2-7.4, sterile
R software	R Foundation for Statistical Computing	Free access (https://www.r-project.org/)	v4.4.1 (with ggvenn)
Serum-free Cell Freezing Medium	Biosharp, China	BL203B	Sterile
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 25923	Standard strain
STRING Database	STRING Consortium	https://string-db.org/	Protein interaction analysis
TCMID Database	Shaanxi Qinling Qiyao Collaborative Innovation Center	https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php	V3.0
Tg(col2a1a:EGFP) Zebrafish	Zebrafish International Resource Center (ZIRC)	N/A	Larvae (2 dpf), AB strain
TRIzol Reagent	Thermo Fisher, America	15596018CN	For total RNA extraction
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco, America	25200056	Sterile solution
Ultra-high Performance Liquid Chromatography (UHPLC)	Thermo Fisher, America	Q Exactive Focus	Coupled with HRMS/MS
XCMS-online	Scripps Research Institute	Free access	Web-based platform