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臨床サンプルとマウスを対象としたすべての実験は、山東省医療バイオテクノロジー研究センター倫理審査委員会が承認したプロトコルに従って実施されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. ヒトの関節軟骨細胞の単離と培養
ヒトの関節軟骨標本は、山東第一医科大学第一附属病院で関節鏡手術または全関節置換術を受けた患者から採取されました。軟骨の断片は外科的切除から30分以内に氷の上で検査室に運ばれました。組織は氷のように冷たいドルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS;3〜5回洗浄)で徹底的に洗浄され、その後無菌外科用ハサミで約1 mm3 の断片に細かく刻まれました。順次酵素消化が行われ、まず37°Cで0.25%トリプシンEDTAを用いて30分間の前消化を行った。 消化過程は軟骨断片が薄くなり、サイズが小さくなり、透明になるまで監視され、その後、室温で遠心分離(200 × g、5分)で軟骨片を採取しました。その後、0.2%のII型コラーゲナーゼを持続的な穏やかな攪拌のもとで8時間、37°Cで一晩消化しました。消化過程は、肉眼的に見える軟骨断片が完全に溶解するまで監視されました。放出された細胞は室温で遠心分離(200 × g、5分)で採取され、完全なDMEMに再懸濁され、10%胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシンを補足して、75 cm2 培養フラスコにシードされました。細胞は5%のCO2を含む加湿大気中、37°Cで維持されました。接着した軟骨細胞は0.25%のトリプシン-EDTAを用いて剥離し、結合細胞が培養フラスコ表面の80%の合流点に達した時点で細胞は1:3の比率でサブ培養されました。
2. フルクタス・ザンティイ抽出物の製剤
Xanthium strumarium L.(Fructus Xanthii)の乾燥熟果実は、華北の自然分布集団から採取され、上級薬理学者によって鑑定されました。標本は山東第一医科大学の標本館に収蔵されました。20gの細かい粉末状のフルクトゥス・ザンティを抽出指ぬきに入れ、95%エタノール(約250 mL)を用いて徹底的なソックスレット抽出を行い、7〜8回のサイフォンサイクルが完了しました。エタノリック抽出物はろ過され、ろ過液はロータリーエバポレーターを用いて45°Cの低圧で乾燥まで濃縮されました。得られた残渣は60 mLの二重蒸留水に再懸浮し、分離漏斗で60 mLの酢酸エチルと順次分配されました。混合物は激しく振られ、4°Cで24時間の位相分離が行われました。水層は収集され、凍結乾燥され、−80°Cで保存され、さらに使用されました。
3. 非標的型LC-MS/MSメタボロミクスの標準化されたワークフロー
- UHPLC-HRMS/MSベースの非標的メタボロミクス解析
非標的メタボロミクスプロファイリングは、超高性能液体クロマトグラフィー・高分解能タンデム質量分析(UHPLC-HRMS/MS)プラットフォーム上で実施されました。代謝物は冷却されたメタノール水系を用いて急速に焼入れ・抽出されました。クロマトグラフィー分離は、40°Cで維持されたC18/T3クロマトグラフィーカラム(100 × 2.1 mm、1.8 μm)を備えたUHPLCシステムで達成されました。 0.3mL/minの流量で0.1%の甲酸(A)と0.1%のアセトニトリル(B)からなる二元勾配(0–28分)を適用しました。質量分析検出は、極性切り替え可能な全MS2(フルMS/dd-MS2)モードで動作するハイブリッド四重柱オービトラップ機器で行われ、全走査範囲はm/z70–1,050、解像度は120,000(FWHM、m/z 200)でした。高エネルギー衝突解離(HCD)断片化は20、40、60 eVで行われ、動的排除は10秒に設定されました。
- 生データはProteoWizardを使ってmzXML形式に変換されました。ピークピッキング、保持時間アライメント、脱同位体化は、HRMS最適化パラメータ(ppm = 5, bw = 5, snthresh = 6)を用いてXCMS Online上で実施されました。サンプル間で50%以上の欠損値を持つ特徴は除外し、残りのピーク領域は総イオン電流(TIC)に正規化されました。代謝物は、正確な質量、MS2スペクトル、保持時間を社内のリファレンスライブラリと照合し、質量誤差許容度≤5 ppm、ドット積スコア閾値≥80を用いて注釈付けしました。
注:ワークフロー全体を通じて厳格な標準作業手順が守られました。サンプルは採取直後に液体窒素(−80°C)でスナップ冷凍され、ドライアイスチェーンで輸送され、ランダム抽出、注入、バッチ処理の手順で処理されました。計器ドリフトを監視するために、10サンプルごとにプール品質管理(QC)サンプルを挿入しました。
4. ネットワーク薬理学解析
- ネットワーク薬理学に基づく有効成分スクリーニングとターゲット予測
フルクタス・ザンティイの有効成分はTCMIDデータベース(https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php)およびHERBデータベース(http://herb.ac.cn/)から取得されました。回収された化合物は、推奨されるADME閾値である経口バイオアバリアフリー≥30%および薬剤類似度≥0.18に基づいてろ過されました。適格化合物の予測されるヒト標的は、2つのデータベースから得られました。スクリーニング結果を収集・整合し、Fructus Xanthiiに関連する15種類の有効化合物と151のユニークなタンパク質標的を特定しました。
- トランスクリプトミックデータの統合およびOA関連コアターゲットの同定
正常ながんと変形性関節症(OA)サンプルの間の軟骨組織における差異発現遺伝子(DEGs)をGEO2Rウェブツール(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)を用いて、GEOデータベースのデータセットGSE51588(n=5正常、6/OA)およびGSE169077(n=10、OA40)から抽出しました。OAアップレギュレーション遺伝子は、log2フォールド変化>0.5および調整 p値<0.05の基準を用いて定義されました。OAアップレギュレーション遺伝子と151の Fructus Xanthii関連タンパク質標的との交差点は、Rパッケージのggvennを用いて可視化されました。交差標的のタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークはSTRINGデータベース(https://string-db.org/)を用いて構築されました。PPIネットワークデータはCytoscapeにインポートされ、上位10のハブ遺伝子はMCCアルゴリズムを用いたCytoHubbaプラグインを用いて機能的濃縮解析のためにスクリーニングされました。
5. ゼブラフィッシュにおける最大許容濃度(MTC)の決定
受精後2日目(2 dpf)のトランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫(Tg col2a1a:EGFP)は、1ウェルあたり30頭の密度で6ウェルのプレートにランダムに配布されました。各ウェルには連続的に希釈された フルクタス・ザンティエ キスを含む3mLの曝露培地が補足されました。死亡状態の幼虫や死亡した幼虫は毎日除去されました。幼虫は28°Cで72時間連続曝露され、その後最大耐受濃度(MTC)が幼虫死亡率10%を超えない最高濃度と決定されました。
6. ゼブラフィッシュ骨損傷モデルの確立
Tg col2a1a:受精後2日(2 dpf)時点でEGFPゼブラフィッシュ幼虫は、対照群、モデル群、コンドロイチン硫酸(CS)陽性対照群、 フルクタス・ザンティ抽出 物処理群の4群に割り当てられました。対照群を除くすべてのグループは、骨損傷を誘発するために24時間にわたり黄色 ブドウ球 菌(OD600 = 0.8、1 ×10 8 CFU/mL)にさらされました。モデル確立に成功したことは、エピ蛍光顕微鏡下で対照群に比べて頭蓋顔面領域における軟骨特異的な緑色蛍光強度が少なくとも50%減少していることを確認しました。
7. ゼブラフィッシュ幼虫における軟骨特異的蛍光の定量的評価
幼虫は、28°Cで72時間にわたり、段階的に濃度の フルクタス・ザンティ抽出 物または1,000 μg/mLのコンドロイチン硫酸ナトリウム(陽性対照)にさらされました。その後、6ウェルの複製ごとに10匹の幼虫が無作為に選ばれました(グループあたりn=30匹)。選ばれた幼虫は0.016%のトリカインで麻酔され、1%の低融点アガロースパッドに横置きされました。蛍光画像は蛍光カメラを搭載した立体顕微鏡を用いて、2×倍率(励起488 nm、放出525/50 nm)で取得されました。頭蓋顔面領域における軟骨特異的なEGFP強度(セラトヒアルおよびメッケル軟骨を含む)は、画像解析ソフトウェアを用いて定量化されました。統合密度値に対して背景補正を行い、補正値は軟骨保護効果の統計解析のために対照群に正規化されました。
8. C57BL/6JマウスにおけるOA誘導
雄のC57BL/6Jマウス(生後6〜8週、体重20〜22g)は、特定の病原体フリー(SPF)条件下で22°C±2°C、12時間の明暗サイクルで飼育されました。マウスは1週間の順応を許され、その後ランダムな3グループ(n=8名)にランダムに割り当てられました。(1)偽操作対照群、(2)ACLT誘発性OA(ACLT)、(3)ACLTとフルクタス・ザンティイ抽出物介入(ACLT + フルクタス・ザンティ抽出 物)。すべての手術は、事前に検証されたプロトコルに従い、無菌状態で行われました。
マウスは機関承認プロトコルに従い腹膜内ナトリウムペントバルビタール(50 mg/kg)で麻酔され、右膝関節包を露出させるために内側膝蓋側切開が行われました。前十字靭帯は手術顕微鏡で切断され関節不安定性を誘発し、その後関節包と皮膚を6-0吸収性縫合糸で層状に閉じました。偽手術マウスは靭帯切断なしで同じ関節切開術を受けました。関節の安定性が評価され、モデル群マウスの組織学的断片における関節損傷の程度をドロワーテストまたは評価することで、モデル確立の成功が確認されました。
術後鎮痛はブプレノルフィン(0.1 mg/kg、皮下注射)を3日間連続で投与しました。治療薬は1日1回ガヴェージで投与されました。ACLT+ フルクタス・ザンチエ キス群は、100μLの1,000 μg/mLのフル クタス・ザンチイ 抽出物を生理食塩水で希釈したものを投与し、他の2つのグループは100 μLの生理食塩水をビクレット対照群として投与しました。手術後8週間で、マウスはCO2 窒息による安楽死と頸椎脱臼を行い、膝関節を組織学的解析のために採取しました。
9. 組織病理学的染色
- 膝関節組織の組織学的準備と染色
手術後の膝関節は術後8週に 一括 切除され、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を4°Cで48時間固定しました。固定された関節は10%エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA;pH 7.4)で14日間脱灰され、段階的なエタノール系列で脱水され、パラフィンに埋め込まれました。埋め込み関節から連続矢状切片(5μm)を準備し、以下の組織学的染色手順を実施しました。
- ヘマトキシリンと嗜酸(H&E)染色
ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行い、一般的な組織構造、軟骨の完全性、滑膜過形成の評価を行いました。
- サフランイン-O/ファストグリーン染色
軟骨組織内のプロテオグリカン検出のためにサフラニン-O/Fast Green染色が行われました。染色された断片はデジタルカメラを搭載した光学顕微鏡で調べられ、10×倍率と20×倍率で画像が撮影されました。
- OARSIに基づく軟骨変性の半定量的スコアリング
軟骨変性の半定量的評価のために、染色切片は後ろ向きに再評価され、国際変形性関節症研究学会の軟骨組織病理評価システムに従って評価されました。このシステムは、関節軟骨変性の等級(0–6、軟骨喪失の程度)およびステージ(0–4:損傷の空間的分布)に基づいて軟骨損傷の重症度を評価します。
すべての評価に対して事後盲検戦略が採用されました。すべてのセクションは元のグループラベルを外し、匿名のシリアル番号で再コード化されました。経験豊富な病理医2名がグループ分けの知識なしに独立して切片を採点しました。両グループのスコアリング結果間で相互検証が行われました。スコア差が≥1となった場合、不一致の切片は2人の病理医によって共同で再評価され、合意スコアが確立されました。最終的なコンセンサススコアは、組織病理学的結果の客観性、堅牢性、再現性を確保するために、その後の統計解析に用いられました。
10. RNAシーケンス(RNA-seq)
一次ヒト関節軟骨細胞(通路2–3)は、1ウェルあたり5×10個5 細胞の密度で6ウェルプレートにシードされました。細胞は24時間血清不足状態にされ、その後2つのグループに分けられました(各グループにn=3名)、(1)対照群:細胞は載体のみで処理され(0.1% DMSO)、(2) フルクタス・ザンチイ 抽出群:細胞はDMSOに溶けた1,000 μg/mLの フルクタス・ザンチイ 抽出物で処理された。
細胞は24時間処理され、その後製造元のプロトコルに従いTRIzol試薬を用いて全RNAを抽出しました。RNA完全性(RIN ≥7.0)および濃度はRNAアナライザーを用いて評価されました。鎖特異的cDNAライブラリーはRNAシーケンシングライブラリー調製キットを用いて製製され、高スループットの次世代シーケンシング(NGS)プラットフォーム上でペアエンド150 bp(PE150)モードでシーケンスされました。生のFASTQファイルの品質管理はFastQCで行われ、その後アダプターとTrimmomaticによる品質トリミングが行われ、その後下流解析に至りました。
11. RNA-seqデータ処理
Fructus Xanthii抽出物によってダウンレギュレーションされた差異発現遺伝子(対照群と比較;p < 0.05およびlogFC<−0.5)をRNA-seqデータセットから抽出し、上位10のハブターゲットと交差させました。得られたFructus Xanthii抽出物および変形性関節症に関連するコア標的はggvennパッケージを用いて可視化されました。
12. エリサ
2–3番通路の一次ヒト関節軟骨細胞は、6ウェルプレートに5個×10個5 細胞の密度でシードされました。細胞は血清を含まない培地で24時間培養し、静止状態を誘導しました。その後、細胞は以下の3つのグループに分けられました(各グループにn=3個):
(1) ブランクコントロール:細胞は保体(0.1% DMSO)のみで処理;(2) 陽性対照:細胞炎症をIL-1βで誘導し、その後車両(0.1% DMSO)による治療を行った;(3) フルクタス・ザンチイ 抽出群:IL-1βで細胞炎症を誘発し、その後0.1% DMSOに溶解した1000 μg/mLのフルクタス・ザンチイ抽出物で処理した。細胞培養上清液は24時間の培養後に採取され、−80°Cで保存され使用されました。培養上清液中のMMP1およびPGRのレベルは、それぞれヒトMMP1およびPGR特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを用いて測定されました。検査は製造元の指示に従って行われました。
13. 統計解析
すべての統計解析は統計解析およびグラフ作成ソフトウェアを用いて行われ、データは平均±標準偏差(SD)として提示されました。データの正規性はシャピロ–ウィルク検定を用いて評価し、均等分散性はレヴェーン検定で評価されました。グループ間比較は、一方または双方向分散分析(ANOVA)を用いて行われ、その後、必要に応じてTukey検定またはŠidákの事後検定が行われました。ペアワイズ比較は二尾の学生t検定を用いて行われました。ノンパラメトリックデータはマン・ホイットニーU検定を用いて解析されました。両側P値<0.05は統計的に有意とされました。