本研究プロトコルは、統合的なマルチオミクス解析およびin vivo実験を通じて、Fructus Xanthii抽出物の変形性関節症における軟骨保護効果を体系的に調査することを目的と設計されました。
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研究記事
* These authors contributed equally
本研究プロトコルは、統合的なマルチオミクス解析およびin vivo実験を通じて、Fructus Xanthii抽出物の変形性関節症における軟骨保護効果を体系的に調査することを目的と設計されました。
変形性関節症(OA)は進行性の変性関節疾患であり、現在の薬理学的および外科的介入は主に症状の緩和にとどまっており、基礎的な病理学的変化を逆転させることはほとんどなく、新しい治療薬の緊急性を強調しています。このプロトコルは、 Fructus Xanthii 抽出物がOAに対して持つ軟骨保護効果の可能性を調査することを目的としました。まず、超高性能液体クロマトグラフィーと高分解能タンデム質量分析法(UHPLC-HRMS/MS)を用いて非標的メタボロミクスプロファイリングを行い、抽出物の化学成分を特性評価しました。ネットワーク薬理学とトランスクリプトミックマイニングを組み合わせた統合戦略を用いて、抽出物の生体活性成分および推定標的を特定し、OA関連の調節不全遺伝子との交差解析でコアターゲット遺伝子を得ました。遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析を行い、抽出物によって調節される主要な生物学的プロセスおよびシグナル伝達経路を注釈しました。in vivo 検証のために、ゼブラフィッシュ軟骨損傷モデルおよびマウスOAモデルを用いて抽出物の軟骨保護効果を評価しました。さらに、RNAシーケンシング(RNA-seq)が採用され、治療後の軟骨細胞におけるトランスクリプトム変化の解析に取り組み、OA関連経路や遺伝子発現プロファイルに焦点を当てました。その後、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を実施し、RNA-seqでスクリーニングされた主要タンパク質/受容体の発現レベルを検証し、 Fructus Xanthii 抽出物がコアOA標的に与える調節効果をさらに確認しました。この統合されたマルチオミクスおよび実験プロトコルは、 Fructus Xanthii 抽出物をOA介入の有望な植物候補として探求するための体系的なアプローチを提供します。
変形性関節症(OA)は、関節軟骨の進行性劣化、軟骨下骨硬化症、滑膜炎症、骨形成を特徴とする変性関節疾患です。グローバル・ブレデント・オブ・アズム(GBD)調査によると、1990年から2020年の間に204か国・地域でOAの有病率が着実に増加しており、この傾向は世界の人口高齢化とともに加速すると予想されています。現在の推計によると、世界中で2億5千万人以上が影響を受けており、個人の福祉、医療システム、社会経済的構造に大きな負担をかけています4。現在の治療法は主に症状緩和を目的としており、最も一般的な介入は非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)やヒアルロン酸(HA)を用いた関節内粘剤補給です。しかし、これらのアプローチは臨床的利益が限定的であり、かなりの副作用と関連しています5,6。これは効果的な変形性関節症治療薬(DMOADs)の重要性を強調しています。
伝統中国医学(TCM)は、骨性関節症(OA)の管理に長く用いられてきました。これは「骨二」という「二重症候群」の亜型の概念
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臨床サンプルとマウスを対象としたすべての実験は、山東省医療バイオテクノロジー研究センター倫理審査委員会が承認したプロトコルに従って実施されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. ヒトの関節軟骨細胞の単離と培養
ヒトの関節軟骨標本は、山東第一医科大学第一附属病院で関節鏡手術または全関節置換術を受けた患者から採取されました。軟骨の断片は外科的切除から30分以内に氷の上で検査室に運ばれました。組織は氷のように冷たいドルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS;3〜5回洗浄)で徹底的に洗浄され、その後無菌外科用ハサミで約1 mm3 の断片に細かく刻まれました。順次酵素消化が行われ、まず37°Cで0.25%トリプシンEDTAを用いて30分間の前消化を行った。 消化過程は軟骨断片が薄くなり、サイズが小さくなり、透明になるまで監視され、その後、室温で遠心分離(200 × g、5分)で軟骨片を採取しました。その後、0.2%のII型コラーゲナーゼを持続的な穏やかな攪拌のもとで8時間、37°Cで一晩消化しました。消化過程は、肉眼的に見える軟骨断片が完全に溶解するまで監視されました。放出された細胞は室温で遠心分離(200 × g、5分....
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非標的LC-MS/MSデータの質的評価と代謝的状況
QCサンプルは優れた再現性を示し、正イオンモードと負イオンモードの両方で高度に重なり合うTICクロマトグラムが示され、分析バッチ全体で保持時間ドリフトは0.05分未満に保たれました。生データはXCMSベースの前処理を受け、ピーク検出、積分、保持時間のアライメントが含まれていました。推定代謝物は、正確な質量(≤5 ppm)、同位体パターン、高品質なMS/MSスペクトルを社内のスペクトルライブラリと照合して注釈付けしました。厳密なフィルタリングとTIC正規化の結果、正イオンモードと負イオンモードでそれぞれ2,179件と1,291件の信頼できる特徴が保持され、後の化学計解析のための定量マトリックスが形成されました。
フルクタス・ザンティイ抽出物の化学組成
植物化学的プロファイリングにより、フェノール酸、リグナン、セスキテルペノイド、フラボノイ.......
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OAは一般的な変性関節疾患であり、世界的に障害の主な原因の一つです。その病因は複雑かつ多因子的であり、関節組織全体にわたる生化学的、細胞的、分子的変化を伴います。かつては関節軟骨の単純な「摩耗」現象と考えられていましたが、現在では軟骨の劣化、滑膜炎症、骨組織形成、軟骨下骨の再構築を特徴とする慢性的な関節全体疾患として広く認識されています 37,38,39。増え続ける証拠は、炎症がOAの病態生理において中心的役割を果たしていることを強調しており、滑膜、軟骨、軟骨下骨から産生される炎症性メディエーターが軟骨の分解と密接に関連している40,41。世界の疫学データによると、2020年には約5億9500万人がOAの影響を受けており、.......
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著者らは、本論文で報告された研究に影響を与えた可能性のある既知の競合する財政的利害関係や個人的関係はないと述べています。
この研究は山東省自然基金表面プロジェクト助成金(No.ZR2024MH088)、山東省中医技術プロジェクト(番号2020M070)、および山東第一医科大学附属病院および山東省千佛山病院の栽培基金(助成金番号:QYPY2022NSFC0601)」
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | Biosharp, China | BL539A | pH 7.4, sterile |
| C57BL/6 Mice | Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd, China | N/A | Male, 8-10 weeks old, 20-25g |
| Chondroitin sulfate | MCE, America | HY-B2162 | Purity ≥98% |
| ClusterProfiler (R Package) | Bioconductor | Free access | Integrated in R v4.2.2 |
| Collagenase, Type II, powder | Gibco, America | 17101015 | ≥125 U/mg |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | Free access (https://cytoscape.org/) | v3.9.1 (with CytoHubba) |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | Free access | Version 3.9.1 |
| DESeq2 (R Package) | Bioconductor | Free access | Integrated in R v4.2.2 |
| DMEM, high glucose | Gibco, America | 11965092 | Sterile medium |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China | 10009218 | Analytical grade, 95% |
| Ethyl acetate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China | 10009418 | Analytical grade |
| Fetal bovine serum (FBS) | Cellmax, China | SA102.02 | Heat-inactivated |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti2-U | Equipped with GFP filter (488nm excitation) & digital camera |
| GEO Database | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r | GEO2R analysis tool |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC, America | Commercial | Version 9.5.1 |
| Hematoxylin-Eosin(HE) Stain Kit | Solarbio, China | G1120 | Ready-to-use kit |
| HERB Database | Chinese Academy of Sciences | http://herb.ac.cn/ | V2.0 |
| Human MMP-1 ELISA Kit | Yamei Biotechnology, China | HJ088 | For human, 96-well plate |
| Human Progesterone Receptor (PR) ELISA Kit | Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., China | ml05997 | For human, 96-well plate |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Free access | Version 1.53t |
| Light Microscope | Olympus, Japan | BX53 | 10×/20× objectives & digital camera |
| Lyophilizer | Christ, Germany | Alpha 1-4 LDplus | Freeze-drying system |
| Modified Saffron-O And Fast Green Stain Kit | Solarbio, China | G1371 | For bone/cartilage staining |
| Neutral Balsam | Solarbio, China | G8590 | Mounting medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, America | 15070063 | 100×, sterile |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sparkjade, China | CR0013-500ML | pH 7.2-7.4, sterile |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | Free access (https://www.r-project.org/) | v4.4.1 (with ggvenn) |
| Serum-free Cell Freezing Medium | Biosharp, China | BL203B | Sterile |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 25923 | Standard strain |
| STRING Database | STRING Consortium | https://string-db.org/ | Protein interaction analysis |
| TCMID Database | Shaanxi Qinling Qiyao Collaborative Innovation Center | https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php | V3.0 |
| Tg(col2a1a:EGFP) Zebrafish | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | N/A | Larvae (2 dpf), AB strain |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher, America | 15596018CN | For total RNA extraction |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco, America | 25200056 | Sterile solution |
| Ultra-high Performance Liquid Chromatography (UHPLC) | Thermo Fisher, America | Q Exactive Focus | Coupled with HRMS/MS |
| XCMS-online | Scripps Research Institute | Free access | Web-based platform |