仙骨神経および末梢神経刺激が膀胱機能に与える影響を評価するためのラット動物モデル

サマリー

このプロトコルは、麻酔ラットにおける仙骨神経、脛骨神経、腓骨神経を刺激するための詳細な外科的技術を記述しています。これらのモデルは、膀胱機能に対する神経調節の影響の調査を可能にし、最適な刺激パラメータの決定を助け、仙骨および末梢神経刺激療法の作用機序の研究を可能にします。

要約

神経調節は、さまざまな臓器の機能障害に対する治療的アプローチであり、下部尿路機能障害の治療に効果があることが証明されています。臨床的成功にもかかわらず、神経調節のメカニズムは完全には解明されておらず、標準化され再現性のある動物モデルの必要性が強調されています。仙骨および末梢神経刺激を用いた膀胱神経調節の前臨床モデルは20年以上にわたり確立されています。しかし、既存の文献では手術手順に関する方法論的詳細は限られています。本記事では、仙骨神経刺激のための確立された技術の詳細な説明と視覚的表現を提供します。また、脛骨神経刺激の修正アプローチを説明し、ラットモデルにおける腓骨神経刺激を用いた新しい膀胱神経調節法を紹介しています。修正脛骨神経刺激法は、以前の研究で述べられた内側足首ではなく、坐骨神経の枝として脛骨神経の起始部を露出させ刺激する手法です。膀胱神経調節のための腓骨神経刺激が臨床実践で導入されたことを踏まえ、本記事では下部尿路機能の制御におけるそのメカニズムを調査するための独自のラットモデルを提案します。神経曝露、電極配置、特徴的な運動反応に基づく電極配置の検証に関する段階的な指導が示されています。醋酸誘発性膀胱過活動のラットモデルにおける腓骨神経刺激が膀胱機能に与える代表的な例を含み、その適用性を示す。本記事では、膀胱感覚シグナルの変化、脊髄および脊髄上方の調節経路の変化、刺激パラメータの最適化、異なる刺激ターゲットの有効性比較を含む神経調節機構を研究するための標準化され、技術的にアクセスしやすいプロトコルを提示します。

概要

神経調節は低振幅の電気刺激を用いて末端器官1の機能を変化^{させます。}過活動性膀胱症候群(OAB)、非閉塞性尿閉、神経原性膀胱、膀胱痛症候群などの下部尿路機能障害の文脈では、行動療法および^{薬物療法に}失敗した患者の第三選択治療として神経調節が用いられます。過膀胱膀胱(OAB)患者の神経調節には、後脛神経刺激および仙方神経刺激(SNS)が臨床現場で広く用いられています。陰部神経や腓骨神経を含む追加の末梢神経を標的とした実験的な神経調節アプローチが研究^{されています。}

神経調節は数十年にわたり膀胱や腸疾患の治療に用いられてきましたが、その作用機序はまだ完全には解明されていません。多分野専門家グループレビューによれば、現在使用されている刺激パラメータは主にメーカーが試行錯誤のアプローチに基づいて選ばれました⁷。したがって、治療効果を向上させるために、動物モデルを活用して基礎的な経路を明らかにし刺激パラメータを最適化し続けることが重要です。マウス、ラット、羊、犬、猫などの覚醒状態および麻酔状態の動物を用いて、いくつかの前臨床実験が行われ^{ています。}倫理ガイドラインや研究方針が世界中でより複雑で小型の種の使用を推奨している中、近年は齧歯類モデルが最も頻繁に利用されています。

膀胱機能障害のラットモデルにおけるSNSは主に2つの方法論的アプローチを用いています。最初の方法はZvaraらによって記述されており、アンジオカテーテルまたは脊椎針を用いて刺激電極を仙骨孔に埋め^{込むものです。}2つ目の方法は、L6神経根を露出させ、刺激電極をL6神経の下に配置し、シリコーン接着剤で電極と神経⁹の接触を固定する方法です。仙骨孔への電極配置技術は臨床的アプローチを反映しています。L6根を露出させる方法は技術的には難しいものの、正確な位置特定と神経へのアクセスの一貫性を提供します。

後脛神経刺激を模倣したラット動物モデルも文献で記載されています。最もよく使われる方法は、足首の上方後肢内側に脛神経を外科的に露出させること^です。別の方法は、脛神経¹⁷の近くに針電極を経皮的に挿入することです。本記事では、坐骨神経が脛骨神経、総腓骨神経、腓骨神経、腹側筋の三つの枝に分かれる大臀筋と大腿二頭筋の間の脛神経刺激の起源点を詳細に記述することを目的としています。さらに、本研究は新しい神経調節法を研究するための新しい動物モデルとして腓骨神経刺激を導入しています。このラットモデルの翻訳的関連性は、膀胱神経調節に対する腓骨神経刺激の最近の臨床導入によって支持されています^18,19。

プロトコル

動物たちは機関のガイドラインに従い、南デンマーク大学動物ケア施設に収容されました。すべての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物のケアと利用に関するガイドラインに従って実施されました。デンマーク動物実験検査局の倫理委員会は研究手続きを承認しました(プロトコル番号2022-15-0201-01158)。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 電極の準備

注:脛骨神経、腓骨神経、L6神経刺激には、²⁰本の双極フック型電極が使用されました。以下のステップは、電極の設計と構造について簡単な説明を提供します。

1. 同じ長さの125μmポリテトラフルオロエチレン(PTFE)コーティングされた銀線を2本切断し、それらをねじり合わせます。
2. ワイヤーの一端から4〜5mmのPTFEを剥がし、露出した端を均等にトリミングし、23Gの針で先端を上に曲げて、2 mm間隔で並行した2つのフックを作ります。
3. 電極をプレートに固定し、フックを上向きにしてプレートの端から伸ばすように配置します。
4. 2成分のシリコン接着剤を5秒混ぜます。針から1〜2mmの距離に一滴垂らし、約5分間乾かします。
5. 電極の反対側からPTFEコーティングの1〜2cmの部分を剥がし、刺激器に接続できるようにします。

2. 動物の調理

注:無菌条件下で、PE-50カテーテルは熱で端を広げてメスのスプラグ・ドーリーラット(250–300g)の膀胱ドームに埋め込み、バッグストリング縫合で固定しました。チューブの遠位端は動物の背中に外側から出され、皮下ポーチ²¹に巻き込まれました。手術後、膀胱の回復には5日間の期間が設けられていました。

1. 動物はウレタン(1.5g/kg、腹腔内投与)で麻酔を行います(機関承認のプロトコルに従い)。実験開始約2時間前に、ウレタンを15分間隔で3回に分けて投与します。
2. 動物を温熱パッドに移し、うつ伏せの姿勢に置きます。
3. 脛骨神経および腓骨神経刺激のために、ラットの後肢を太ももの周辺と背中の下半分を剃ります。尾と5mLの注射器をラットの左後肢の下に置き、 図1Aに示すように尾と脚を固定します。
4. SNSの場合は、尾から胸椎までラットの背中を剃り、腹部の下に50mLの遠心分離機チューブを挿入して腰椎と仙骨を高くします。
   注:すべての神経刺激実験は生存を目的としない手技を表しています。清潔な手術技術を使いましょう。

3. 腓骨神経および脛骨神経の解離および電極の埋め込み

1. メスを使って膝関節と坐骨結節の間の中央に3〜3.5cmの切開を入れます(図1B)。
2. ハサミを皮膚の下に滑り込ませて結合組織を切って皮膚を筋肉から切り離します。
3. リトラクターを使って皮膚を開き、臀大筋と大腿二頭筋をつなぐ筋膜を露出させます(図1C)。
4. まっすぐなハサミで筋膜を切り、臀大筋と大腿二頭筋の間の空間を切り離し、坐骨神経が見えるまで切り離します(図1D,E)。
5. 坐骨神経およびその枝である脛骨神経、腓骨神経、褥膜神経を適切に露出させるために、リトラクターを大腿二頭筋に再配置します(図2A)。この文脈では、「腓骨神経」とは、深部および表層の腓骨神経に分岐する前の共通腓骨神経を指します。脛神経は最大の枝であり、腓骨神経は最も小さく、腓骨神経は中間の直径です。
6. 曲がった鉗子とマイクロハサミを使って、腓骨神経を周囲の結合組織から分離します。次にマイクロ鉗子を使って、両側とその下の組織を慎重に広げ、長さ5mmの神経の断片を分離します。脛骨神経刺激のために同じ手順を繰り返します(図2B)。
   注意:鉗子で神経を掴んで圧迫しないようにし、神経への引っ張りを最小限に抑えてください。
7. メスを使って背中の下半分に5mmの長さの切開を入れ、切開部に止血器を皮膚の下に滑り込ませて皮下のチャネルを作ります。止血器を慎重に前進させ、後肢の切開部で先端が出るまで続けます(図2C)。
8. 止血鉗を使い、電極の外れた端を掴み、背中の下半分の切開部からゆっくりと器具を引き抜きます。2つの鉗子を使い、電極のもう一方の端(フック付き端)を皮下面に対して90°の角度に曲げ、電極のフックが神経(腓骨または脛骨)に隣接かつ垂直に位置するようにします(図2D)。
   注意:神経の伸びを防ぐために電極の適切な位置取りが重要です。
9. 曲がったマイクロピンセットを使って神経を持ち上げ、電極のフックを神経の下に滑り込ませます。2成分シリコン接着剤を5秒混ぜ、綿棒で神経を乾かし、フックと神経の隣接部分を覆う程度の接着剤を塗ります(図2E–G)。
   注意:接着剤を塗布する前に、電極を刺激装置に接続し、運動閾値のレベルで神経を刺激して電極の正しい位置を確認してください。モーター閾値は、一貫した位相的な足の動きを引き起こすために必要な最小電圧として決定されました。腓骨神経の刺激は足の相性背側屈曲を生じ、脛神経刺激は足底屈曲を生じさせます。刺激に対する運動反応がない場合は、刺激装置と電極の接続を確認してください。
10. 背中の切開部の結合組織に5-0ナイロンステーシュを挿入し、両方の縫合端を十分に長く保ちます。これらの端は電極を固定し、安定した位置を確保するために使われます。
11. 後肢切開部の皮膚を4-0ビクリル縫合糸で閉じます。

4. L6神経の露出と電極の埋め込み

1. メスを使って腰椎と仙骨の上に4〜5cmの中央線切開を入れます。切開部を開けてリトラクターを設置し、下の背中の筋肉と椎骨棘突起の先端を露出させます(図3A)。
2. 腸骨稜を触診し、それをランドマークとしてL6の棘突起を特定してください。これは腸骨稜のすぐ下に位置する最初の棘突起として特定できます(図3B)。
3. ハサミを使って、L5からS2までの椎骨上部の筋膜を除去します。次に、両側の椎骨側筋を慎重に分離し、棘突起、椎板、関節突起を露出させます。残った結合組織と筋肉をマイクロハサミで除去し、骨構造がはっきり見えるまで続けます(図4A,B)。
   注:これにより、ランドマークを露出させ、L6神経幹へのアクセスを可能にする解剖学的な窓が生まれます。L6の後部椎間関節を特定します。L6神経幹はこの関節の後方を通っています。また、仙骨関節と仙腸関節を特定してください。L6神経幹はこの関節の尾側および内側を走っています(図4B)。
4. ロンジュールを使ってS1の棘突起を慎重に除去し、S1とS2椎骨の間の領域にある仙骨の小さな断片を徐々に破壊・除去してL6神経幹を露出させます(図4C)。
5. 曲がった鉗子とマイクロハサミを使ってL6神経を周囲の組織から分離します。神経をバイポーラPTFEコーティングされた銀線電極にフックし、生体適合性のシリコーン接着剤で周囲組織から隔離します(手順3.9(図4D)に記載されています。
   注:L6神経の刺激は骨盤底筋の収縮と尾の痙攣を引き起こします。
6. 反対側でも同じ手順を繰り返して両側神経刺激を行います。
7. 皮膚を4-0のビクリル縫合糸で閉じます。

5. 仙骨孔への刺激電極挿入

1. 仙骨の上にメスで中央線の切開を入れ、リトラクターで切開部を開き、下の背中の筋肉を露出させます。
   注意:ステップ4.2で述べたように、L6/S1のランドマークを特定するために腸骨娴を触診してください。
2. 鈍的解離を用いて椎骨側筋と棘突起を分離します。筋肉のリトラクターを再配置し、棘突起を露出させ、S1仙骨孔へのアクセスを容易にします(図5A)。
3. S1棘突起の尾側および外側にあるS1孔の位置を特定します。単極電極をプリロードした18ゲージ針でS1仙骨孔を探査します(図5B)。
   注意:180μmのPTFEコーティングされたステンレス鋼線を使用し、両端から5mmの絶縁材が剥がされています。
4. 針先をS1孔に位置させ、脊椎と平行に保ち、動物の背中に対して約30°の角度をつけます。針をゆっくりと引き抜きながら、ワイヤーを神経の軌道に沿って優しく前進させます。対側のS1孔で同じ手順を繰り返して両側刺激を行います。
   注意:電極の正しい位置を確認するために、ワイヤーの遠位端を刺激装置に接続してください。電気刺激は尾のピクピクを引き起こします。
5. 5-0ビクリル縫合糸(図5C)で隣接する棘突起(L6)にワイヤーを固定します。
6. 首の後ろにメスを使って1cmの切開を入れ、首の後ろの切開部から仙骨の切開部まで止血抑制器を使って皮下トンネルを作ります。
7. ワイヤーの遠端をトンネルを通して、首の後ろで外側に取り付けます(図5D参照)。
8. 4-0ビクリル縫合糸を使って、筋膜と仙骨レベルで皮膚を閉じ、首の後ろの皮膚も閉じます。

6. 膀胱計測記録

1. 5日後、刺激実験を行う前にPE-50チューブを外部に出し、圧力トランスデューサーと注入ポンプに接続します。
2. 膀胱パラメータの安定化を促すために、3 mL/hのペースで2時間連続的に膀胱を注入します。
3. 単一膀胱内輸液サイクルを用いて、基線圧、閾値圧、膀胱順從性、排尿圧、膀胱容量などの膀胱測定パラメータ^{を評価する。}
4. 各実験終了時に倫理基準に従い、麻酔過剰投与による動物の安楽死を行います。

結果

神経調節が下部尿路機能に与える影響を評価する実験デザインを示すため、0.5%酢酸の膀胱内輸液による膀胱過活動のラットモデルに腓骨神経刺激を用いた研究を発表します。膀胱機能は刺激前後の単一排尿サイクル膀胱計測を用いて記録されました(図6 A,B)。実験装置には、二相刺激波形を用いた2つの異なる腓骨神経刺激、周波数10 Hz、パルス持続時間0.2 ms、運動閾値の3倍(1.2–3 V)刺激強度が含まれていました。

腓骨神経の刺激が成功したのは、刺激期間中、後足の相性背側屈曲によって確認されました。

腓骨神経刺激は排尿パターンに明確な変化をもたらし、刺激中および刺激後の膀胱容量の低下も含まれます。1時間の刺激で手尿圧が増加し、10分の短期刺激後にはベースライン、閾値圧、排尿圧力の変化が観察されました。

ディスカッション

本記事では、麻酔ラットにおける仙骨神経、脛骨神経、腓骨神経刺激のための電極移植の外科的手法について詳しく説明しています。

仙骨孔に鉛電極を埋め込み、S3仙骨神経を連続的に低振幅刺激することは、下部尿路(LUT)機能障害および便失禁の広く受け入れられた治療法です。患者の場合、電極は通常S3孔に挿入され、ミエリン付きおよび非ミエリン化の混合軸索を標的と^します。この位置はラットの脊髄のL6–S1セグメントに対応します。ラットの標的神経を正確に特定するのは難しいです。これは、明確な視覚ガイドを用いた詳細なステップバイステップのプロトコルと、神経刺激を用いて運動反応を引き出し、標的神経の刺激を確認する必要性を強調しています。

ラットを用いた脛骨神経刺激を用いた研究では、脚の内側側の足首上部での神経解離と刺激、または針電極を用いた経皮刺激のいずれかが用いられました。本記事で紹介する方法は、坐骨神経から起点の脛骨神経と腓骨神経...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
18 G 使い捨て注射針	KRUUSE	121282
Dumont鉗子スタイル5TM	DUMONT	1708-5TM-PO	湾曲
Dumont鉗子スタイル7XL	DUMONT	0508-7XL-PO	湾曲
Grass SD9スクエアパルス刺激器	Somatco	1077/183
血管鉗子	Fine Science Tools/Teleflex	13018-14/PO181059	≥ 14 cm、細い先端
虹彩はさみ	World Precision Instruments	14218	ストレートはさみ
Kwik-Silシリコーンエラストマー	World Precision Instruments	KWIK-SIL	2成分接着剤
マイクロアードソン鉗子	World Precision Instruments	501245
マイクロはさみ	S&T	SAC-15 R-8	曲がった先端≤ 10mmの長さ
NaCl 0.9% 100 mL	B.Braun	N/A
PE-50チューブ	Instech	BTPE-50
プロレーン5-0縫合糸	Ethicon	EH7257
ロングエ	George Tiemann & Co	160-424-08	細い湾曲した先端
外科用メス	Swann-Morton	0505
ウレタン	Sigma-Aldrich	U2500
ビクリル4-0縫合糸	Ethicon	V451
ビクリル5-0縫合糸	Ethicon	V303
ワイヤーシルバーテフロンコーティング0.125 mm	World Precision Instruments	AGT0525
ワイヤーステンレススチールテフロンコーティング0.18 mm	World Precision Instruments	SST30407-50