Bex-Plexは、タンパク質マーカーとリボ核酸転写産物を同時に可視化し、完全な組織の深い空間プロファイリングを可能にします

サマリー

ここでは、反復的タンパク質染色(IBEX)とRNAscope インシチュそのハイブリッド 化技術を組み合わせ、高解像度空間プロファイリング応用のための完全な固定凍結組織の深層表現型解析のためのプロトコルを提示します。

要約

ここでは、完全な組織において単一細胞分解能でタンパク質およびリボ核酸(RNA)マーカーの同時空間プロファイリングを可能にするプロトコルを提示します。固形腫瘍がんを取り巻く核心的な問題の一つは、治療介入に対する患者の反応を予測できないことです。これらの複雑さを解読するには、保存状態の完全な組織内の細胞挙動、相互作用、表現型の定量的測定が必要です。具体的には、プロテオームとトランスクリプトームは重複しつつ冗長でない情報を提供し、合理的な免疫療法の設計に不可欠となり得ます。しかし、現時点では、腫瘍微小環境内のすべての細胞の転写状態と機能状態の両方を詳細にプロファイリングしつつ、重要な空間的局在情報を保持する単純かつコスト効率の高い方法はありません。この目的のために、IBEX(反復漂白拡張多重性)プラットフォームとHiPlex RNAscopeを組み合わせることに成功し、高プレックスタンパク質マーカーと高プレックスリボ核酸(RNA)転写産物を単細胞分解能で同時に可視化しました。このアプローチは、核形態を保存し、サイクルを通じた正確な画像整合を可能にするために修正されたRNAターゲット回収ステップを組み込んでいます。「Bex-Plex」は、固定された凍結組織に対して修正されていないIBEXプロトコルを実行し、その後HiPlex RNAscopeプロトコルを用い、修正RNAターゲットを用いてIBEXサイクルとの核レベルの整合を保証します。このプロトコルは固定凍結組織に最適化されており、転写および機能細胞状態の統合的な空間解析を可能にします。この単一細胞レベルでのプロファイリングの力は、組織自体に関する深い情報源を提供するだけでなく、治療反応性を駆動する微妙な細胞相互作用の予測を可能にし、腫瘍微小環境や関連システムの空間生物学を研究するための枠組みを提供します。

概要

2011年の導入以来、PDL-1やCTLA-4などの阻害性免疫チェックポイント分子を遮断して細胞傷害性T細胞の抑制を抑制するがん免疫療法が、固形^{腫瘍治療の}ゴールドスタンダードとして台頭しています。しかし、患者への大規模な使用にもかかわらず、これらの薬剤の臨床効果は大きく異なります。なぜなら、多くの固形腫瘍がんはこれらの治療法に本質的に現れるか、最終的には耐性を生じさせるからです²。多くの場合、これは同じがん³型でも非常に多様な固形腫瘍の性質によるものです。固形腫瘍における細胞関係をより深く理解することが、より良い治療法を生み出す鍵となります。したがって、この抵抗性を支え、維持する正確なメカニズムと相互作用を特定することががん研究の最前線にあります。ここでは、完全な組織内でタンパク質とRNA発現を統合的に空間解析し、これらの複雑な細胞相互作用をよりよく特徴づける方法の開発を目指しています。

腫瘍微小環境(TME)は、腫瘍の成長や免疫応答を形作る非がん性の細胞および構造的要素で構成されており、がん関連の線維芽細胞、浸潤免疫細胞、血管成分、細胞外マトリックス^4を含みます。近年、TMEの組成と組織が腫瘍が免疫浸潤に対して許容されるか耐性かに強く影響することが明らか^{になりました。これは}免疫療法への反応性を左右する主要な要因の一つです。多くのがんでは、T細胞数が少なく、免疫抑制性の高い骨髄集団が存在することが特徴の「免疫砂漠」表現型が、チェックポイント遮断療法への応答性低下と相関^{しています。}ケモカインシグナル伝達は、これらのリクルート動態の多くを支配しています。例えば、CXCL1およびCCL2は免疫抑制性骨髄細胞を引き寄せ、CXCR3-CXCL9/CXCl10軸は細胞傷害性および調節性T細胞の両方を腫瘍8に誘導^します。したがって、ニッチ特異的なシグナル伝達環境は細胞の表現型や機能に強い影響を与えます。例えば、大腸がん患者では、CCL5-CCR5軸が腫瘍関連マクロファージ(TAM)の抑制機能を制御し、このシグナルを遮断することでTAMが抗腫瘍性表現型に偏り、臨床反応の改善と相関^します。さらに、免疫細胞、がん関連線維芽細胞、および/または腫瘍細胞間のICAMおよびPDL-1による直接的な相互作用は、免疫の疲弊を誘発し、抗腫瘍免疫を鈍らせる可能性があります¹⁰。これらの発見は、TMEが治療効果にどのように影響するかを理解するために空間的に解析される重要性を強調しています。

免疫蛍光(IF)イメージングは、組織内のタンパク質発現および細胞間相互作用を可視化するための基礎的な手法として依然として存在しています。この分野は従来の3-4色間欠条線から、反復染色とイメージングに依存する高成分イメージングワークフローへと進化しています。これらの方法では、抗体標識、画像処理、蛍光色素の不活化または除去を繰り返し行って大規模なデータセットを作成し、追加のマーカーを染色・^{イメージングできます}。最近、使いやすくコスト効率の良い反復イメージングプラットフォームとして導入された反復的イメージングプラットフォーム¹²。市販抗体や従来の顕微鏡の使用と互換性があり、IBEXは主に使用される色素の蛍光を消光するために、組織エピトープを損傷することなくリチウムホウ水素化物(LiBH₄)を用い、単一の組織¹³に対して最大75のパラメータを取得することを可能にします。このサイクリックステインから得られた画像は、SimpleITKのオープンソースソフトウェアを用いてアラインメントされ、高次元空間解析に適した複合データセットが作成されます。

タンパク質レベルの表現型解析を補完する空間的トランスクリプトミクス手法は、細胞の原生環境における転写状態に関する貴重な情報を提供します。特に、インシチュハイブリダイゼーション(ISH)は^{特定の組織内の}DNAまたはRNA配列の局在を特定するための人気のある手法です。RNAscopeは独自のZ化学反応を持つプローブを用いてRNA転写産物を単一分子分解能で特異的に増幅する確立されたISH手法であり、多くの異なるサンプルタイプに適合しています¹⁴。Advanced Cell Diagnostics(ACD)を通じて広く採用され商業的に利用されているプラットフォームとして、RNAscopeは多様な標的に対する検証済みプローブを提供し、多様な応用に向けた実験設計を簡素化します。

同じ組織内でタンパク質とRNA検出を組み合わせることで、細胞の同一性と機能をより完全な理解を得ることができます。サイトカインやケモカインのような短命な分泌タンパク質は、伝統的にIHCによる信頼できる抗体染色ができませんが、mRNA転写本の定量化を通じて発現に関する情報を得ることができます。従来の染色性IHCやTSA-OPALのようなRNAとタンパク質の共検出の試みは、非線形シグナル増幅や時間のかかる抗原回収プロトコルによって制限されてきました¹⁵。これらの手法と比較して、ベックスプレックス法は空間的文脈と核形態を保持しつつ、高プレックスタンパク質とRNAの同時検出を可能にし、正確な画像登録を実現します。

ここでは、「Bex-Plex」を紹介します。これはIBEXとRNAscopeプラットフォームを統合し、細胞の原生組織内の転写および翻訳状態を同時に定量的に特徴付けるプロトコルです。Bex-Plexでは、固定OCT埋め込み組織が標準的なIBEXプロトコルを経て、わずかに修正されたRNAscope HiPlexワークフローを経て、標的回収は60°Cで1時間のインキュベーション時間で行われます。これは元の99°Cの5分間インキュベーションから大きく異なります。これにより核の構造が保たれ、IFおよびISHサイクルの別々の画像を一つに記録する際にフィデューシャルマーカーの正確な整列が可能になります。このプロトコルは、組織の利用可能性が限られている場合や空間構造の保存が重要な腫瘍微環境解析や免疫プロファイリング研究など、タンパク質とRNA発現の同時空間解析が必要な研究に最適です。

広く入手可能な試薬を使用し、ほとんどのイメージングプラットフォームに対応しているため、蛍光イメージングに精通し、従来の顕微鏡にアクセスできる技術訓練を受けた研究者なら誰でも実施可能です。ここで提示されるプロトコルは、固定凍結サンプル向けに最適化されています。現在、このプロトコルは固定凍結組織で検証されており、FFPEやヒト臨床標本など他のサンプルタイプへの適用にはさらなる最適化が必要となる場合があります。

このワークフローは、組織生検やサンプル数が限られている動物実験など、組織が限られたまたは貴重な状況、また解離技術で抽出が難しい可能性のある細胞の表現型解析においても非常に貴重です。Bex-Plexは、単一細胞の転写および翻訳プロファイルに関する同時かつ定量的な情報を提供しつつ、その空間的文脈を保持しつつ、元の環境における細胞間の関係性やクロストークに関する疑問に独自に答えるデータを提供します。

プロトコル

このプロトコルで示された手順は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の施設動物ケア・利用委員会(プロトコル番号S24049)によって承認されました。これらの実験には、C57BL/6遺伝子背景を持ち、特定の病原体なし条件下で飼育された生後7〜12週齢のオスとメスのマウスが用いられました。

1. 組織調製

1. 実験マウスを承認された一次および二次手段(例:_CO2 安楽死や子宮頸部脱臼)で安楽死させ、関心のある組織を補足培地に収穫します。
2. 4%のパラホルムアルデヒド(PFA)ストック溶液を1X PBSに0.5%または1%PFAに希釈して、新しい組織固定液を準備します。リンパ節などの低容量組織には0.5%のPFA、腫瘍のような高容量組織には1%のPFAを使用してください。
   注意:パラホルマルデヒドは可燃性で、摂取または飲み込むと有毒です。適切なPPEを着用し、皮膚や目に触れないようにしてください。
3. 組織を24ウェルプレートに移し、1ウェルごとに2mLの固定液を投与し、4°Cで一晩培養します。
   注意:16時間を超える潜伏時間は過剰固執の問題を引き起こす可能性があります。
4. 新しい24ウェルプレートのウェルに1XPBSを充填し、固定プレートから組織を移します。
   停止点:必要に応じて、組織を1XのPBSで4°Cで最大7日間保存できます。
5. 解剖用スコープと工具を使って、組織から余分な脂肪や破片を一つずつ切り取ってください。トリミング中に組織脱水を防ぐために、1XのPBSを少量直接組織に加えます。
6. 粉末のショ糖ストックを1XPBSで薄めて、30%のw/vショ糖溶液を準備します。
7. 組織を24ウェルプレートに移し、1ウェルあたり2mLの30%ショ糖を含み、4°Cで一晩培養して脱水させます。組織は井戸の底に沈むと十分に脱水状態です。
8. ラベル付きのクライオモールドにOCTを入れ、組織を一つずつモールドに入れます。組織の向きは起源によって異なりますが、標準的な推奨では、最大の表面積はクリオモルドの底面と平行であることが推奨されます。組織がOCTに完全に浸かっていることを確認してください。
9. ドライアイスに10分間置いて冷凍し、-80°Cで保存します。

2. 組織切片

注:本プロトコルで使用されるすべての試薬および実験材料はRNaseフリーでなければなりません。スライドを扱う際は汚染防止に注意してください。

1. RNaseフリー顕微鏡スライドに15μLのクロムアルム接着剤を塗り、オーブンで60°Cで1時間培養します。クロームアルムコーティングされたスライドは、使用前に最大1か月間室温(RT)で保存できます。
2. OCT埋め込み組織を-80°Cの冷凍庫から取り出し、-20°Cのクライオスタット/クライオトームに入れて少なくとも20分間平衡させます。
3. 10〜15μmの厚さでクロムアルムコーティングされたスライドに組織を切開します。
4. 切断した断片が入ったスライドは4°Cで保存するか、同日に染色する場合はスライドをRTに平衡させて保存します。断面スライドは使用前に最大5日間4°Cで保存可能です。

3. タンパク質染色

1. ダンクタンクで、染色用のスライドをRNaseフリーの1X PBSに5分間浸して、組織から余分なOCTを除去します。
2. 疎水性のバリアペンを使ってスライドの組織の周りに箱を描き、2分間乾かします。
3. RNaseフリー1X PBS中に10μg·mL⁻¹ 抗マウスFC受容体ブロックのブロッキング溶液を製製します。スライド上のサンプルにブロッキングバッファーを加え、組織全体を覆う気泡を作る(100–150 μL·^section-1)を使用します。
   注:困難な組織やマーカーの場合、ブロッキングバッファにFBSやBSA(通常1〜2%)を加える必要がある場合もあります。
4. スライドはRTで湿度の高いステインボックスで1時間孵化し、その後RNaseフリーの1X PBSを入れたタンクに完全に浸して5分間洗い流します。
5. RNaseフリー1X PBSで一次抗体染色溶液を準備し、1組織切片あたり100〜200μLを計画します。標準的な抗体希釈は1:50〜1:200の範囲ですが、特定の抗体や組織タイプに最適な希釈因子を特定するために単一染色滴定を行うことが推奨されます。ボルテックスとパルスで抗体を回転させてピペット処理し、蛍光凝集体を防ぎます。
6. 洗浄液からスライドを取り出し、サンプルボックスの隅にある余分な液体を吸収性タスクワイプで優しく吸い取って抗体溶液を希釈しないようにします。
7. 抗体溶液をブロッキング溶液と同じ方法で塗布し、組織の上に泡を作ります。
8. スライドを37°Cのオーブンに水平に置き、1時間キュベートします。または、湿度の高い箱でRTで3〜4時間スライプします。目的の組織に最適化された標準的なIFプロトコルが使用されることがあります。潜伏中は乾燥した環境でスライドを保管し、脱水を防ぎましょう。(例:染色トレイの底に濡れたペーパータオルを使います)。
9. スライドを洗うためにRNaseフリーの1X PBSを2分間浸して洗います。これを2回繰り返し、合計3回洗います。染色パネルに必要な場合は、この期間中にRNaseフリー1X PBSの二次抗体染色溶液を準備してください。標準的な抗体希釈は1:500〜1:1000の範囲ですが、特定の抗体や組織タイプに最適な希釈因子を特定するために単一染色滴定を行うことが推奨されます。
10. 吸収性タスクワイプで余分なPBSをスライドから除去し、各組織切片に100〜200μLの二次抗体染色液を加えます。スライドを37°Cのオーブンに水平に置き、30分間孵化させます。または、湿った箱でRTで1〜2時間染色することも可能です。
11. スライドを1XRNaseフリーPBSに2分間浸して洗いましょう。これを2回繰り返し、合計3回洗います。
12. DAPI核染料を最終濃度0.2 μg·mL⁻¹ に薄め、RNaseフリー1X PBSに浸し、各組織切片に100〜200 μLを加えます。
13. 湿度の高い箱でRTで10分間スライドし、その後RNaseフリーの1X PBSを浸して軽く上下に浸して洗浄します。
14. 吸収性タスクワイプで余分な液体を除去し、各セクションに20〜30μLの水基アンチフェードマウンティングメディウムを加えます。スライドにカバースリップを慎重に置き、気泡を最小限に抑え、マウント培地を15〜30分硬化させます。
15. 汚れたスライドをイメージしてください。IBEXのパネル設計および画像取得に関するより詳細な説明については、元のIBEXプロトコル^12,13を参照してください。
    一時停止:マウントスライドは4°Cの暗闇で最大3日間保管しますが、RNA分解を最小限に抑えるために直ちに作業を行うことをお勧めします。

4. 蛍光色素漂白および反復タンパク質染色

1. スライドをRNaseフリーの1X PBSに浸し、カバーの滑りが力をかけずに簡単に滑り落ちるまで浸します。カバースリップが取り付けられている時間によっては、最大で16時間かかることもあります。
2. スライドを浸している間、LiBH₄をRNaseフリーのDI₂Oに溶かすまで1mg·mL^⁻1 溶液を優しく混ぜて10分間活性化を待ちます。溶液中に気泡が存在すると活性化が起こり、活動は最大4時間持続します。
   注意:LiBH₄ は水に反応するため、粉末ストックの過剰な水分曝露を避け、適切に廃棄物を適切に処理してください。
3. スライドをRNaseフリーの1X PBSで2分間洗浄し、埋め物残留物を除去した後、各組織に100〜150μLのLiBH_溶液 をピペットで塗布します。湿度の高い箱で15分間孵化させます。
   注:染色に使用される蛍光素によっては、この培養時間を延長する必要がある場合があります(IBEX方法論文で詳しく議論されています)^12,13。
4. スライドを一度洗い、RNaseフリーの1X PBSに浸して軽く上下に浸してください。
5. ステップ3.5-3.15に従って追加のタンパク質マーカーでスライドを染色します。_LiBH4では漂白されないため、核染料の再染色は必要ありません。必要に応じてタンパク質染色を繰り返してください。
   一時停止点:マウントスライドは4°Cで一晩保存し、その後最後のタンパク質/IBEXサイクルを漂白しRNAに進めます。
6. 最終サイクルの蛍光色素を漂白した後、すぐにRNAscope HiPlexに進みます。標準的なIBEXは最大6サイクル、組織やエピトープの損失なしに実施されていますが、このプロトコルではRNA転写物の質が長期間低下する可能性があるため、3サイクルを超えることは推奨しません。

5. RNAscope HiPlexのスライド準備

1. スライドをRNaseフリーの1X PBSに完全に浸し、カバースリップが力をかけずに簡単に滑り落ちるまで続けます。カバースリップが取り付けられている時間によっては、最大で16時間かかることもあります。RNaseフリーの1X PBSで2分間洗い、埋め物の残留物を除去します。
2. 50%エタノール200mL、70%エタノール200mL、100%エタノール400mLを準備します。
3. ハイブリッドオーブンを起動して60°Cに設定します。 10倍ターゲット回収試薬をRNaseフリーDI_{H 2O}で1倍の作動ストックに希釈し、ステップ5.8までオーブンで予温します。
   注:ターゲット回収試薬を60°Cまで予温しないと、別々のサイクルからの画像の下流登録に影響が出ます。標的回収試薬は回収ステップの間、60°Cの温度を維持しなければなりません。
4. スライドを50%エタノールに浸します。RTで5分間孵化してください。
5. スライドを50%エタノールから取り出し、70%エタノールに浸します。RTで5分間孵化してください。
6. 70%エタノールからスライドを取り出し、100%エタノールに浸します。RTで5分間培養し、新鮮な100%エタノールで繰り返します。
7. 100%エタノールのスライドを取り外し、RTで5分間乾燥させます。
8. 各組織切片に60°C 1Xターゲット回収試薬100–150μLを加え、スライドをハイブリダイゼーションオーブンに入れます。60°Cで1時間培養します。
9. スライドを取り出し、RNaseフリーのDI水に15秒間浸してすすぎます。この時点で、オーブンの設定温度を40°Cに変えます。
10. スライドを100%エタノールに移し、5分間培養し、その後RTで最低5分間乾燥させます。
11. プロテアーゼIIIをスライドに1〜2滴ずつ塗布します。スライドをハイブリダイゼーションオーブンに入れ、40°Cで30分間培養します。
12. スライドをRNaseフリーのDI_{H 2}Oに浸し、上下に軽く浸して洗います。新鮮な蒸留水で合計2回洗うのを繰り返します。

6. RNAscope試薬の調製およびプローブハイブリダイゼーション

1. RNAscope HiPlexプローブのストックとHiPlexプローブの希釈剤は、オーブンまたは水浴で40°Cまで10分間温めて準備します。
2. 短時間、すべての50倍プローブストックをパルスス回転でダウンさせます。RNAscopeプローブ希釈剤で各ユニークなターゲットプローブを1倍に希釈して作動するプローブ混合物を準備します。組織ごとに50〜100μLのプローブ混合物を使用し、使用前に渦を巻いてよく混ぜる計画を立ててください。RNAscope HiPlexプロトコルは、4本のプローブ(合計12本、T1-12と表記)を3サイクルまで対応可能です。プローブ設計の指針については、元の公開されたRNAscopeプロトコル¹⁴を参照してください。
3. RNAscope HiPlex Amp 1–3およびHiPlex Fluoro T1-T4試薬をRTに置き、平衡させます。
4. プロテアーゼIII処理済みスライドを使い、プローブ混合物を各組織切片にピペットで50〜100μLずつ移します。ハイブリダイゼーションオーブンに横置き、40°Cで2時間培養します。
5. スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。新しいバッファーでこれを繰り返し、合計2回洗います。
   一時停止点:スライドはACDのRNAscopeプロトコルに記載されている通り、RTの5×SSCバッファに一晩保存できます。この一時停止点を使用する場合、翌朝には1倍の洗浄バッファーで2分間の洗いが必要になることに注意してください。

7. プローブ増幅

注意:スライドに塗布する前に、すべての試薬がRTに平衡されていることを確認してください。

1. スライドにHiPlex Amp1試薬を1〜2滴加え、ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで30分間培養します。スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。これを合計2回洗うまで繰り返します。
2. スライドにHiPlex Amp2試薬を1〜2滴加え、40°Cのハイブリダイゼーションオーブンで30分間インキュベーションします。スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。これを合計2回洗うまで繰り返します。
3. スライドにHiPlex Amp3試薬を1〜2滴加え、40°Cのハイブリダイゼーションオーブンで30分間インキュベーションします。スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。これを合計2回洗うまで繰り返します。
4. スライドにHiPlex Fluoro T1-T4試薬を1〜2滴加え、40°Cのハイブリダイゼーションオーブンで15分間インキュベーションします。スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。これを合計2回洗うまで繰り返します。
5. 各組織切片にHiPlex DAPI試薬を3〜4滴加え、RTで1分間培養します。
6. 吸収性のタスクワイプでスライドの液体を吸い取ってDAPIを除去します。各セクションにすぐに100μLの水基アンチフェードマウンティングメージ(IBEX染色時に使用されるものと同じもの)を加えます。スライドにカバースリップを慎重に置き、気泡を最小限に抑え、マウント媒体を15〜30分乾燥させます。
7. 画像診断に進みましょう。
   一時停止点:マウントスライドは4°Cの暗闇で最大3日間保管できますが、RNA分解を最小限に抑えるために迅速に処理することをお勧めします。

8. 蛍光色体の切断と反復的なRNAハイブリダイゼーション

1. スライドのカバースリップを外すには、4×SSCバッファーに少なくとも30分間RTで浸してください。スライドを完全に新しい4×SSCバッファーに浸して、軽く上下に浸して一度洗ってください。
2. 新しい切断液のアンプルを開け、4×SSCバッファーで希釈して10%の作業用ストックを作ります。
3. スライドを湿った箱に入れ、10%の切断液を3〜4滴加えます。RTで15分間孵育し、その後0.5%のPBSTに2分間完全に浸してスライドを洗います。新しいPBSTでこれを繰り返し、合計2回洗います。
4. RNAscopeパネルの画像サイクル2を進めるために、HiPlexフルオロT5-T8試薬をRTに平衡させます。
5. ハイブリダイゼーションオーブンを起動し、温度を40°Cに設定します。
6. HiPlex Fluoro T5-T8試薬をスライドに加え、40°Cのハイブリダイゼーションオーブンで15分間インキュベーションします。スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。これを合計2回洗うまで繰り返します。
7. スライドの余分な液体を慎重に吸い取ってください。すぐに各セクションに100μLのマウントメディウムを加え、スライドにカバースリップを慎重に置きます。マウント媒体を15〜30分乾燥させてからイメージングに進みます。
8. 適切な場合は、HiPlexフルオロT9-T12試薬でステップ8.1–8.7を繰り返し、合計3回のRNAスコープサイクルを行います。RNAscope HiPlexプロトコルでは3サイクルが可能ですが、このプロトコルによるタンパク質染色にかかる追加時間がRNAの質に影響を与える可能性があることにご注意ください。したがって、標的となる特定の転写本によっては3サイクルが必ずしも実現可能とは限りません。

9. 画像処理

1. 各ラウンドのRAWファイルを個別に処理し、背景引き算設定、平滑化フィルター、位置調整タイプなどの一貫したパラメータで画像処理を行います。チャネル名は一貫した区切り文字で付けられるべきです(例:サイクル1:CD45 AF532、「:」はサイクルとマーカー/フルオリの区別を成しています)。
2. SimpleITKソフトウェア(https://github.com/niaid/sitk-ibex)を起動し、 SimpleITK>SimpleITK>共通 チャネルを用いたzスタックのアフィン登録のImaris拡張をクリックしてください。
3. 各マルチプレックスサイクルから1つの画像ファイルをアップロードし、すべての指定されたチャネルの区切り文字(例:「)を入力してください。
4. 画像登録に使用するチャンネルと、他のすべての画像がアライメントされる固定画像を選択します。基準マーカーとしてDAPIを使用することが推奨されますが、すべてのサイクル間で共通の名前付きチャネルを使用可能です。
5. 「登録」をクリックし、その後「結合画像をサンプリングして保存する」といった意見を選んでください。
6. 選んだソフトウェアで下流の分析に進みましょう。画像処理および登録に関する詳細は、元のIBEXプロトコル^12,13を参照してください。

結果

図1:Bex-Plexのワークフロー概要。
クローム明盤コーティングスライドに切開した固定凍結組織は、標準的なIBEXを最大3サイクル受け、その後RNAScope HiPlexを最大3サイクル行います。ここでは、最初のターゲット採取を60°Cで1時間にわたり実施します。別々のサイクルからの画像は登録され、基準マーカー(例:DAPI)を用いて整合させ、下流解析用の多重データセットを作成します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

上記のプロトコルを用いて、マウス膵管腺腺癌(PDAC)モデルの腫瘍微小環境(TME)を...

ディスカッション

Bex-Plexのワークフローは、反復的タンパク質染色プラットフォームIBEXとRNAscope のin situ ハイブリダイゼーションを統合し、単一細胞分解能でタンパク質とRNA転写産物を同時に検出することを可能にします。このプロトコルの主な目的は、完全な組織内でタンパク質とRNA発現の統合空間解析を再現可能な方法を提供することです。同じ組織内でタンパク質とRNAの両方の発現を測定する能力は、これまで技術的な課題を抱えてきました。高コスト、複雑な抗原回収手順、限られたマルチプレックス容量、分解能の制限(非単一細胞)、非線形シグナル増幅、そして下流処理のための広範なバイオインフォマティクスパイプライン( ^17,18,19)。既存の手法である多重免疫蛍光、OPAL/TSA染色、空間トランスクリプトミクスプラットフォームと比較して、Bex-Plexは再現可能で定量的かつ高プレックスの同時検出を可能にしつつ、空間的文脈と核形態を保持し、正確な画像整合を実現します。さらに、Bex-Plexは標準的な実験室環境で実行でき、単一セル解像度で...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retreival reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023