Bex-Plexは、タンパク質マーカーとリボ核酸転写産物を同時に可視化し、完全な組織の深い空間プロファイリングを可能にします

Summary

ここでは、反復的タンパク質染色(IBEX)とRNAscope インシチュそのハイブリッド 化技術を組み合わせ、高解像度空間プロファイリング応用のための完全な固定凍結組織の深層表現型解析のためのプロトコルを提示します。

Abstract

ここでは、完全な組織において単一細胞分解能でタンパク質およびリボ核酸(RNA)マーカーの同時空間プロファイリングを可能にするプロトコルを提示します。固形腫瘍がんを取り巻く核心的な問題の一つは、治療介入に対する患者の反応を予測できないことです。これらの複雑さを解読するには、保存状態の完全な組織内の細胞挙動、相互作用、表現型の定量的測定が必要です。具体的には、プロテオームとトランスクリプトームは重複しつつ冗長でない情報を提供し、合理的な免疫療法の設計に不可欠となり得ます。しかし、現時点では、腫瘍微小環境内のすべての細胞の転写状態と機能状態の両方を詳細にプロファイリングしつつ、重要な空間的局在情報を保持する単純かつコスト効率の高い方法はありません。この目的のために、IBEX(反復漂白拡張多重性)プラットフォームとHiPlex RNAscopeを組み合わせることに成功し、高プレックスタンパク質マーカーと高プレックスリボ核酸(RNA)転写産物を単細胞分解能で同時に可視化しました。このアプローチは、核形態を保存し、サイクルを通じた正確な画像整合を可能にするために修正されたRNAターゲット回収ステップを組み込んでいます。「Bex-Plex」は、固定された凍結組織に対して修正されていないIBEXプロトコルを実行し、その後HiPlex RNAscopeプロトコルを用い、修正RNAターゲットを用いてIBEXサイクルとの核レベルの整合を保証します。このプロトコルは固定凍結組織に最適化されており、転写および機能細胞状態の統合的な空間解析を可能にします。この単一細胞レベルでのプロファイリングの力は、組織自体に関する深い情報源を提供するだけでなく、治療反応性を駆動する微妙な細胞相互作用の予測を可能にし、腫瘍微小環境や関連システムの空間生物学を研究するための枠組みを提供します。

Introduction

2011年の導入以来、PDL-1やCTLA-4などの阻害性免疫チェックポイント分子を遮断して細胞傷害性T細胞の抑制を抑制するがん免疫療法が、固形^{腫瘍治療の}ゴールドスタンダードとして台頭しています。しかし、患者への大規模な使用にもかかわらず、これらの薬剤の臨床効果は大きく異なります。なぜなら、多くの固形腫瘍がんはこれらの治療法に本質的に現れるか、最終的には耐性を生じさせるからです²。多くの場合、これは同じがん³型でも非常に多様な固形腫瘍の性質によるものです。固形腫瘍における細胞関係をより深く理解することが、より良い治療法を生み出す鍵となります。したがって、この抵抗性を支え、維持する正確なメカニズムと相互作用を特定することががん研究の最前線にあります。ここでは、完全な組織内でタンパク質とRNA発現を統合的に空間解析し、これらの複雑な細胞相互作用をよりよく特徴づける方法の開発を目指しています。

腫瘍微小環境(TME)は、腫瘍の成長や免疫応答を形作る非がん性の細胞および構造的要素で構成されており、がん関連の線維芽細胞、浸潤免疫細胞、血管成分、細胞外マトリックス^4を含みます。近年、TMEの組成と組織が腫瘍が免疫浸潤に対して許容されるか耐性かに強く影響することが明らか^{になりました。これは}免疫療法への反応性を左右する主要な要因の一つです。多くのがんでは、T細胞数が少なく、免疫抑制性の高い骨髄集団が存在することが特徴の「免疫砂漠」表現型が、チェックポイント遮断療法への応答性低下と相関^{しています。}ケモカインシグナル伝達は、これらのリクルート動態の多くを支配しています。例えば、CXCL1およびCCL2は免疫抑制性骨髄細胞を引き寄せ、CXCR3-CXCL9/CXCl10軸は細胞傷害性および調節性T細胞の両方を腫瘍8に誘導^します。したがって、ニッチ特異的なシグナル伝達環境は細胞の表現型や機能に強い影響を与えます。例えば、大腸がん患者では、CCL5-CCR5軸が腫瘍関連マクロファージ(TAM)の抑制機能を制御し、このシグナルを遮断することでTAMが抗腫瘍性表現型に偏り、臨床反応の改善と相関^します。さらに、免疫細胞、がん関連線維芽細胞、および/または腫瘍細胞間のICAMおよびPDL-1による直接的な相互作用は、免疫の疲弊を誘発し、抗腫瘍免疫を鈍らせる可能性があります¹⁰。これらの発見は、TMEが治療効果にどのように影響するかを理解するために空間的に解析される重要性を強調しています。

免疫蛍光(IF)イメージングは、組織内のタンパク質発現および細胞間相互作用を可視化するための基礎的な手法として依然として存在しています。この分野は従来の3-4色間欠条線から、反復染色とイメージングに依存する高成分イメージングワークフローへと進化しています。これらの方法では、抗体標識、画像処理、蛍光色素の不活化または除去を繰り返し行って大規模なデータセットを作成し、追加のマーカーを染色・^{イメージングできます}。最近、使いやすくコスト効率の良い反復イメージングプラットフォームとして導入された反復的イメージングプラットフォーム¹²。市販抗体や従来の顕微鏡の使用と互換性があり、IBEXは主に使用される色素の蛍光を消光するために、組織エピトープを損傷することなくリチウムホウ水素化物(LiBH₄)を用い、単一の組織¹³に対して最大75のパラメータを取得することを可能にします。このサイクリックステインから得られた画像は、SimpleITKのオープンソースソフトウェアを用いてアラインメントされ、高次元空間解析に適した複合データセットが作成されます。

タンパク質レベルの表現型解析を補完する空間的トランスクリプトミクス手法は、細胞の原生環境における転写状態に関する貴重な情報を提供します。特に、インシチュハイブリダイゼーション(ISH)は^{特定の組織内の}DNAまたはRNA配列の局在を特定するための人気のある手法です。RNAscopeは独自のZ化学反応を持つプローブを用いてRNA転写産物を単一分子分解能で特異的に増幅する確立されたISH手法であり、多くの異なるサンプルタイプに適合しています¹⁴。Advanced Cell Diagnostics(ACD)を通じて広く採用され商業的に利用されているプラットフォームとして、RNAscopeは多様な標的に対する検証済みプローブを提供し、多様な応用に向けた実験設計を簡素化します。

同じ組織内でタンパク質とRNA検出を組み合わせることで、細胞の同一性と機能をより完全な理解を得ることができます。サイトカインやケモカインのような短命な分泌タンパク質は、伝統的にIHCによる信頼できる抗体染色ができませんが、mRNA転写本の定量化を通じて発現に関する情報を得ることができます。従来の染色性IHCやTSA-OPALのようなRNAとタンパク質の共検出の試みは、非線形シグナル増幅や時間のかかる抗原回収プロトコルによって制限されてきました¹⁵。これらの手法と比較して、ベックスプレックス法は空間的文脈と核形態を保持しつつ、高プレックスタンパク質とRNAの同時検出を可能にし、正確な画像登録を実現します。

ここでは、「Bex-Plex」を紹介します。これはIBEXとRNAscopeプラットフォームを統合し、細胞の原生組織内の転写および翻訳状態を同時に定量的に特徴付けるプロトコルです。Bex-Plexでは、固定OCT埋め込み組織が標準的なIBEXプロトコルを経て、わずかに修正されたRNAscope HiPlexワークフローを経て、標的回収は60°Cで1時間のインキュベーション時間で行われます。これは元の99°Cの5分間インキュベーションから大きく異なります。これにより核の構造が保たれ、IFおよびISHサイクルの別々の画像を一つに記録する際にフィデューシャルマーカーの正確な整列が可能になります。このプロトコルは、組織の利用可能性が限られている場合や空間構造の保存が重要な腫瘍微環境解析や免疫プロファイリング研究など、タンパク質とRNA発現の同時空間解析が必要な研究に最適です。

広く入手可能な試薬を使用し、ほとんどのイメージングプラットフォームに対応しているため、蛍光イメージングに精通し、従来の顕微鏡にアクセスできる技術訓練を受けた研究者なら誰でも実施可能です。ここで提示されるプロトコルは、固定凍結サンプル向けに最適化されています。現在、このプロトコルは固定凍結組織で検証されており、FFPEやヒト臨床標本など他のサンプルタイプへの適用にはさらなる最適化が必要となる場合があります。

このワークフローは、組織生検やサンプル数が限られている動物実験など、組織が限られたまたは貴重な状況、また解離技術で抽出が難しい可能性のある細胞の表現型解析においても非常に貴重です。Bex-Plexは、単一細胞の転写および翻訳プロファイルに関する同時かつ定量的な情報を提供しつつ、その空間的文脈を保持しつつ、元の環境における細胞間の関係性やクロストークに関する疑問に独自に答えるデータを提供します。

Protocol

このプロトコルで示された手順は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の施設動物ケア・利用委員会(プロトコル番号S24049)によって承認されました。これらの実験には、C57BL/6遺伝子背景を持ち、特定の病原体なし条件下で飼育された生後7〜12週齢のオスとメスのマウスが用いられました。

1. 組織調製

1. 実験マウスを承認された一次および二次手段(例:_CO2 安楽死や子宮頸部脱臼)で安楽死させ、関心のある組織を補足培地に収穫します。
2. 4%のパラホルムアルデヒド(PFA)ストック溶液を1X PBSに0.5%または1%PFAに希釈して、新しい組織固定液を準備します。リンパ節などの低容量組織には0.5%のPFA、腫瘍のような高容量組織には1%のPFAを使用してください。
   注意:パラホルマルデヒドは可燃性で、摂取または飲み込むと有毒です。適切なPPEを着用し、皮膚や目に触れないようにしてください。
3. 組織を24ウェルプレートに移し、1ウェルごとに2mLの固定液を投与し、4°Cで一晩培養します。
   注意:16時間を超える潜伏時間は過剰固執の問題を引き起こす可能性があります。
4. 新しい24ウェルプレートのウェルに1XPBSを充填し、固定プレートから組織を移します。
   停止点:必要に応じて、組織を1XのPBSで4°Cで最大7日間保存できます。
5. 解剖用スコープと工具を使って、組織から余分な脂肪や破片を一つずつ切り取ってください。トリミング中に組織脱水を防ぐために、1XのPBSを少量直接組織に加えます。
6. 粉末のショ糖ストックを1XPBSで薄めて、30%のw/vショ糖溶液を準備します。
7. 組織を24ウェルプレートに移し、1ウェルあたり2mLの30%ショ糖を含み、4°Cで一晩培養して脱水させます。組織は井戸の底に沈むと十分に脱水状態です。
8. ラベル付きのクライオモールドにOCTを入れ、組織を一つずつモールドに入れます。組織の向きは起源によって異なりますが、標準的な推奨では、最大の表面積はクリオモルドの底面と平行であることが推奨されます。組織がOCTに完全に浸かっていることを確認してください。
9. ドライアイスに10分間置いて冷凍し、-80°Cで保存します。

2. 組織切片

注:本プロトコルで使用されるすべての試薬および実験材料はRNaseフリーでなければなりません。スライドを扱う際は汚染防止に注意してください。

1. RNaseフリー顕微鏡スライドに15μLのクロムアルム接着剤を塗り、オーブンで60°Cで1時間培養します。クロームアルムコーティングされたスライドは、使用前に最大1か月間室温(RT)で保存できます。
2. OCT埋め込み組織を-80°Cの冷凍庫から取り出し、-20°Cのクライオスタット/クライオトームに入れて少なくとも20分間平衡させます。
3. 10〜15μmの厚さでクロムアルムコーティングされたスライドに組織を切開します。
4. 切断した断片が入ったスライドは4°Cで保存するか、同日に染色する場合はスライドをRTに平衡させて保存します。断面スライドは使用前に最大5日間4°Cで保存可能です。

3. タンパク質染色

1. ダンクタンクで、染色用のスライドをRNaseフリーの1X PBSに5分間浸して、組織から余分なOCTを除去します。
2. 疎水性のバリアペンを使ってスライドの組織の周りに箱を描き、2分間乾かします。
3. RNaseフリー1X PBS中に10μg·mL⁻¹ 抗マウスFC受容体ブロックのブロッキング溶液を製製します。スライド上のサンプルにブロッキングバッファーを加え、組織全体を覆う気泡を作る(100–150 μL·^section-1)を使用します。
   注:困難な組織やマーカーの場合、ブロッキングバッファにFBSやBSA(通常1〜2%)を加える必要がある場合もあります。
4. スライドはRTで湿度の高いステインボックスで1時間孵化し、その後RNaseフリーの1X PBSを入れたタンクに完全に浸して5分間洗い流します。
5. RNaseフリー1X PBSで一次抗体染色溶液を準備し、1組織切片あたり100〜200μLを計画します。標準的な抗体希釈は1:50〜1:200の範囲ですが、特定の抗体や組織タイプに最適な希釈因子を特定するために単一染色滴定を行うことが推奨されます。ボルテックスとパルスで抗体を回転させてピペット処理し、蛍光凝集体を防ぎます。
6. 洗浄液からスライドを取り出し、サンプルボックスの隅にある余分な液体を吸収性タスクワイプで優しく吸い取って抗体溶液を希釈しないようにします。
7. 抗体溶液をブロッキング溶液と同じ方法で塗布し、組織の上に泡を作ります。
8. スライドを37°Cのオーブンに水平に置き、1時間キュベートします。または、湿度の高い箱でRTで3〜4時間スライプします。目的の組織に最適化された標準的なIFプロトコルが使用されることがあります。潜伏中は乾燥した環境でスライドを保管し、脱水を防ぎましょう。(例:染色トレイの底に濡れたペーパータオルを使います)。
9. スライドを洗うためにRNaseフリーの1X PBSを2分間浸して洗います。これを2回繰り返し、合計3回洗います。染色パネルに必要な場合は、この期間中にRNaseフリー1X PBSの二次抗体染色溶液を準備してください。標準的な抗体希釈は1:500〜1:1000の範囲ですが、特定の抗体や組織タイプに最適な希釈因子を特定するために単一染色滴定を行うことが推奨されます。
10. 吸収性タスクワイプで余分なPBSをスライドから除去し、各組織切片に100〜200μLの二次抗体染色液を加えます。スライドを37°Cのオーブンに水平に置き、30分間孵化させます。または、湿った箱でRTで1〜2時間染色することも可能です。
11. スライドを1XRNaseフリーPBSに2分間浸して洗いましょう。これを2回繰り返し、合計3回洗います。
12. DAPI核染料を最終濃度0.2 μg·mL⁻¹ に薄め、RNaseフリー1X PBSに浸し、各組織切片に100〜200 μLを加えます。
13. 湿度の高い箱でRTで10分間スライドし、その後RNaseフリーの1X PBSを浸して軽く上下に浸して洗浄します。
14. 吸収性タスクワイプで余分な液体を除去し、各セクションに20〜30μLの水基アンチフェードマウンティングメディウムを加えます。スライドにカバースリップを慎重に置き、気泡を最小限に抑え、マウント培地を15〜30分硬化させます。
15. 汚れたスライドをイメージしてください。IBEXのパネル設計および画像取得に関するより詳細な説明については、元のIBEXプロトコル^12,13を参照してください。
    一時停止:マウントスライドは4°Cの暗闇で最大3日間保管しますが、RNA分解を最小限に抑えるために直ちに作業を行うことをお勧めします。

4. 蛍光色素漂白および反復タンパク質染色

1. スライドをRNaseフリーの1X PBSに浸し、カバーの滑りが力をかけずに簡単に滑り落ちるまで浸します。カバースリップが取り付けられている時間によっては、最大で16時間かかることもあります。
2. スライドを浸している間、LiBH₄をRNaseフリーのDI₂Oに溶かすまで1mg·mL^⁻1 溶液を優しく混ぜて10分間活性化を待ちます。溶液中に気泡が存在すると活性化が起こり、活動は最大4時間持続します。
   注意:LiBH₄ は水に反応するため、粉末ストックの過剰な水分曝露を避け、適切に廃棄物を適切に処理してください。
3. スライドをRNaseフリーの1X PBSで2分間洗浄し、埋め物残留物を除去した後、各組織に100〜150μLのLiBH_溶液 をピペットで塗布します。湿度の高い箱で15分間孵化させます。
   注:染色に使用される蛍光素によっては、この培養時間を延長する必要がある場合があります(IBEX方法論文で詳しく議論されています)^12,13。
4. スライドを一度洗い、RNaseフリーの1X PBSに浸して軽く上下に浸してください。
5. ステップ3.5-3.15に従って追加のタンパク質マーカーでスライドを染色します。_LiBH4では漂白されないため、核染料の再染色は必要ありません。必要に応じてタンパク質染色を繰り返してください。
   一時停止点:マウントスライドは4°Cで一晩保存し、その後最後のタンパク質/IBEXサイクルを漂白しRNAに進めます。
6. 最終サイクルの蛍光色素を漂白した後、すぐにRNAscope HiPlexに進みます。標準的なIBEXは最大6サイクル、組織やエピトープの損失なしに実施されていますが、このプロトコルではRNA転写物の質が長期間低下する可能性があるため、3サイクルを超えることは推奨しません。

5. RNAscope HiPlexのスライド準備

1. スライドをRNaseフリーの1X PBSに完全に浸し、カバースリップが力をかけずに簡単に滑り落ちるまで続けます。カバースリップが取り付けられている時間によっては、最大で16時間かかることもあります。RNaseフリーの1X PBSで2分間洗い、埋め物の残留物を除去します。
2. 50%エタノール200mL、70%エタノール200mL、100%エタノール400mLを準備します。
3. ハイブリッドオーブンを起動して60°Cに設定します。 10倍ターゲット回収試薬をRNaseフリーDI_{H 2O}で1倍の作動ストックに希釈し、ステップ5.8までオーブンで予温します。
   注:ターゲット回収試薬を60°Cまで予温しないと、別々のサイクルからの画像の下流登録に影響が出ます。標的回収試薬は回収ステップの間、60°Cの温度を維持しなければなりません。
4. スライドを50%エタノールに浸します。RTで5分間孵化してください。
5. スライドを50%エタノールから取り出し、70%エタノールに浸します。RTで5分間孵化してください。
6. 70%エタノールからスライドを取り出し、100%エタノールに浸します。RTで5分間培養し、新鮮な100%エタノールで繰り返します。
7. 100%エタノールのスライドを取り外し、RTで5分間乾燥させます。
8. 各組織切片に60°C 1Xターゲット回収試薬100–150μLを加え、スライドをハイブリダイゼーションオーブンに入れます。60°Cで1時間培養します。
9. スライドを取り出し、RNaseフリーのDI水に15秒間浸してすすぎます。この時点で、オーブンの設定温度を40°Cに変えます。
10. スライドを100%エタノールに移し、5分間培養し、その後RTで最低5分間乾燥させます。
11. プロテアーゼIIIをスライドに1〜2滴ずつ塗布します。スライドをハイブリダイゼーションオーブンに入れ、40°Cで30分間培養します。
12. スライドをRNaseフリーのDI_{H 2}Oに浸し、上下に軽く浸して洗います。新鮮な蒸留水で合計2回洗うのを繰り返します。

6. RNAscope試薬の調製およびプローブハイブリダイゼーション

1. RNAscope HiPlexプローブのストックとHiPlexプローブの希釈剤は、オーブンまたは水浴で40°Cまで10分間温めて準備します。
2. 短時間、すべての50倍プローブストックをパルスス回転でダウンさせます。RNAscopeプローブ希釈剤で各ユニークなターゲットプローブを1倍に希釈して作動するプローブ混合物を準備します。組織ごとに50〜100μLのプローブ混合物を使用し、使用前に渦を巻いてよく混ぜる計画を立ててください。RNAscope HiPlexプロトコルは、4本のプローブ(合計12本、T1-12と表記)を3サイクルまで対応可能です。プローブ設計の指針については、元の公開されたRNAscopeプロトコル¹⁴を参照してください。
3. RNAscope HiPlex Amp 1–3およびHiPlex Fluoro T1-T4試薬をRTに置き、平衡させます。
4. プロテアーゼIII処理済みスライドを使い、プローブ混合物を各組織切片にピペットで50〜100μLずつ移します。ハイブリダイゼーションオーブンに横置き、40°Cで2時間培養します。
5. スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。新しいバッファーでこれを繰り返し、合計2回洗います。
   一時停止点:スライドはACDのRNAscopeプロトコルに記載されている通り、RTの5×SSCバッファに一晩保存できます。この一時停止点を使用する場合、翌朝には1倍の洗浄バッファーで2分間の洗いが必要になることに注意してください。

7. プローブ増幅

注意:スライドに塗布する前に、すべての試薬がRTに平衡されていることを確認してください。

1. スライドにHiPlex Amp1試薬を1〜2滴加え、ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで30分間培養します。スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。これを合計2回洗うまで繰り返します。
2. スライドにHiPlex Amp2試薬を1〜2滴加え、40°Cのハイブリダイゼーションオーブンで30分間インキュベーションします。スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。これを合計2回洗うまで繰り返します。
3. スライドにHiPlex Amp3試薬を1〜2滴加え、40°Cのハイブリダイゼーションオーブンで30分間インキュベーションします。スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。これを合計2回洗うまで繰り返します。
4. スライドにHiPlex Fluoro T1-T4試薬を1〜2滴加え、40°Cのハイブリダイゼーションオーブンで15分間インキュベーションします。スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。これを合計2回洗うまで繰り返します。
5. 各組織切片にHiPlex DAPI試薬を3〜4滴加え、RTで1分間培養します。
6. 吸収性のタスクワイプでスライドの液体を吸い取ってDAPIを除去します。各セクションにすぐに100μLの水基アンチフェードマウンティングメージ(IBEX染色時に使用されるものと同じもの)を加えます。スライドにカバースリップを慎重に置き、気泡を最小限に抑え、マウント媒体を15〜30分乾燥させます。
7. 画像診断に進みましょう。
   一時停止点:マウントスライドは4°Cの暗闇で最大3日間保管できますが、RNA分解を最小限に抑えるために迅速に処理することをお勧めします。

8. 蛍光色体の切断と反復的なRNAハイブリダイゼーション

1. スライドのカバースリップを外すには、4×SSCバッファーに少なくとも30分間RTで浸してください。スライドを完全に新しい4×SSCバッファーに浸して、軽く上下に浸して一度洗ってください。
2. 新しい切断液のアンプルを開け、4×SSCバッファーで希釈して10%の作業用ストックを作ります。
3. スライドを湿った箱に入れ、10%の切断液を3〜4滴加えます。RTで15分間孵育し、その後0.5%のPBSTに2分間完全に浸してスライドを洗います。新しいPBSTでこれを繰り返し、合計2回洗います。
4. RNAscopeパネルの画像サイクル2を進めるために、HiPlexフルオロT5-T8試薬をRTに平衡させます。
5. ハイブリダイゼーションオーブンを起動し、温度を40°Cに設定します。
6. HiPlex Fluoro T5-T8試薬をスライドに加え、40°Cのハイブリダイゼーションオーブンで15分間インキュベーションします。スライドを1倍のウォッシュバッファーに完全に浸して2分間洗います。これを合計2回洗うまで繰り返します。
7. スライドの余分な液体を慎重に吸い取ってください。すぐに各セクションに100μLのマウントメディウムを加え、スライドにカバースリップを慎重に置きます。マウント媒体を15〜30分乾燥させてからイメージングに進みます。
8. 適切な場合は、HiPlexフルオロT9-T12試薬でステップ8.1–8.7を繰り返し、合計3回のRNAスコープサイクルを行います。RNAscope HiPlexプロトコルでは3サイクルが可能ですが、このプロトコルによるタンパク質染色にかかる追加時間がRNAの質に影響を与える可能性があることにご注意ください。したがって、標的となる特定の転写本によっては3サイクルが必ずしも実現可能とは限りません。

9. 画像処理

1. 各ラウンドのRAWファイルを個別に処理し、背景引き算設定、平滑化フィルター、位置調整タイプなどの一貫したパラメータで画像処理を行います。チャネル名は一貫した区切り文字で付けられるべきです(例:サイクル1:CD45 AF532、「:」はサイクルとマーカー/フルオリの区別を成しています)。
2. SimpleITKソフトウェア(https://github.com/niaid/sitk-ibex)を起動し、 SimpleITK>SimpleITK>共通 チャネルを用いたzスタックのアフィン登録のImaris拡張をクリックしてください。
3. 各マルチプレックスサイクルから1つの画像ファイルをアップロードし、すべての指定されたチャネルの区切り文字(例:「)を入力してください。
4. 画像登録に使用するチャンネルと、他のすべての画像がアライメントされる固定画像を選択します。基準マーカーとしてDAPIを使用することが推奨されますが、すべてのサイクル間で共通の名前付きチャネルを使用可能です。
5. 「登録」をクリックし、その後「結合画像をサンプリングして保存する」といった意見を選んでください。
6. 選んだソフトウェアで下流の分析に進みましょう。画像処理および登録に関する詳細は、元のIBEXプロトコル^12,13を参照してください。

Results

図1:Bex-Plexのワークフロー概要。
クローム明盤コーティングスライドに切開した固定凍結組織は、標準的なIBEXを最大3サイクル受け、その後RNAScope HiPlexを最大3サイクル行います。ここでは、最初のターゲット採取を60°Cで1時間にわたり実施します。別々のサイクルからの画像は登録され、基準マーカー(例:DAPI)を用いて整合させ、下流解析用の多重データセットを作成します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

上記のプロトコルを用いて、マウス膵管腺腺癌(PDAC)モデルの腫瘍微小環境(TME)をプロファイリングしました(図1)。Kras^LSL-G12D/+から分離された腫瘍株;Trp53^L/+;Pdx1-Cre; 膵臓がんを自然発生させ、ヒトPDACの多くの主要特徴を再発させるRosa26 YFP/YFP(KPCY)マウスは、C57BL/6マウス⁷の脇腹に皮下注射されました。腫瘍携帯マウスには、着床後10日目に抗^PD1(ip.200μgマウス^-1、RMP1-14)および抗CTLA-4(ip.200μgマウス¹、9H10)を組み合わせて投与し、実験エンドポイントまで3日ごとに継続した。作動性抗CD40薬(ip.1、100μg•マウス^-1、FGK45)は、着床後13日目に単回投与されました。これをまとめて「FPC」と呼びます。以前に発表された通り7,16。各実験群につき3つの腫瘍が着床後16日目に採取され、Bex-Plex用にクロームアルムコーティングされたスライドに固定凍結切片が装着されました。

図2:代表的なIBEX + RNAscope(Bex-Plex)結果。
(A) 膵管腺癌(PDAC) 腫瘍切片におけるIBEXとRNAscopeの結合染色は、タンパク質およびRNA標的の共検出および蛍光チャネルの整列を示しています。スケールバー、10μm(B) タンパク質マーカーチャネルの強度に基づくT細胞(CD3+ CD11b-)、マクロファージ(CD11b+ CD68+)、および骨髄系(CD11b+ CD68- Ly6G +/-)の免疫区画の定量化。グラフは処理群ごとの平均細胞密度(n=3腫瘍)を示しています。(C) タンパク質によって既に同定された免疫区画内の Pdl1 および Il10 転写産発現細胞の定量化。グラフは治療群ごとの平均細胞密度を示しており、n=3の腫瘍です。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1回のタンパク質染色サイクルが、FPC処理腫瘍3例とアイソタイプ治療腫瘍3例に対して行われ、治療群間の骨髄系譜細胞への影響を評価しました。7つのパラメータを取得しましたが、ここでは注目すべきマーカー3つに注目します:CD11b、Ly6G、CD68(図2A)。画像取得後、タンパク質染色による蛍光体を漂白し、 Il10 および Pdl1 に対するプローブを用いたRNAスコープ検査を1回実施しました(図2A)。その後、DAPIを基準値として別々の画像を整列しました(図2A)。CD11b、CD68、Ly6G、CD3の定量平均蛍光強度は、FPC治療腫瘍において対照群に比べてマクロファージおよび骨髄細胞が減少する傾向を示しました(図2B)。すべてのサンプルで定量比較が行われ、データは平均値として提示されています。さらに、マクロファージおよび骨髄細胞区画の両方で Pdl1、 Il10、または両方の転写産物を発現する細胞数は、FPC処理で対照群に比べて減少傾向を示しました(図2C)。これらの結果は、治療後に免疫抑制細胞群が減少する可能性があり、期待される生物学的反応と一致していることを示しています。

図3:核保存のためのターゲット回収条件の最適化。
(A) RT標的回収後の組織の代表画像で、核の腫れと形態の不明瞭さを示す。核の大きさの例は黄色の輪郭で示されています。スケールバー、40μm 。(B) 修正ターゲット回収後の組織代表画像で、温度条件の調整により核形態が改善されました。核の大きさの例は黄色の輪郭で示されています。スケールバー、40μm (C) TDIターゲット回収(予温化なし)、60°C予熱ターゲット回収、または標準IF条件下で標的回収なしの組織に対してDAPIに基づくセグメントによる平均核体積。グラフバーは平均を示し、誤差バーは標準偏差を示します。P < 通常の一方向ANOVAで0.0001(アスタリスクは統計的有意閾値を示します);n=1639セルが各条件につき。(D) 画像アライメント前後の3枚の画像間の相関スコアを表すヒートマップ。相関スコアは、核レベルでの違いにより一致しなかった登録と一致しなかった登録に対して示されます。

重要なのは、修正標的回収を行わずにBex-Plexを実施した場合、修正標的回収が正しく行われた組織の核と比べて、核が拡大し縁が曖昧に見えたという点 です(図3A および B)。室温ターゲット回収レジェントの使用により、60°Cに予温された試薬を用いた標的回収と比較して、DAPI染色に基づく平均核体積が33%増加しました (図3C)。DAPIに基づくセグメンテーションを用いて、サンプル間の代表的なフィールドから核体積測定を得ました。さらに、この工程を60°Cで予温化された回収試薬を用いて行った場合、標準IF染色後の平均核体積と有意な差はありません でした(図3C)。DAPIは画像アライメントの参照として最も効果的なパラメータであるため、この比較(図3)は 、核形態を保存するために修正された回収パラメータの重要性を強調しています。正しい画像登録は、異なるサイクルの画像間の類似性を示すアラインメント相関スコアが1に近いことで示されます(図3D、 前対成功の前)。

プロトコルの成功した実装は、核形態の保存、強力かつ特異的なRNAシグナル、タンパク質およびRNAチャネルの正確なアラインメントによって示されます。一方、最適でない結果には核の歪み、弱いまたは拡散したRNA信号、画像サイクル間のずれ(図3D、失敗前と失敗時)が含まれることがあります。 図3Cに示すように、核の形態はプロトコル全体を通じて保持され、質的にも量的にも明らかになります。Bex-Plex導入前に、ユーザーはタンパク質とRNA を別々 に染色することで、対象組織のグラウンドトゥルースを確認する必要があります。これにより、標的組織のタンパク質およびRNA染色が最適化されるだけでなく、Bex-Plexで結合しても保持すべき関連空間パターンが得られます。例えば、CD11bはCD68およびLy6Gと共局在し、細胞膜局在染色を示します(図2A)。これは予想されます。CD11bは汎骨髄細胞マーカーであり、CD68とLy6Gはマクロファージおよび好中球骨髄系サブセットのマーカーです。RNA検出が成功する場合、個々の細胞に局在する明確な点状シグナルが特徴ですが、最適でない結果は弱い染色や拡散性として現れることがあります。RNAプローブシグナルは転写産物の機能に応じて、核内外で局在を示すはずです。ビメンチンのような構造的タンパク質マーカーを組み込むことで、複雑な組織の細胞膜を明らかにすることで転写産物の局在の分解能を向上させることができます。陰性または対照サンプルでは、背景染色が最小限で非特異的なプローブ信号が見られず、タンパク質およびRNA検出の特異性が確認されます。

Discussion

Bex-Plexのワークフローは、反復的タンパク質染色プラットフォームIBEXとRNAscope のin situ ハイブリダイゼーションを統合し、単一細胞分解能でタンパク質とRNA転写産物を同時に検出することを可能にします。このプロトコルの主な目的は、完全な組織内でタンパク質とRNA発現の統合空間解析を再現可能な方法を提供することです。同じ組織内でタンパク質とRNAの両方の発現を測定する能力は、これまで技術的な課題を抱えてきました。高コスト、複雑な抗原回収手順、限られたマルチプレックス容量、分解能の制限(非単一細胞)、非線形シグナル増幅、そして下流処理のための広範なバイオインフォマティクスパイプライン( ^17,18,19)。既存の手法である多重免疫蛍光、OPAL/TSA染色、空間トランスクリプトミクスプラットフォームと比較して、Bex-Plexは再現可能で定量的かつ高プレックスの同時検出を可能にしつつ、空間的文脈と核形態を保持し、正確な画像整合を実現します。さらに、Bex-Plexは標準的な実験室環境で実行でき、単一セル解像度でデータを生成し、処理が容易です。このプロトコルを活用して、腫瘍微小環境など多様な組織環境における細胞間相互作用の包括的な理解を得ることは、より効果的な免疫療法の開発や疾患状態を超えた患者の転帰改善に不可欠です。

本法はOCTに埋め込まれた固定組織で実施され、標準的なIBEXワークフローを修正せずに従います。その後、若干変更されたRNAscope HiPlexプロトコルが適用されます。重要な違いは、RNAハイブリダイゼーションのワークフロー開始時のターゲット回収ステップです。製造元の99°Cを5分間使用するのに対し、回収は60°Cで1時間持続します。この調整により、タンパク質とRNAサイクル間の正確な画像整合に不可欠な核構造が維持されます。このプロトコルの重要なステップには、一定のターゲット回収温度の維持、LiBH₄を用いた効率的な蛍光色分離、迅速な処理とRNaseフリー試薬の使用によるRNA分解の最小化が含まれます。60°Cで予備加熱済みの標的回収試薬を使用することが最も重要です。これを怠ると、培養段階が変わっても核膨張を引き起こす可能性があります。

LiBH₄ での15分間の培養で多くのよく使われる蛍光色素を不活化することが示されていますが、Bex-Plexプロトコル全体を実行する前に、各タンパク質サイクルごとに個別にこのプロセスを検証することが推奨されます。IBEXの初期論文では、すべてのIBEX互換蛍光球が同じ^{ように漂白}可能ではないことがよく特徴付けられています。さらに、私たちの研究室では、ビメンチンのような高濃度構造マーカーには漂白時間がかかることがあると観察しています。使用されている蛍光色素とマーカーの組み合わせが十分に漂白できることを確認することで、残留シグナルが後のタンパク質およびRNAサイクルに流出するのを防ぐことができます。IBEXコミュニティページにはIBEX互換パネル設計に関する優れたリソースがあり、抗体効果と蛍光色素漂白の²⁰倍を示すことで新規ユーザーの負担軽減を目的としています。さらに、反復染色や漂白はRNA転写物の質に影響を与えるべきではありませんが、タンパク質サイクルをできるだけ早く完了し、RNAsフリー試薬を使用することで、時間経過によるRNA分解を最小限に抑えることが重要です。これを怠るとプローブのハイブリダイゼーションに影響が及び、特に低存在量転写産物においてRNAscopeサイクルのシグナルが低下します。プロトコル中によく遭遇する問題には、弱いRNA信号、不完全な蛍光色素漂白、イメージングサイクル間のずれがあり、これらは染色条件やイメージングパラメータの最適化によって緩和できます。

タンパク質染色とRNAプローブハイブリダイゼーションの間を5日以内に制限することが不可欠です。複数のスライドでベックスプレックスを行う際は、RNA分解の変動を減らすために一度に1枚ずつスライドを処理することが強く推奨されます。同様に、プローブのハイブリダイゼーションとイメージングの間の時間を制限してください。増幅後最大3日間の画像撮影は成功していますが、長期保存は推奨されません。染色やハイブリダイゼーションの複数サイクル後に信号が減少した場合、プロトコル全体で速度を上げる必要がある場合があります。理想的には、遅延はRNAの完全性を低下させ増幅を低下させる可能性があるため、できるだけ早く作業を行うことを推奨します。他のアプローチとしては、プロトコルのスケジュール制約により容易に合わせるために実行するタンパク質サイクル数を減らしたり、RNAプローブパネルの設計を変更して高存在量ターゲットを含める方法があります。IBEXとRNAscopeを組み合わせる前に、各サイクルごとに抗体パネルとプローブパネルを個別に検証し、各サイクルの期待される信号品質を決定してください。標的回収後に核膨張が起きた場合、標的回収試薬が適切に予熱されていなかった可能性があります。回収試薬を希釈・予温して60^°Cに冷却させず、1時間のオンスライドインキュベーション中は温度が一定に保たれていることを確認しましょう。最後に、核膨張がない状態で画像の登録やアライメントが失敗した場合、それはビット深度、ボクセルサイズ、Z位置などの画像取得パラメータに周期間の不一致があったことを意味します。このような誤りが発生した場合、プロトコルを繰り返し、設定を調整して一貫性を保つ必要がある場合があります。これらのトラブルシューティング戦略は、実験間の再現性と一貫性を確保するために不可欠です。

Bex-Plexが生成するデータは、これまで到達不可能だったレベルの組織の空間的景観を深く把握することを可能にします。しかし、このプロトコルの大きな制約は、時間経過によるRNA分解のため、IBEX単独よりも可能な反復タンパク質サイクルの総数が少ないことです。標準的なIBEXは最大6サイクル実施されていますが、Bex-Plexのタンパク質染色は3サイクルを超えないことを推奨します。それでもプロトコルは最大数のRNAscopeサイクルに対応しており、このレベルのマルチプレックス深度はほとんどの用途で十分です。

その他の制限としては、組織の種類ごとの変動や、信号解釈に影響を与える可能性のある自己蛍光や染色アーティファクトの可能性があります。より脆弱な組織はサイクル数が少なく、異なる組織タイプが染色に影響を与える独自の特徴を持つことがあります。これらの制限は、タンパク質やRNAの単一サイクル染色によって評価され、Bex-Plexを実行する前に対処できます。クロムアルム被覆スライドへの切片は組織の付着力と構造的完全性を大幅に向上させますが、自己蛍光はすべての免疫蛍光技術において考慮すべき点です。さらに、現時点でこのプロトコルはFFPEやヒト臨床サンプルで検証されておらず、これらの応用のためのさらなる最適化が必要です。しかし、IBEXおよびRNAscopeは主にホルマリン固定パラフィン埋め込み組織(FFPE)で行われるため、Bex-Plexはこれらのサンプルタイプに拡張可能です。成功裏の実装には、抗原回帰のさらなる最適化と、場合によっては標的回収ステップの強化が求められ、RNAの質を保つ必要があります。

総じて、Bex-Plexは高プレックス空間分析において、シンプルでコスト効率が高く、広くアクセス可能な方法を提供します。この方法は、腫瘍微環境解析、免疫細胞プロファイリング、シグナル伝達相互作用の空間マッピングなどの応用に特に適しています。この統合的な視点は、免疫調節、腫瘍の異質性、治療応答性のメカニズムを幅広い実験モデルで検証する能力を高めます。Bex-Plexは、腫瘍微小環境や炎症や恒常性の際に他の組織内で起こる細胞間のクロストークを研究する必要がある文脈で非常に貴重です。特に、表現型タンパク質マーカーと組み合わせて短命分子の転写体を探ることでサイトカインシグナルの空間的動態を解明する能力は、疾患状態を超えた細胞相互作用のより深い理解をもたらすでしょう。将来の改善には、多重化能力の増加、自動画像解析パイプラインとの統合、FFPE組織を含むワークフローの拡大による臨床生検サンプルへの適応が含まれる可能性があります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml マイクロ遠心管	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC バッファー	Invitrogen	AM9765
24ウェルプレート
Alexa Fluor 488 抗マウスCD11b抗体	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 抗マウスCD3e抗体	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 抗マウスLy6G抗体	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 抗マウスCD68抗体	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm 固定および透過溶液	BD	554722
クロムアルミニウムゼラチン	Fisher	NC1692262
共焦点顕微鏡（例：Leica Stellaris）
クライオモールド	VWR	25608-922
クライオスタット（例：CryoStar NX50クライオスタット）	Thermofisher Scientific	957100
クライオスタットブレード（例：Leica Low Profile 使い捨てブレードDB80LX）	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
解剖顕微鏡（例：Zeiss SteREO Discovery.V8）
解剖用具
ドライアイス
スライド染色用ダンクタンク（例：Simport Scientific EasyDipスライド染色ジャー）	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
加熱水浴
組織学用ブラシ（例：Ted Pella キャメルヘアブラシ）	Fisher Scientific	NC2023341
ハイブリダイゼーションオーブン（例：HybEZ IIハイブリダイゼーションシステム）	ACD	321710
お好みの画像分析ソフトウェア
ImmEdge 疎水性バリアPAPペン	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
リチウムホウ化物	STREM Chemicals	93-0397
マイクロピペット（P-10、P-20、P-200、P-1000）
ミニマイクロ遠心機（例：Corning LSE ミニマイクロ遠心機）	Corning	6770
マウスBD Fc ブロック	BD	553142
No 1.5 カバーグラス	VWR	48393-241
ピペットチップ（P-10、P-20、P-200、P-1000）
RNAscope HiPlex プローブ、mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex プローブ、mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 試薬キット v2（検出キット、切断ストック溶液、プロテアーゼ試薬、標的取得試薬、および洗浄バッファーを含む）	ACD	324409
RNAscope プロテアーゼ III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITKソフトウェア：https://github.com/niaid/sitk-ibex
スライド染色トレイ/湿度チャンバー
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus 顕微鏡スライド	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20、分子生物学グレード	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNaseフリー水	Fisher Scientific	10977023