自己組織化ヒト心型心肌における低酸素再酸素損傷モデル

サマリー

自己組織化型ヒト心臓オルガノイド(hCOs)は、ヒトの心臓発生や疾患をモデル化するための新興システムです。ここでは、低酸素再酸素化によるhCOの生成および損傷の方法論と、損傷後の予想される組織学的および機能的転帰の詳細を提供します。

要約

急速な血行再形成がなければ、虚血性心疾患は心筋細胞の不可逆的な喪失、瘢痕形成、心機能の低下を引き起こします。低酸素再酸素損傷のモデル化や、ヒト組織における治療的介入の可能性を評価する能力は、未充足のニーズです。ヒト心臓オルガノイド(hCO)は新興モデルシステムですが、hCOの小型化、懸濁培養の要件、分化効率のばらつきから研究を始めるのは困難です。このプロトコルは、ヒトiPSC由来の自己組織化hCOの生成と維持のための使いやすいガイドを提供します。hCOの処理および組織学的解析方法;また、ヒト虚血/再灌流で見られる線維化やアポトーシスを模倣した低酸素再酸素化によるhCO損傷のアプローチも示しています。このプロトコルは、hCOを虚血再灌流損傷の動物モデルの補完として利用するための指針を提供し、ヒト心筋の回復を促進する要因の特定と検証に活用される可能性があります。

概要

虚血性心疾患は世界的に罹患率と死亡率の主要な原因であり、アメリカだけで少なくとも2,050万人が影響を受けています。^1,2,3。十分な灌流がなければ、長期間の低酸素状態は心筋細胞(CM)の死や心筋機能障害を引き起こします。心筋虚血は主に経皮的介入、血栓溶解療法、冠動脈バイパス移植による血行再形成で治療されます。しかし、血流再形成は諸刃の剣であり、活性酸素の放出による追加の損傷を引き起こすこと^{もあります。}再灌流戦略は非常に成功していますが、虚血性損傷や再灌流後のCM損失を制限するアプローチは、より困難でした。梗塞組織の救済を試みる多くの試みは、虚血再灌流の動物モデルで効果が証明されていますが、これらの治療法はヒト試験ではほとんど有意な効果を得られず、CMを保つ治療薬の補充をヒトモデルで評価する必要性が高まっています。6,7,8,9,10,11,12。

心臓損傷をモデル化するために用いられるヒトプラットフォームには、一次組織やヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来システムが含まれます(^13,14)。一次組織はサンプルの入手可能性に制約されるため、hiPSCシステムは遺伝的に扱いやすくスケーラブルであるという明確な利点を持ち、心臓疾患モデリングにおける主要な人間のプラットフォームとして浮上しています(15,16,17,18,19)。従来の2次元hiPSC由来心筋細胞(hiPSC-CM)培養は、未熟なCM、複雑な組織構造の欠如、そして人間の心臓に見られる完全な細胞多様性を再現できないことに制限されています^15,20。これらの欠点を補うために、設計された3D心臓組織(EHT)が^{ますます採用されています。}EHTのアプローチには、分化前の心臓細胞を球状体に混合^するか、分化した心臓細胞を足場や型にシードする方法があります(21,22,27)。EHTは異型細胞相互作用をより良くモデル化でき、2D培養よりも成熟度が高いものの、EHTの作成・維持のためのカスタム足場やバイオリアクターの要件が現時点でそのスケーラビリティを制限しています 21,27,28。

自己組織化型心臓オルガノイド(hCO)、またはカルディオイドは、新しく強力なin vitroヒトモデルシステムです(20,25,26,29)。hCOにはいくつかの利点があります。まず、複数の専門的な分化プロトコルを必要としない、内皮細胞、線維芽細胞、心外膜細胞など複数の細胞タイプを含め^ます。第二に、これらの分化の大部分は3D懸濁培養で行われ、特殊な型や組織マトリックス^{25、26、29、30}の必要性が不要です。最後に、hCOは中心空洞を持つ典型的な球形の形態を持ち、形態解析を可能にします。したがって、hCOは2次元培養システムに似たスケーラビリティを持ちつつ、EHTの組織複雑さを一部保持しています。hCOは薬物毒性試験、患者特異的疾患モデリング、心臓発達の側面のモデル化に用いられています 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.有望ではありますが、hCOはEHTと比べていくつかの制約があり、その中には力の出力を直接測定できない点があります。さらに、記載されたhCOモデルには固有の免疫細胞集団は存在しませんが、マクロファージをhCOに付与することは可能です。それでも、hCOは新興かつ急速に進化するヒト^{モデルシステムです。}

これまでのところ、hCOを用いた心損傷のモデル化は限られています。クライオ傷害モデルは記述されていますが、損傷は非常に多様であり、hCOを個別に損傷させる必要があるためスケー^{ラビリティ}は制限されています。本論文は、低酸素再酸素化(H/R)損傷を伴う自己構成型hCOの生成および損傷のための使いやすいプロトコルを説明しています。他のhCO生成プロトコルと比べて、このプロトコルは簡略化された分化培地を使用し、Hofbauerらが記述した2次元-3次元中胚葉分化戦略を組み^{込んでいます。}H/R損傷のプロトコルは、hCOが拍動を始めてからいつでも実施可能で、通常は分化日8日目(D8)からD11にかけて起こります。H/Rの持続時間は6時間から24時間の間で調整でき、最小限からほぼ完全なCM喪失までの望ましい損傷レベルに到達できます。さらに、hCOは典型的にH/R損傷後にVimentin⁺ 細胞を含むコラーゲン性コアを形成し、これはH/Rの持続時間に伴い重症度が増加します。この高スループットでスケーラブルなH/R損傷のhCOモデルは、損傷後のCM回復や再生を促進する新たな治療法の開発と検証のためのヒトモデルの必要性に応える可能性があります。

プロトコル

ヒト細胞株を取り扱うすべての手順は、地域のバイオセーフティプロトコルに従うべきです。すべての実験は、デューク大学のiPSCコア施設で健康な新生児男性線維芽細胞から由来するiPSC細胞株DU11を用いて行われました。

1. hCOの生成

注:この節ではiPSCからhCOを生成する標準プロトコルについて説明します(図1)。このプロトコルで詳述されたすべての手順は、無菌を確保するためにラミナーフローフード内で行うべきです。差別化メディアのレシピについては 表1 を参照してください。

日	家畜の集中度	作業集中	希釈係数	ベースメディア
D0	10 mM CHIR99021	10μM CHIR99021	1:1000	RPMI-1640、2% B27 インスリン減量
	100 mg/mL アスコルビン酸	50 μg/mL アスコルビン酸	1:2000
	10 mg/mL アクティビンA	60 ng/mL アクティビンA	1:167
D1	5 mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640、2% B27 インスリン減量
	100 mg/mL アスコルビン酸	50 μg/mL アスコルビン酸	1:2000
D2	5 mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640、2% B27 インスリン減量
	100 mg/mL アスコルビン酸	50 μg/mL アスコルビン酸	1:2000
	10 mM チアゾビビン	2 μM チアゾビビン	1:5000
D3	5 mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640、2% B27 インスリン減量
	100 mg/mL アスコルビン酸	50 μg/mL アスコルビン酸	1:2000
D4	5mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640、2% B27 インスリン減量
D6+	該当なし	該当なし		RPMI-1640、2%のB27とインスリン

表1:微分媒体表。 各差別因子の在庫濃度、作業濃度、希釈係数を0〜6日目まで提供します。すべての作業用溶液は給餌時に新鮮な状態で準備してください。

図1:hCO微分の概略図。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. iPSCのメンテナンス
   1. 12ウェルプレートの各ウェルの底面を、冷たいDMEM/F12培地で希釈した基底膜マトリックスを1:100の比率で完全に覆います。処理済みプレートを37°Cで1時間培養し、重合を促します。すぐに使わない場合は、プレートをフィルムで密封し、4°Cで最大2週間保存し、使用前に37°Cで少なくとも60分間孵育します。
2. 分化-3日目(D-3):iPSCをプレートし、その後の分化を進める
   1. ステップ1.1.1で説明された基底膜マトリックスコーティングプレートを準備します。
   2. iPSC培養液を吸引し、細胞を完全に覆うほどの細胞剥離液を加えます(12ウェルプレートのウェルあたり約500μL、または6ウェルプレートのウェルあたり1mL)。37°Cで5分間孵化します。
   3. 各ウェルに同量のiPSC維持培地を加え、プレートを優しく叩いて細胞の剥離を助けます。プレートを自分の方に傾け、ウェルの底を優しく上下にピペットで動かして、接着細胞をさらに3回まで剥離させます。ピペットを使って細胞懸濁液を15mLの円錐形チューブに移します。
   4. ペレットセルは、室温で3分間遠心分離し、スイングバケット遠心分離機で行われます。上澄液を吸引し、細胞を1 mLのiPSC維持培地に優しく再懸濁させます。
   5. 細胞懸濁液10μLを新しい1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。トリパンブルー10μLを加え、ピペットで混ぜます。iPSC/Trypan Blue混合液10 μLをヘモサイトメーターに加え、生細胞を数えます。
   6. 細胞懸濁液をiPSC維持培地でROCK阻害剤(ROCKi)を用いて最終濃度100,000〜200,000 cells/mLまで希釈します。基底膜マトリックスでコーティングされた12ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液1mL/ウェルを加えます。
      注:分化前のプレート密度は、特定の細胞株の増殖速度に依存します。各iPSCラインごとにメッキ密度を調整する必要がある場合があります。ROCKiの濃度はブランドや配合によって調整が必要になる場合があります。
3. 差別化D-2:ROCKi除去のためのメディア交換
   1. ROCKiなしの新しいiPSC維持培地1mLと交換してください。細胞は小さなコロニーを形成し始めます。コロニーは平らに見えるべきです(図2A)。細胞が石畳のように細く、細長く見える場合、これは自発分化の兆候であり、分化効率に影響が出る可能性があります。
4. 分化D-1:治療なしで細胞の培養を継続すること。
5. 分化D0:分化の開始と中胚葉誘導
   1. 顕微鏡を用いて細胞密度を確認し、分化時に70%〜90%の合流率を確保します(図2B)。サブコンフルクの場合は、iPSC維持培地を細胞に供給し、24時間待ちます。セルがあまりにも密集しすぎている場合は、ステップ1.2のように分割します
   2. D0中胚葉誘導培地(10 μM CHIR99021、アスコルビン酸50 μg/mL、アクティビンA60 ng/mL、RPMI-1640中、2% B27サプリメント(インスリン欠損)を含み、12 mLを12ウェルプレートに12 mL 準備します。
   3. 既存の培地を取り除き、1 mL/ウェルのD0中胚葉誘導培地に置き換えます。メディア交換の時間に注目してください。
6. 分化D1:心臓中胚葉の指定
   1. D0中胚葉誘導培地を加えてからちょうど24時間後、D1心臓中胚葉指定培地(5μM IWP2、RB中の50μg/mLアスコルビン酸)に交換します。
7. 分化D2:hCO生成
   1. 細胞を覆うのに十分な細胞解離試薬を加え、37°Cで5分間インキュベートします(図2C)。各ウェルに同じ量のD2心臓中胚葉培地を加え、優しく上下にピペットで除去して付着細胞を放出します。細胞懸濁液を15mLの円錐形チューブに移します。
   2. 細胞を300 x g で遠心分離し、室温で3分間保存します。1 mLのD2心臓中胚葉指定培地(5 μM IWP2、50 μg/mL アスコルビン酸 RB-)に再懸濁します。
   3. 細胞懸濁液10μLを取り、そこに10μLのトリパンブルーを加えます。任意の方法で細胞数を数えてください。細胞をD2心臓中胚葉指定培地で100,000細胞/mL濃度まで希釈し、2μMチアゾビビンを用います。96ウェルの超低付着プレートにあたり10mLの細胞懸濁液を使用します。
   4. 細胞懸濁液を適切なサイズの試薬リザーバーに移し、マルチチャネルピペットを使って超低量アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに100μLを移し、最終濃度は10,000セル/ウェルに到達します。
   5. 懸濁培養でhCO形成を誘導するために、室温で5分間500 x g の遠心分離機プレートを使用します。遠心分離後、大きな細胞のペレット(図2D)ができ、このペレットが制限されていなければ、遠心分離を繰り返します。
      注:すべての細胞がhCOに組み込まれるわけではなく、hCOは限定された細胞ペレットとして現れ、明視野顕微鏡では個々の細胞が見えます。hCOを取り巻くプレート内の単細胞破片の一部は正常です。
8. 差別D3:ROCKiを希釈するための培地の添加
   1. 各プレートに10mLのD3培地(5μM IWP2、RB-中のアスコルビン酸50μg/mL)を準備します。マルチチャネルピペットを使い、各ウェルに100μLのD3メディアを加え、メディアを除去せずに加えます。
      注:この段階で、hCOは濃く明確に区切られた球状体に凝縮しています。個々のセルは見えません(図2E)。
9. 差別化D4:D4メディアへの交換
   1. D3培地100μLを除去し、D4培地100μL(5μM IWP2 in RB-)に置き換えます。誤嚥のリスクを減らすために、プレートを自分の方に約45度傾け、マルチチャンネルピペットをプレートの側面に対して約90度の角度で持ってください。マルチチャネルピペットをウェルの側面壁にしっかりと置き、100μLの培地をゆっくり吸い込みながら、ピペットの先端に吸引したhCOがないか断続的に確認します。
      注:hCOは懸濁培養中にあり、培地除去時に吸引するhCOは一般的です。誤嚥のリスクを減らすために、プレートを自分の方におよそ45°傾け、マルチチャンネルピペットをプレートの側面に対しておよそ90°の角度で持ちます。マルチチャネルピペットをウェルの側面壁にしっかりと置き、ゆっくりと100μLの培地を吸引し、ピペットの先端に吸引したhCOがないか断続的に確認します。
   2. 100μLのD4培地に置き換えてください。
10. 差別化D6:hCO維持媒体
    1. D4培地100μLを除去し、D6+培地100μL(RPMI-1640、2%B27サプリメント(RB+)に置き換えます。
11. 微分 D8
    1. 培地交換は2日ごとに続け、100μLを除去し、100μLの新しいD6+培地に置き換えます。hCOはより大きく成長し、滑らかな縁を保ち、分化に成功すればD6-11付近で拍打を始めるはずです(図2F)。hCOは依然として暗く、よく囲められた球状体として現れ、個々の細胞は見えません。

図2:hCO分化のタイムライン。 オルガノイド分化の年表。(A) 分化開始1日前のiPSCコロニー(D-1)。特徴的で平らに見えるコロニーに注目してください。(B) 分化開始日(D0)におけるiPSCが~90%のコンバーシティ。(C) 96ウェル超低付着プレートにおける分化直後のD2分化時のオルガノイド。矢印は針状のIWP2結晶の例を示します。(D) 分化D3のオルガノイド。細胞間接合部の形成による著しいオルガノイド圧縮に注目してください。この段階では、一部の未取り込み細胞の破片は正常です。(E) 分化D10におけるオルガノイド。(F) 矢印はiPSCコロニーを示し、細長い細胞を持ち、石石のような外観を持ち、自然分化の可能性を示します。パネルA-Eではスケールバー=1000μm、パネルFではスケールバー=400μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

2. 免疫染色のためのhCOの採取と固定

1. 1000μLピペットを先端を切り落として、hCOを1.7 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。すべてのhCOが移されたら、hCOがチューブの底に沈むのを待ち、余分な培地を優しく取り除きます。hCOをPBSで1回洗い、数秒間hCOがチューブの底まで沈むのを待ち、余分なPBSを優しく取り除きます。
2. 4%PFAを含むhCOを室温で30分間固定してください。
   注:一部の抗体は最適な効果を得るためにアセトンやメタノール固定を必要とする場合があります。メーカーのガイドラインを参照してください。

3. 全額免疫染色

1. 1.7 mLのマイクロ遠心分離機チューブに、所定数の固定hCOを移します。固定液を除去し、0.1%のTween-20(PBS-T)を含むPBSで洗浄します。
   1. hCOを洗うには、余分な固定液をできるだけ取り除くことです。チューブの底にあるhCOを乱さないように注意してください。PBS-Tを~1mL追加し、hCOがチューブの底に沈むまで数秒待ってから次のステップに進みます。
2. 一次抗体を染色液(新生児子牛血清10%、DMSO1%に0.1%PBS-T)で希釈します。マイクロ遠心分離機チューブごとに50〜100μLの一次抗体溶液を加えます(または各チューブ内のすべてのhCOをカバーできる量の量)。
3. シェーカー/ロッカーで4°Cで24時間孵化します。余分な一次抗体を除去し、室温でPBS-Tで1時間3回洗浄します。過剰な抗体が除去されることを確認するために、PBS-Tで4°Cの一晩洗いを行います。
4. 二次抗体を染色液で所定濃度まで希釈し、マイクロ遠心分離機管あたり50〜100μLの抗体溶液(または各チューブ内のすべてのhCOを覆う量)を加えます。
5. hCOを二次抗体とともに4°Cの揺らすプラットフォーム上で24時間培養します。過剰な二次抗体を除去し、室温でPBS-Tで1時間3回洗浄します。PBS-Tで4°Cで一晩洗い流し、過剰な抗体をすべて除去します。
6. ホールマウントイメージングでは、1000μLピペットを先端を切り落として正に帯電したガラススライドにhCOを移します。余分なPBS-Tを取り除き、hCOを覆うために数滴のマウンティングメディアを加えます。慎重にカバースリップを置いてhCOを平らにします。
   注意:hCOの3D構造を保つために、スライドの縁にゴム製ガスケットまたは両面テープを貼り、カバースリップの高さを上げてください。クリアリングマウントメディアの使用は、特にhCOが平坦化していなければ、hCOのイメージングを改善するのに役立ちます。

4. 断面化と埋め込み

1. 固定後は、30%ショ糖に4°Cで一晩覆い、クライオプロテクションを行います。1000μLピペットを先端切り取りして、12mm x 12mmのプラスチック型に必要な数のhCOを移します。過剰なショ糖溶液を慎重に除去し、hCOを誤嚥しないように注意してください。
   注意:移す前にピペット先端で30%ショ糖を上下にピペットで移動させ、hCOがチップの側面に付着しないようにすることが役立ちます。
2. HCOを覆うのに十分な少量のOCTを加えてください。細いピンセットかピペットの先端を使って、OCT内でhCOを優しく再配置し、hCOが固まらないようにし、型の縁にhCOがいないようにします。すべてのhCOは型の底にできるだけ近い位置に配置し、1回のクライオセクションで最大限のhCOが検出されることを目的としています。
3. このOCTの最初の層を凍らせるには、型を発泡スチロールのクーラーに入れ、底にドライアイスを敷いて冷凍します。OCTが硬化するまで数分待ってから、ドライアイスから作業台にカビを移します。型が満たされるまでさらにOCTを加えます。OCTの最初の層が完全に溶けるのを待ってから、再びドライアイスに戻してください。
4. 凍結・埋め込み型のhCOは-80°Cで冷凍保存し、冷凍切開準備が整うまで保管してください。
5. 区切の準備ができたら、hCOブロックをできるだけ整列させてトリミングを始めてください。定期的にセクションを帯電スライドに置き、各セクションのhCOを目視で確認してください。hCOを可視化したら、6μmの断片に切り替えます。
   注:埋め込みおよび切片時のhCOの喪失率は少なくとも10%です。それに合わせて計画を立てましょう。

5. TUNELおよび免疫染色組織切片

1. 染色が必要な組織の部分に撥水性の縁取りをパップペンで描いてください。PBS 0.1%トゥイーン(PBS-T)に一度スライドしてOCTを溶かします。
2. ブロッキングバッファー(10%新生児子牛血清、1%DMSOをPBS-Tに含む)を室温で1時間加えます。
3. 一次抗体溶液を準備してください。免疫蛍光の製造元推奨濃度から始めますが、濃度は経験的に調整する必要がある場合があります。
   注意:または、メーカーのプロトコルに従ってこの時点でTUNEL染色を行うこともできます。
4. スライドからブロッキングバッファを取り外してください。一次抗体溶液を十分に加えて、hCOの断片を覆います。一次抗体を4°Cで一晩、または37°Cで3時間インキュベートします。 PBS-Tを入れたコプランジャーで3回、各5分間スライドを室温で洗います。
5. DAPIや他の汎核マーカーを含むブロッキングバッファーに二次抗体染色溶液を準備します。二次抗体染色液を十分に加えて、hCOの断片を覆います。室温で光を遮って1時間培養します。
6. PBS-Tを入れたコプランジャーで室温で3回、5分間洗います。目的の取り付け媒体を使ったカバースリップで取り付けます。

6. CardioCountによる核共局在の定量化

注:CardioCountは顕微^{鏡画像から}CM核をスコアリングするための深層学習ベースの手法です。もともとはCMサイクリングを評価するために開発されたCardioCountは、TUNEL⁴⁰を含む複数の核染色に対して良好な性能を発揮します。

1. CardioCountを使用するには、GitHubからCardioCountパッケージをダウンロードするか、Google Colab(https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git、https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/、https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3)にインポートしてください。CardioCount バージョン1はPython 3環境で動作します。
2. 赤、青、緑のチャンネルを統合した個別の512×512ピクセル.tifファイルとして画像をエクスポートしてください。赤チャンネルはCM核マーカー、青は一般的な核マーカー、緑はサイクル中の核マーカー(例:Ki67)またはアポトーシスマーカー(例:TUNEL)です。この実験のためにGoogleドライブに親フォルダを作成し、結合したtiffsをサブフォルダとしてアップロードします。
   注:CardioCountは核を満たす核染色で訓練されました。Aurora BやPH3のように点が多いサイクリングマーカーは、CardioCountと互換性がない場合があります。
3. Google CoLabでCardioCountノートブックを開きます。Cell 1.1を実行してグラフィックス処理ユニット(GPU)へのアクセスを確認しましょう。Cell 1.2を実行してCoLab NotebookをGoogle Driveに接続してください。
4. Google ColabでCardioCountと依存関係を読み込むためにCell 1.3を実行してください。kfileを編集して、ダウンロード時に保存されたPRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Librariesフォルダのパスネームを読み取ってください。
5. Cell 2.0では、base_folderを編集して、解析する画像のサブフォルダを含む親フォルダにパスネームを読み込みます。Cell 2.0を実行して、このフォルダをCoLabにリンクしてください。
6. セル2.1.1では、解析用の画像を含むフォルダ名に合わせるようにorig_image_folderを編集してください。緑channel_to_removeを読み、new_image_folderを編集してbase_folderのサブフォルダ名を付けてください。そこに緑のチャンネルが取り除かれた画像(赤/青)はすべて保存されます。赤いチャンネルを削除するためにこの手順を繰り返します。赤いチャンネルが削除された画像(緑/青)を含むサブフォルダを区別するためにnew_image_folderを編集してください。
7. セル2.1.2では、赤/青の画像を512×512にトリミングします。ステップ6.6で作成されたnew_image_folder名と一致するものが、uncropped_image_folderが一致していることを確認してください。赤や青の画像には。destination_image_folder名を付けて、赤・青の画像を切り取った画像を保存するサブフォルダを指定します。この工程を繰り返して緑/青の画像をトリミングします。最後に、この工程を繰り返して、base_folderに収められた元の3チャンネル合成されたティフをトリミングします。
8. Cell 2.2を実行して確率マップを生成してください。名前data_specific_folderセル2.1.2からdestination_image_folderで生成された赤/青および緑/青の画像の名前です。model_dirの場合、セグメントモデルを含むフォルダにファイルパスを入力します。赤核を分割するにはモデルerg_rb_optを使い、エポックとして200を入力してください。probmap_directory_nameの名前を変更して、赤/青の確率マップを保存するフォルダを指定します。この手順を緑や青の画像でも繰り返します。緑核を分割するにはモデルedu_mouse_bg_optを使い、エポックとして100を入力してください。
9. セル2.3.1では、ステップ6.8で生成された確率マップに基づいてオブジェクトマップが作成されます。このinput_folderは、セル2.1.2で生成された赤/青の確率マップ画像を含むセル2.1.2のdestination_image_folderにちなんで名付けられます。閾値の赤/青画像が保存されるoutput_folderを指定してください。核セグメンテーションの信頼度の閾値(範囲0.0-1.0)を設定してください。セル2.3.1を実行してください。この手順を緑や青の画像でも繰り返します。
   注:核に関する信頼度の閾値はデータセットに依存します。閾値0.9から始め、寛大すぎる場合は高く、厳しすぎる場合は確率マップのランダムな検査に基づいて調整します。
10. セル2.3.2では、ステップ6.10で生成されたオブジェクトマップ内のセル数がカウントされ、.csvファイルにエクスポートされます。count_folderは、閾値が設定された赤/青画像が保存されるセル2.3.1のoutput_folderにちなんで名付けられます。画像の境界に触れる物体を除外するには、ignore_border_cellsがTrueと表示されていることを確認してください。csv_path base_folder のサブフォルダが保存されているパス名にリネームしてください。csv名を編集して赤/青のオブジェクトのカウントを反映してください。青や緑の画像でもこの工程を繰り返します。
11. セル2.4では、緑/赤の二重陽性核がカウントされます。img_folderをステップ6.8で生成されたトリミングされた3チャンネル画像を含むサブフォルダの名前にリネームしてください。childcell_folderをセル2.3.1のoutput_folderにリネームし、閾値の赤/青画像が保存される場所です。parentcell_folderをセル2.3.1のoutput_folderにリネームし、しきい値の緑/青画像が保存されます。dest_folderをダブルポジティブオブジェクトマップが保存するフォルダを指定するように名前を変更してください。csv_path名前を変更して、パス名とファイル名をすべてのサブフォルダが格納されているbase_folderに指定し、csv名を編集してダブルポジティブオブジェクトのカウントを反映させます。
12. 画像ごとに生成される赤、緑、二重の正数を生画像と比較して正確なセグメンテーションを検証します。
    1. CardioCountが盲検レビュー者がカウントする核の数に対して画像中の核数を一貫して過大推定している場合は、より高い信頼度閾値でステップ6.9を繰り返し、ステップ6.10から6.11を繰り返します。CardioCountが盲検レビュアーがカウントする核の数に比べて画像中の核の数を過小評価した場合は、信頼度を下げてステップ6.9を繰り返し、ステップ6.10-6.11を繰り返します。
13. 赤核、緑核、二重正核の各hCOのカウントを合計します。各オルガノイドごとに、循環核の割合(二重正核/総赤色CM核)×100と計算します。

7. 低酸素再酸素損傷

1. 低酸素培地(119 mM NaCl、12 mM KCl、1.2 mM NaH₂PO₄、1.3 mM MgSO₄、0.5 mM MgCl₂、0.9 mM CaCl₂、20 mM 乳酸ナトリウム、5 mM HEPES、pH = 6.4^)を準備します。
2. 細胞培養フラスコに、96ウェルのhCOプレート1枚あたり5mLの低酸素培地を移します。細胞培養フラスコを低酸素室に入れ、無酸素ガス(5%_CO2、95%_N2)で3分間洗浄します。低酸素状態を開始する前に、37°Cで少なくとも1時間潜伏します。
3. hCOからすべての媒体を除去してください。まずは、マルチチャネルピペットですべてのウェルから~150μLを除去します。その後、200μLピペットを使って、hCOを乱さずに個々のウェルから残った媒体を慎重に除去します。
   注意:すべての井戸からすべての媒体を除去することは、再現可能な損傷を得るために極めて重要です。
4. 各ウェルに50μLの低酸素培地を加えます。hCOプレートを低酸素チャンバーに入れ、無酸素ガス(5%_CO2、95%_N2)で3分間フラッシュします。低酸素チャンバーをインキュベーターに37°Cで6時間置きます。
5. 再酸素化を開始するには、低酸素室からhCOを除去し、予温化されたRB+培地150μLを投与します。下流アッセイを行う前に、37°Cで少なくとも3時間の再酸素化を許可してください。

8. 乳酸脱水素添加放出アッセイ

1. 再灌流開始後、所望の時刻に損傷したhCOおよび未損傷のhCOウェルから20μLの培地を採取します。LDH貯蔵バッファー180μL(200 mMトリスHCl(pH7.3)、グリセロール10%、BSA1%)に1:10を希釈して混ぜます。分析を行う準備が整うまで-20°Cで保存してください。採取前に培地を混ぜるためにピペットを何度か上下に動かします
2. 凍結されたメディアを解凍しました。各培地サンプルごとに、黒壁透明底の96ウェルプレートの1ウェルに45μLのLDH貯蔵バッファーを追加します。各ウェルに1:10の希釈培地を5μL加え、最終希釈は1:100にします。各サンプルごとに50μLのLDH検出酵素ミックスと0.25μLのリダクターゼ基質を混合してLDH検出試薬を準備します。
3. 1:100希釈培地を含む各ウェルに50μLのLDH検出試薬を加えます。室温で光を遮り、60分間培養します。対応プレートリーダーによる生物発光信号のアッセイ。

9. カルシウムイメージング

1. フェノールレッドフリーRPMI-1640、0.04%プルロニック、5μM Cal520-AMを用いたカルシウム染料染色溶液を準備します。サンプルを光から守りましょう。
2. カルシウムイメージング用の各ウェルから100μLの培地を除去します。カルシウム染料染色液100μLを加え、光を遮った状態で37°Cで30分間培養します。
3. 各ウェルからカルシウム染料で培地100μLを除去し、代わりに100μLのフェノールレッドフリーRPMI-1640に置き換えます。37°Cで30分から1時間孵育し、染料の洗い流しを待ちます。
4. 連続イメージング/ストリーミング機能を持つ顕微鏡を使い、96ウェル超低圧アタッチメントプレートを作業位置に配置します。10倍の対物レンズでhCOの基底を特定し、Cal520の過渡現象に注意してください。
5. 室温下でのカルシウム過渡期の30秒の記録を撮影します。共焦点顕微鏡を使用する場合、hCO全体をイメージングすることはできません。カルシウムの過渡期に細胞の輪郭が見えるhCOの基部近くの焦点面を選びます。

10. カルシウム一時分析(図3)

1. カルシウム過渡分析は、さまざまなピーク解析ソフトウェアを用いて実施可能です。以下はSpiky ImageJプラグイン⁴¹ (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/)を使った解析手順です。
2. 各hCOの可視セルごとに5つの2×2ピクセルの関心領域(ROI)をROIマネージャーに追加します。細胞核や細胞境界とROIを重ねないように注意してください。hCOの動きが一時的な解析に影響を与える可能性があります。
3. 「>セット測定値を分析」で「 平均グレー強度」を選択してください。ROIマネージャーでマルチ メージャー を選択して、すべてのROIと全フレームで平均グレー強度を記録します。
4. すべてのROIの平均グレー強度を含む.csvファイルを保存してください。各画像のROIポジションはすべて保存して後で参照してください。
5. 新しいスプレッドシートで、Time(s)の列を追加します。各フレームの時間を、30秒をフレーム数で割り、フレーム番号で割って計算します。編集した.csvとして保存してください。
6. フィジーで編集済み.csvファイルを開いて、Spikyプラグインを起動します。分析オプションで、希望する解析パラメータを選択します。
7. X軸にプロット時間、Y軸にROI #1の平均グレー強度を示します。 「ピーク解析」を選択し、ベースライン、ピーク開始/終了、ピーク振幅の正しい注釈を確認してください。ピークの数が誤りの場合は、分析オプションのパラメータ(ベースラインからの最小ピーク振幅を含む)を変更し、ピーク識別が成功するまでピークしきい値を開始します。
8. すべての中間ファイルを保存してください。ビート毎分(bpm)は、60を各ROIのピーク間平均で割ることで計算できます。
9. 上記の分析をすべてのhCOあたりのROIで繰り返します。

図3:カルシウム一時分析。 (A) 赤いボックスは、解析パラメータを選択するドロップダウンメニューを開くボタンを示しています。(B) 赤いボックスは、代表的な無傷hCOのROIから時間(s)と平均グレー強度をプロットするボタンを示します。(C)赤いボックスはピーク解析を選択するボタンを示します。(D) 損傷のないhCOからの代表的なカルシウム一時的痕跡およびピーク分析。赤い三角形はピーク最大値を示し、ピンクの四角形はピークアップストロークとダウンストロークの最大傾き、緑のボックスはピークの開始、青いボックスは基準線を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

上記のプロトコルに従うことで、分化日7〜12日目(D7〜12)の間に拍動を始める適切なhCOが得られます。hCOが25日目を過ぎて成熟すると、電気的な心拍動なしで自然陣痛が見えなくなることがあります。H/R損傷は、hCOが打動を始めた直後にいつでも行うことができます。通常、15日齢(D15)のhCO以降に損傷を行います。

負傷の確認
ヒトの心筋梗塞と同様に、H/R損傷は細胞死を引き起こします。臨床的には、LDH、心臓トロポニン、ミオグロビン、クレアチンキナーゼなど、細胞死によって放出されるタンパク質を測定することで心筋損傷の程度を評価できます。同様に、H/R損傷後のhCO培地中でもLDHの放出は容易に測定できます。 図4A は、市販のマイクロプレートベースの生物発光アッセイを用いた、H/R損傷から24時間後のD21-D28 hCOからのLDH放出の代表的な結果を示しています。低酸素状態6時間、再灌流24時間後、損傷し...

ディスカッション

ここでは、H/Rで自己組織化するhCOを生成し損傷させるための段階的なプロトコルを示します。虚血性心疾患は、心筋細胞の死死、線維化性の再構築、電気機能障害、機能低下などの病態生理的再構築を特徴とします。これらの摂動はhCOモデル系で観察されており、TUNEL⁺ CMの増加、LDH放出の増加、Vimentin⁺ 組織面積の増加、カルシウム取り扱いの変化による機能的同期喪失が含まれます。重要なのは、hCOは比較的未熟であるにもかかわらず、組織再生の証拠を示していないことです。したがって、このH/Rモデルは、長時間の成熟プロトコルを必要とせず、心臓保護療法のスクリーニングを行うための実用的なプラットフォームとなり得ます。

hCOを生成するための多くのプロトコルが存在し、このプロトコルは2021年にHofbauerらが初めて記述した2D-3D微分法に基づいて^います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アキュターゼ溶液	シグマ・オルドリッチ	A6964-500ML
抗心疾患トロポニンT抗体	アブカム	EPR20266
B-27サプリメント(50X)、血清不使用	ギブコ	17504044
インスリンなしのB-27サプリメント	ギブコ	A1895602
BioTek Synergy Neo2 プレートリーダー	バイオテック
Cal-520、AM	AATバイオクエスト	21131
CardioCount V1	カラ研究所	PMID:38984052
細胞株(<男性の ホモ> サピエンス - DU11 iPSC 系統	デューク大学幹細胞コア
荷電顕微鏡スライド、白色ガラス	VWR	89500-496
CHIR 99021	トクリス	4423
クローンR	STEMCELL テクノロジーズ	5888
コーニング 96ウェルクリア超低アタッチメントマイクロプレート	フィッシャー	7007
使い捨てピペット貯水池	VWR	89094-678
DMEM/F-12、HEPES	ギブコ	11330057
EVOS蛍光顕微鏡	EVOS
ゲルトレックス低減成長因子ベースメント膜マトリックス、LDEVフリー、幹細胞適格	ギブコ	A1413302
ヒト活性素 - 組換えタンパク質	PEPROTECH INC/ライフ・テクノロジーズ	120-14E-50UG
IWP-2	STEMCELL テクノロジーズ	72124
L-アスコルビン酸(結晶性/認証済みACS)	フィッシャー・サイエンティフィック	A61-100
マウス抗ビメンチン	DSHB	AMF-17b
mTeSR Plus	STEMCELL テクノロジーズ	100-0276
マルチウェル細胞培養プレートなど、12井戸	VWR	10062-894
プルロニックF-127	シグマ・オルドリッチ	P2443
ReLeSR	STEMCELL テクノロジーズ	100-0483
RPMI 1640 ミディアム	ギブコ	11875119
RPMI 1640 ミディアム、フェノールレッドなし	ギブコ	11835-030
チアゾビビン	STEMCELL テクノロジーズ	72254
ティッシュテックO.C.T.コンパウンド	サクラ・ファインテックUSA INC(VWR)	25608-930
ツァイス回転円盤共焦点顕微鏡	ツァイス