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方法論記事

マウス気管上皮細胞培養中の一酸化窒素生成の測定 空気と液体界面で分化

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DOI：

10.3791/70311

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2026年7月3日

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1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

この記事について

サマリー

このプロトコルは、三ヨウ化物ベースの化学発光アッセイを用いて頂端分泌中の亜酸塩を測定することで、気道上皮培養中の一酸化窒素(NO)産生を定量化する方法を説明しています。

要約

気道上皮培養は、空気-液体界面(ALI)で分化し、繊毛細胞における一酸化窒素(NO)シグナル伝達を研究するための生理学的に関連性の高いモデルを提供します。ここでは、ALI分化マウス気管上皮細胞から採取したサンプルから採取した亜硝酸塩(NO₂⁻)を測定することでNO産生を定量化する方法について説明します。頂端洗浄液、基底培地、細胞溶解液は、三ヨウ化物ベースの化学発光アッセイと一酸化窒素分析装置(NOA)を用いて収集・解析されます。反応容器に注入すると、亜硝酸塩は化学的に還元されてNOとなり、これはオゾン系化学発光によって検出されます。信号強度は標準的なキャリブレーション曲線を用いて亜硝酸塩のピコモールに定量化され、値は細胞内の総タンパク質含有量に正規化されます。アッセイ性能はNOレベルの薬理学的調節を用いて検証されます。NOドナーのジエチルネトリアミンNONOate(DETA-NONOate)およびNOシンターゼ阻害剤N(ω)-ニトロL-アルギニンメチルエステル(L-NAME)による治療により、疾患間で亜硝酸塩レベルの有意な差が観察されました。最も堅牢で再現性の高い信号は、気道上皮から放出されるNOの量に対応する頂端ウォッシュで観測されます。この方法は、ALI分化気道上皮のサンプルからNOを確実に検出し、NO産生や異常なNO代謝に関連する疾患モデルを定量化する正確なin vitroプラットフォームを提供します。

概要

喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症(CF)、原発性毛様体ジスキネジア(PCD)など、いくつかの気道疾患の特徴は、呼気中のNOレベルの変化として測定可能な一酸化窒素(NO)恒常性の変化です。これらの疾患では大きく異なり、COPDや喘息では上昇し、CFやPCDでは大幅に減少します。4。これらの疾患は、粘毛のクリアランスの主な効果因子である気道上皮の運動性繊毛に異常を示すことが多い5。NOおよびその下流シグナル伝達経路は毛様体の運動性を重要な調節因子であるため、これらの文脈でNOの産生とシグナル伝達がどのように変化するかを理解することは、粘液毛様体機能障害のメカニズムを解明するために不可欠です。したがって、気道上皮細胞におけるNOの生成と放出を正確に検出できる手法は、このシグナル伝達分子の調節および生理的役割を解明する貴重なツールを提供します。このような手法は、NOの半減期が短く反応性が速いため、直接測定が難しい実験現場で特に有用です。

NOは、繊毛細胞の極性や運動性6,7,8の協調的な拍動に影響を与えることで、気道の繊毛の生合成と機能を調節します。しかし、気道内で全く恒常性を保つメカニズムは完全には解明されていません。気道上皮培養は空気-液体界面(ALI)で分化しており、これらのメカニズムを調査するための貴重なin vitroシステムを提供します。現在、このモデルは気道上皮への環境刺激の影響を研究し、気道疾患の病態生理を解明するために広く用いられています。従来の水中培養13,14と比較して、ALI分化上皮は上皮分極、粘膜毛様体分化、現実的な気液交換など、自然気道の構造や機能をより忠実に再現しており、頂端NO放出、シグナル伝達、関連する毛様体機能の研究に特に適しています。このシステムは、特に上皮分化や薬理学的操作条件下で、気道内腔内に放出されるNO由来代謝物を定量化することを目的とした実験に適しています。

NO濃度の正確な測定は不可欠です。過剰または不足したNOレベルは毛様体の機能を損なう可能性があります。現在、蛍光プローブを用いたNO検出法(例:ジアノフルオレセイン、DAFs)は半定量的であり、pH感度、酸素依存性、特異性の欠如によって制限されています。これらは細胞酸化剤や抗酸化物質と反応するため、半定量的な測定結果となっています。15。さらに、電気化学センサー(例:NO感度アンペロメトリック電極)はNO16のリアルタイム検出を可能にしますが、半減期が全くない、電極表面の酸化還元活性種バイオファウリングによる干渉、そして安定した校正の維持に課題があるため、複雑な生物系での実装は困難です.直接気相NO検出や異なる窒素酸化物種を標的とした還元アッセイなどの代替的な化学発光ベースのアプローチも記載されていますが、気道上皮培養への応用はまだ未だに解明されていません。これらの制限は、小量生物サンプルにおいて低濃度のNO由来種を信頼性高く検出できる高感度で定量的な手法の必要性を強調しています。これらの制約を克服するため、ALI分化気道上皮から採取した頂端分泌物中のNOを一酸化窒素分析器(NOA)を用いて定量するプロトコルを確立しました。NOAは高感度の化学発光検出器であり、伝統的に化学試料中のNO代謝物の測定に用いられ、近年では血液、組織均質物質、細胞培養上清液7,18,19などの生物検体の分析にも適応されています。NOは、正常な酸素レベルの条件下で組織内で急速に酸化され亜硝酸塩に変わる非常に反応性の高いシグナル分子であり、半減期は非常に短いです。したがって、NO酸化の最終生成物としての亜硝酸塩は、生物系における総NO産生の指標となります 20,21,22。この高感度かつ再現性のある化学発光法により、ピコモーラレベル23,24で亜硝酸塩/NOを検出できるため、MTEC ALI培養など低体積の生物サンプルの微小な変化を測定するのに理想的です。しかし、この方法は、亜硝酸塩の蓄積が最近のNO生成を反映し、サンプル取り扱い、背景亜硝酸塩汚染、上皮の分化状態などの要因に影響される可能性のある条件に最も適しています。したがって、結果の正確な解釈を確保するためには、適切な対照と慎重な実験設計が必要です。

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プロトコル

すべての動物処置はメリーランド大学施設動物ケア・使用委員会(プロトコル # AUP–00004632)によって審査・承認されました。

注:プロトコルではマウス気管上皮細胞(MTEC)の分離に約2日、その後7〜10日間の増殖、トランスウェル挿入物での増殖に5〜6日、分化に21日間(十分な多毛細胞を獲得するために必要な時間)、24時間の薬物治療、さらに1日のサンプル採取、NOA校正が必要です。 インジェクションとデータ収集。

1. 培地および溶液の準備

注意:メディア成分の詳細については 表1 を参照してください。

  1. ハムのF-12メディア
    1. 溶液は無菌層流フード内で準備します。無菌ボトルに100×ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質5mLとアンホテレシンB(菌類)0.5mLを加えます。
    2. ボトルを5〜10回優しく逆さにして、完全に混ぜるように混ぜます。0.22μmのフィルターを無菌条件下で消毒し、4°Cで保存します。
      注意:ペニシリン/ストレプトマイシンおよびアンホテリシンBは抗微生物薬であり、刺激やアレルギー反応を引き起こす可能性があります。手袋や白衣などの適切な個人用防護具の使用を心がけてください。
  2. プロナーゼ溶液
    1. 滅菌チューブ内に15mgのプロナーゼを10mLの無菌ハムズF12培地に加え、0.15%のプロナーゼ溶液を得る。プロナーゼが完全に溶けるまで、優しく反回転またはピペットで上下に混ぜます。使用直前に新鮮に準備してください。
  3. DNase I溶液
    1. 粗膵DNase IをHam's F12培地9 mL、および10 mg/mLの牛血清アルブミン(BSA)溶液1 mLを滅菌チューブで添加し、0.5 mg/mLのDNase I溶液を得ます。
    2. ピペットで上下に優しく混ぜて、気泡ができないように完全に溶けます。完全に溶解したら、溶液を1mLの無菌マイクロ遠心分離機チューブに分割し、-20°Cで保存します。
  4. ハムのF12培地と胎児牛血清(FBS)
    1. 溶液は無菌層流フード内で室温で準備します。無菌円錐管内で、抗生物質を含むハムズF12培地40mLに胎児用牛血清(FBS)10 mLを加え、F12培地中に20% FBSを得ます。
    2. チューブを5〜10回逆さまにして溶液が均一になるまで優しく混ぜます。0.22μmのフィルターを無菌条件下で消毒し、4°Cで保存します。
  5. MTEC拡張メディア
    1. MTEC膨張媒体を無菌の層流フード内で、表 1 に記載された成分を無菌ボトルに組み合わせて室温で準備します。
    2. 容器を優しく回したり逆さにしたりして、すべての成分が完全に混ざるまでよく混ぜます。0.22μmのフィルターを用いて無菌条件下で溶液を滅菌します。
    3. 使用直前にROCK阻害剤Y–27632(5 mMストック溶液)を最終濃度10 μMに加え、Notch γ–セクレターゼ阻害剤DAPT(10 mMストック溶液)を使用直前に5 μMの濃度に加え、逆転で優しく混合します。
  6. MTEC拡散メディア
    1. 表1に記載された成分を組み合わせて、無菌層流フード内の室温でMTEC増殖培地を準備します。
    2. すべての成分が完全に混ざるまで、優しく逆さまや渦巻きを繰り返してしっかりと混ざけます。0.22μmのフィルターを無菌条件下でフィルターで滅菌します。
    3. 使用直前に、ROCK阻害剤Y–27632(5 mMのストック溶液)を最終濃度10 μMに加え、レチノイン酸(5 μMストック溶液)を最終濃度0.05 μMに加えます。使用前に逆転して優しく混合します。
  7. MTEC微分媒体
    1. MTEC分異媒体を無菌層流フード内で、無菌容器内で表 1 に記載された成分を組み合わせて準備します。
    2. すべての成分が完全に混ざるまで、優しく逆さまや渦巻きを繰り返してしっかりと混ざけます。0.22μmのフィルターを無菌条件下でフィルターで滅菌します。
    3. 使用直前にレチノイン酸を最終濃度0.05 μMに加え、逆流で優しく混ぜます。

2. マウス気管上皮細胞の単離(MTEC)

  1. IACUCの機関ガイドラインに従い、承認された安楽死チャンバーで20週齢の成マウス3匹(CO2)を吸入して安楽死させてください。組織採取前に死亡を確認しましょう。
  2. 動物を背中(胸を上に向ける)を無菌面に置きます。清潔な鉗子を使い、下唇から腹部まで外科用ハサミで皮膚を優しく切り開き、気管を露出させます。
  3. 唾液腺をどかし、結合組織と気管筋を除去して軟骨リングを露出させます。気管全体を切り離し、無菌のハムズF12培地を入れたペトリ皿に入れます。3つの気管を1皿にまとめます。
  4. 皿を層流フードに移し、気管を新鮮なハムのF12メディウムで別の皿に移します。気管外組織をすべて除去し、気管を内腔に沿って縦方向に切開します。
  5. すべての気管を、無菌10 mLの0.15%プロナーゼ溶液を含む50 mLのスクリューキャップ円錐形チューブに移します。4°Cで16〜18時間培養します。

3. 細胞分離と初期拡張

  1. 翌日、組織を収めたチューブを10〜15回反転させて上皮細胞を外し、4°Cで45分間潜伏させます。プロナーゼ反応を止めるために、20%FBSを含むハム培地10mLを加え、10〜15回反転させて混合します。
  2. ハムのF12培地をFBSとともに10mL、15mLのチューブ3本に加えます。パスツールピペットを用いて、50 mLチューブから1番目、2番目、3番目の15 mLチューブへ順番に気管組織を移し、各チューブで10〜15回反転させて気管上皮細胞を外します。最終移植後は組織を廃棄してください。
  3. 3本の15 mL円錐形チューブの培地全体と50 mLチューブの培地を混ぜます。遠心分離機で360× g 、4°Cで10分間加熱します。 上清液を慎重に除去し、0.5 mg/mLのDNase I溶液を0.5 mL加えます。氷で5分間孵化します。
  4. 遠心分離機で360× g 、4°Cで5分間加熱します。 上澄液を慎重に捨て、細胞ペレットを7〜10 mLのMTEC拡張培地に再懸濁させます。

4. MTECの拡張と分化

  1. コラーゲン被覆されたT75細胞培養フラスコを10 mLのコラーゲンI(ラットの尾)を50 μg/mLで準備し、37°Cで16〜18時間培養します。T75フラスコからコラーゲン溶液を吸引し、PBSで3回洗い(1×)。フラスコを完全に乾かします。
  2. 細胞を含む7〜10mLのMTEC拡張培地を含む細胞懸濁液をコラーゲン被覆フラスコに種まけます。フラスコを37°C、CO25%のインキュベーターに入れます。膨張培地は2〜3日ごとに交換し、セル数を70%の濃度まで監視します。
  3. 70%のコンバーシティで1mLのアキュターゼ溶液を加え、37°Cで10〜15分間培養して細胞の単一層を剥離させます。細胞を10 mLのMTEC増殖培地に再懸濁します。室温で1057 × g で5分間遠心分離機にします。
  4. 上澄液を捨て、細胞を増殖培地に再懸浮させて細胞数を数えます。
  5. 1枚のトランスウェル挿入物(膜径12mm、膜孔径0.4μm)にあたり0.5mLの2個×5個の 細胞を、コラーゲンであらかじめコーティングしました。各挿入物の基底室に1.5mLの培地を加え、トランスウェルを37°Cのインキュベーターに入れます。
  6. 3日目には頂端室と基底室の両方の培地を交換し、細胞が100%の合流に達するようにします。通常は5日目か6日目までに。対照群として細胞のない挿入物を1つ含めます。
  7. 合流したら、細胞の頂端を0.5mLのMTEC分化培地で洗浄します。基底腔にのみ0.75mLの分化培地を加え、頂端室の細胞を空気にさらしたまま空気液界面(ALI)を開始します。
  8. 2〜3日ごとに、頂端の細胞を分化培地で洗浄し、基底培地を置き換えます。細胞をALIで21日間分化させます。

5. 繊毛上皮細胞の免疫標識および画像診断

  1. ALIの7日目、14日目、21日目に細胞を4%のパラホルムアルデヒド(PFA)で固定します。
  2. 抗FoxJ1抗体で細胞の免疫標識を行い、運動性繊毛形成に不可欠な転写因子FoxJ1を検出します。25,26ページと、抗アセチル化α-チューブリン抗体を検出して、運動性繊毛の構造マーカーであるアセチル化α-チューブリンを検出します。これは公表済みプロトコル27,28,29に基づいて行われます。
    注意:PFAは有害な化学物質なので、細胞固定時は適切なPPE(最低限ニトリル手袋と白衣)を着用してください。
  3. 40×または60×の対物レンズを用いて共焦点顕微鏡で免疫標識細胞の画像を取得します。各ステップサイズが0.5 μmで、深さ10μmにまたがるZスタックを集めます。
  4. レーザー出力、検出器の利得、露出設定を設定し、信号飽和を防ぎ、サンプル間で取得パラメータを同等に保つようにします。
  5. FIJIイメージングソフトウェアの細胞カウンタープラグインを用いて、FoxJ1陽性細胞またはアセチル化チューブリン陽性細胞を、関心領域ごとの総細胞割合(DAPI陽性)として定量化します。
  6. GraphPadのPrismソフトウェア(バージョン10.0)では、Shapiro-Wilk検定でデータ分布の正規性を評価した後、グラフを生成し、二尾の学生t検定を用いた統計解析を行います。

6. 分化気道上皮の薬物治療

  1. ALI21日目に、室温の無菌管で分化培地(3つの挿入部分の細胞用3mL)を準備します。
  2. 100 mMのストック溶液(10 mM NaOHで調製)から7.5 μLのジエチレントリアミン–NONOateまたはDETA/NOを加え、最終濃度250 μMの3 mLに到達します。逆さまに混ぜてすぐに使ってください。
  3. 最終溶液を3つの基底細胞それぞれに750μL加え、37°Cで24時間インキュベークします。
  4. 100 mM L-NAMEストック溶液(DMSOで調製)から30 μLを加え、1 mΩ-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L–NAME)をMTEC分化培地に加え、合計3 mLを製造します。
  5. 最終溶液を3つの基底室それぞれに750μL加え、37°Cで24時間培養します。
  6. 未処理群のジメチルスルホキシド(DMSO)30 μLを基礎培地3 mL(1% v/v)に加えます。
  7. 最終溶液を750μL、未処理の3つの挿入室の基底室に加えます。

7. サンプル採取

注:NOA分析には、3つの挿入物から培地、頂端洗浄液、細胞溶解サンプルを統合する必要があります。

  1. ALI22日目に、各実験群3つの挿入物からそれぞれ750μLの基礎培地から基底培地を採取し、分化気道上皮からサンプルを採取します。
  2. 細胞を含まないインサートで培養された基礎培地を収集し、潜在的な外部亜硝酸塩汚染を考慮したブランクコントロールとして利用します。
  3. 3つのインサートから基礎培地をプールし、NOAに注入するまですぐに-20°Cで保存します。
  4. 上皮の頂端粘液に存在する亜硝酸塩/NOを採取するために、各挿入体の細胞の上に50μLの予温されたPBS(1×)バッファー(滅菌、アリクート済み、凍結済み)を加え、37°Cで30分間培養します。
    注:PBSで細胞を30分間培養して頂端洗浄を行っている間、基底腔にPBSを追加して細胞の両側の水和を維持することも可能です。
  5. 上皮の上に粘液を含むPBSを採取してください。
  6. 3つのインサートからPBS洗浄液をプールし、各実験条件から約150μLの頂端粘液/PBSを得て、これは2回のNOA注射に十分な量です。
  7. 先端ウォッシュサンプルは-20°Cで保存し、使用後は使用してください。
  8. また、PBS洗浄バッファーはNOA注入時にブランクコントロールとして使用するために保管してください。
  9. 細胞の頂端側と基底側を3つのインサートで、予温されたPBS500μLを2回洗います。
  10. アキュターゼ溶液500μLを頂端に加え、細胞が膜から完全に剥離するまで15〜20分間培養します。
  11. 完全に剥離したら、血清フリーのRPMI-1640培地を細胞に追加します(培地とアキュターゼの比率3:1)。
  12. 3つのインサートから分離した細胞を1本のチューブにまとめます。
  13. セルを3000 × g で4°Cで5分間回転させます。
  14. 細胞ペレットを50μLの溶解液(RIPAバッファー+Halt 1×プロテアーゼ阻害剤カクテル)に再懸濁し、氷上で45分間培養します。
  15. 溶解液を14,800 × g で4°Cで20分間回し、上清液を採取します。
  16. 全細胞溶解液3μLを用いて、ビシンコニン酸(BCA)アッセイでタンパク質濃度を測定します。
  17. 残った解体溶液をRIPAバッファーで1:1で希釈し、50μLのNOA注入を2回分の容量にします。
  18. 分解液は-80°Cで保存し、NOAに-20°Cで注入します。
  19. 細胞ペレットを再懸浮させるためのRIPAバッファーを-20°Cで保管し、溶解液サンプルのブランクおよび汚染防止に使用します。

8. NOA校正および試料注入

  1. 三ヨウ化物試薬として、ヨウ化カリウム400mgとヨウ素250mgを氷河酢酸28 mLと超純水8 mLに溶かして調製します。
  2. トリヨード試薬の調製は、適切な個人用防護具(白衣、手袋、目の保護具)を用いて化学煙幕で行われます。
    注意:ヨウ素や氷河性酢酸は有害で、皮膚や目に刺激や腐食を引き起こす可能性があります。
  3. 常温で保存し、準備から2週間以内に使用してください。
  4. 亜硝酸塩を含まない水に1 mMの亜硝酸ナトリウムストック溶液を準備します。
  5. 使用まで-20°Cの状態で保存してください。
  6. 注入直前にPBSで新しい作業標準液(0.125–4.0 μM)を準備します。
    注意:NOA校正には、亜硝酸塩汚染を最小限に抑えるために、無菌で厳重にキャップされたPBSを使用してください。
  7. 窒素(N2)キャリアガスをオンにし、システム内にガスの流れを開始します。
  8. ガラスパージ容器を組み立て、4mLのトリヨード試薬と20μLの1:10で希釈した発泡剤を加えます。
  9. スクリューキャップで固定されたセプタムでしっかりとキャップをして、気密性を確保してください。
  10. NaOHトラップに水酸化ナトリウム(NaOH)を10mL注ぎます。
  11. NOA機器(nCLD 88)の表示画面で「 測定」「ガス」「レンジ」を選択します。
  12. 計測器を MR2:50.00に設定し、NOの0から50ppmの測定範囲に対応し、フィルター設定のために 「Fast 」を選択します。
  13. 窒素ガス圧力を調整し、原子炉圧力が27〜29 psi(186〜200 kPa)の間で安定するまで調整します。
  14. NOAに接続されたコンピュータでeDAQチャートソフトウェアを開きます。
  15. 取得範囲を10/s、電圧を10Vに設定します。
  16. チャンネル 設定>設定に移動し、 チャンネル1を選択してください。
  17. NOAソフトウェアで表示スケールを 2:1 に設定してください。
  18. NOA機器とソフトウェアでデータ取得を開始します。
  19. 基準値を安定させるまでモニタリングしてください。
  20. ハミルトンシリンジを使ってパージ血管内に10μLのPBSを注入し、ベースラインの安定性を確認します。
  21. 各注入ごとに化学発光信号を記録してください。
  22. 0.125μM亜硝酸塩標準液を10μLをパージ容器に注入します。
  23. 亜硝酸塩標準ごとに2回繰り返し、後で平均化される重複測定値が得られます。
  24. 各注入を コメント タブに注釈(例:10 μL 0.5 μM 亜硝酸塩)に注釈を付けます。
  25. 注射器を糸くずのないティッシュで拭き、無菌亜硝酸塩フリーの水で3〜4回洗い流して余分なトリヨードを除去します。
  26. この洗浄工程は注射ごとに繰り返します。
  27. インジェクション間(20〜30秒)に信号がベースラインに戻るまで待ちます。
  28. フロー解析ウィンドウを開きます。
  29. 分析表の各注入のピーク高さと時間値を確認してください。
  30. 各ピークをハイライトし、選択を調整して曲線下面積(AUC)を計算します。
  31. ディスプレイを S から C に切り替えてキャリブレーションモードを有効にしてください。
  32. 「 量 」欄に各標準の既知の亜硝酸塩量を入力します。
  33. 標準カーブを生成するには 「キャリブレーションカーブ 」ボタンをクリックしてください。
  34. キャリブレーションカーブが受け入れ基準(R2 ≥ 0.99)を満たしているか確認してください。
  35. 氷上でALI培養から採取した生物サンプルを解凍します。
  36. 50μLのブランクセルフリー培地をパージ容器に注入します。
  37. 各基底培地サンプルを50μLずつパージ容器に注入します。
  38. 各注入ごとに化学発光信号を記録します。
  39. 各サンプルごとに重複注射(50μLずつ)を行います。
    注:50μLの注入は頻繁に気泡が発生します。この問題を抑えるために、パージ容器内でトリヨウ化試薬を定期的にアンチフォームに交換してください。
  40. 注入前に コメントタブに 各サンプルに注釈を付けてください。
  41. 細胞遊離PBS(頂端ブランク)50μLをパージ容器に注入します。
  42. 頂端ウォッシュサンプル(1サンプルあたり50μLを2回注入)を注入し、対応する信号ピークを記録します。
  43. RIPAバッファーを2回注入し、その後解体サンプル(1サンプルあたり50μLを2回注入)を挿入し、対応する信号ピークを記録します。
    注意:化学発光トレースが基準線まで戻り安定するまで必ず待ちます。20〜30秒待ってから次のサンプルを注入します。
  44. サンプル注入終了時にフロー 解析 ウィンドウを開きます。
  45. 各サンプルピークをハイライトして曲線下面積(AUC)を計算します。
  46. 標準溶液から生成された校正曲線を用いて各試料の亜硝酸塩濃度を決定します。

9. データ収集、正規化および解析

  1. eDAQソフトウェアの フロー解析 機能からピーク高さ(V)、曲線下面積(V.s)、平均面積を含むデータをExcelファイルにエクスポートします。エクスポートされたファイルは、NOA実験全体の信号トレースの高さ(V)と時間(s)を集計します。
  2. 亜硝酸塩濃度(μM)に注入体積(μL)を掛けてNOAに注入した亜硝酸塩のピコモール(pmol)を算出します。
  3. 対照群(セルフリー培地、PBSウォッシュバッファー、またはRIPAバッファー)で測定した亜硝酸塩のピコモール(pmol)を平均します。
  4. 各50μL試料注入で測定されたpmolから対応する制御値を差し引きます。
  5. 各試料の亜硝酸塩の総ピコモール(pmol)を、注入部分で測定したpmolに採取した正確なサンプル体積を掛けて算出します。培地には750μL、頂端洗浄は150μL、溶質には約90〜100μLを使用します。
  6. さらに、溶解液のみの場合、希釈係数を考慮して亜硝酸塩pmolを2掛けます。
  7. 各サンプルで得られた亜硝酸塩のpmol値を、対応するサンプルの溶解液に含まれる総タンパク質量(μg)で割ることで正規化します。これはBCAアッセイで得られたものです。
  8. 各サンプルごとに重複注射の亜硝酸塩レベル(pmol/μg)を平均します。
  9. GraphPad Prismソフトウェアを用いて各サンプルの正規化された亜硝酸塩レベル(pmol/μg)をプロットします。
  10. シャピロ・ウィルク検定を用いてデータ分布の正規性を評価する。
  11. 両側の学生のt検定を用いて統計解析を行います。

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結果

この手法の全体的な目的は、空気-液体界面(ALI)で分化したマウス気管上皮細胞(MTEC)培養中の一酸化窒素(NO)レベルを定量化することです。一次細胞は確立されたプロトコルに従って分離・分化されます。ALIでの21日間の治療期間中に、細胞は繊毛細胞27,28を含む擬重層気道上皮に分化します。繊毛化のレベルは、Foxj1またはアセチル化α-チューブリンの免疫標識によって評価されました。分化が進むにつれて、分化細胞の核内でのFoxJ1発現が徐々に増加することが検出されました(図1A)、それに伴いアセチル化α-チューブリンによって標識された多毛毛を持つ細胞の数も増加しました(図1B)。ALI21日目までに、気道上皮細胞の約1...

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ディスカッション

気道上皮内の多毛細胞はNO合成とシグナル伝達に不可欠であり、これは毛様体拍動、粘液のクリアランス、気道恒常性の調節に不可欠です。NOは非常に反応性の高い分子であり、NOレベルのわずかな変化でも気道疾患1,2,3,4と関連しています。したがって、NOレベルを細かく調整することは正常な気道機能に不可欠です。ここでは、空気-液体界面(ALI)で培養された繊毛化気道上皮細胞におけるNO産生の代理として亜硝酸塩を検出する方法を説明します。マウス気管上皮細胞(MTEC)は、既に発表された方法27,28

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開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

研究デザインに関する指導をいただいたマーク・T・グラッドウィン博士(メリーランド大学医学部学部長兼教授)に感謝いたします。また、メリーランド大学医学部のコンフォーカル顕微鏡コア(ボルチモア、メリーランド州)に共焦点顕微鏡資源へのアクセスを提供してくださったことにも感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金5R01HL168775のパオラ・コルティ博士への支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248免疫染色用に1:2000で希釈
50 mL 遠心分離管フィルター（0.22 µm）CellTreat229710無菌溶液の調製用
500 mL フィルターユニットThermoFisher Scientific566-0020無菌培地調製用
AccutaseSigmaA6964
アンホテリシンBThermoFisher Scientific15290026
ウシ下垂体エキスThermoFisher Scientific13028014
ウシ血清アルブミンSigmaA7906
コレラ毒素SigmaC8052
コラーゲンIThermoFisher ScientificA1048301
共焦点顕微鏡NikonW1 スピニングディスク Ti2 倒立型顕微鏡とHamamatsu sCMOSカメラ
Corning Transwell インサートSigmaCLS3460
Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
DMEM/F-12 培地ThermoFisher Scientific11330032
DNAse ISigmaDN25
胎児ウシ血清SigmaF4135
Halt 1X プロテアーゼ阻害剤カクテルThermoFisher Scientific1860932
Ham's F1-12 栄養混合物ThermoFisher Scientific11765054
インスリン溶液SigmaI0516
イソプロテレノール塩酸塩SigmaI6504
ケラチノサイト血清フリー培地ThermoFisher Scientific17005042
マウス上皮成長因子SigmaE4127
N(G)-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル（L-NAME）SigmaN5751
NuSerumCorning355100
ペニシリン-ストレプトマイシンSigmaP4333
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）ThermoFisher Scientific10010023
Pierce BCA タンパク質アッセイキットThermoFisher Scientific23227
プロナーゼSigma10165921001
レチノイン酸SigmaR2625
Rho キナーゼ阻害剤（Y-27632 塩酸塩）Cayman ChemicalTOM-C837Z37
RIPA 緩衝液SigmaR0278
RPMI-1640 培地ThermoFisher Scientific11875093
亜硝酸ナトリウム SigmaS2252
トランスフェリンSigmaT8158
α-アセチル化チューブリン抗体（マウス）SigmaT6793免疫染色用に1:200で希釈
α-FoxJ1 抗体（マウス）ThermoFisher Scientific14-9965-80免疫染色用に1:200で希釈
α-マウスCy3 二次抗体ThermoFisher ScientificA10521免疫染色用に1:1000で希釈
γ-セクレターゼ阻害剤 IX（DAPT）SigmaD5942

参考文献

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