Method Article

ヒトアスパラギン合成酵素を用いたクライオEMマップからタンパク質立体構造の動態を可視化するワークフロー

DOI:

10.3791/70312

⸱

March 20th, 2026

1Department of Biochemistry, Molecular Biology and Pharmacology, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、CryoSPARCでの3D変動解析(3DVA)とPhenixでの変異的精緻化の方法を概説し、クライオEMデータの立体構造異質性を解析する方法を示しています。ヒトアスパラギン合成酵素を例に挙げ、変動マップの作成、主成分の可視化、対応する原子モデルの精緻化方法を概説しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、CryoSPARCでの3D変動解析(3DVA)とPhenixでの変異性精準化を用いて、単一粒子クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)データにおける立体構造異質性を解析するための包括的なワークフローを提示します。このプロトコルは、粒子画像から導出された主成分に沿った変動マップの計算方法、構造変動の主要なモードの可視化、そして個々の変動系に対して対応する原子モデルのアンサンブルを精緻化する方法を説明しています。その結果、3Dバリアリティマップのシリーズ、離散立体構造を表す精緻なマルチモデル原子構造、比較構造解析や映画生成に適した可視化ファイルが含まれます。このワークフローは、通常2.0〜6.0 Åの解像度範囲のクライオEM再構築に広く適用でき、構造異質性をバックボーンおよびサイドチェーンレベルで意味のある解釈が可能です。特に、離散分類だけでは解決できない連続領域運動、ヒンジ曲げ運動、協調した局所再配置の捕捉に適しています。変動マップと洗練されたモデルアンサンブルの組み合わせにより、立体構造的極端値の直接的な構造比較が可能になり、二乗平均平方根変動(RMSF)計算などの定量的解析を支援し、動的構造的特徴を生化学的または機能的仮説に結びつける枠組みを提供します。ヒトアスパラギン合成酵素(ASNS)を例として用い、ワークフローの実用的な実装を示します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高分子構造における立体構造的異質性の特性評価は、単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)解析においてますます重要な側面となっています。このプロトコルの目的は、CryoSPARC1 の三次元変動分析(3DVA)とPhenix2での変動性精細化を組み合わせて、クライオEMデータセットから構造変動の支配的なモードを直接抽出、可視化、精錬するための実用的なワークフローを提供することです。本記事は、この計算アプローチが自分のデータに適切かどうか、またワークフローによって生成される出力の種類を理解するためのガイドを目的としています。

従来の実験技術(例:水素-重水素交換、NMR分光法、質量分析法)はタンパク質の運動に関する貴重な情報を提供しますが、分子サイズ、サンプル要件、実験の複雑さに制限されることが多いです。クライオEMの進歩により、大規模かつ異質な系の高分解能構造決定が可能となり、粒子集団内の立体構造変動の解析が可能になりました。CryoSPARC1で実装された3D変動解析(3DVA)は、クライオEM粒子データセットを支配的で連続的な構造変異モードを記述する主成分に分解します。Phenix2での変動性の精緻化と組み合わせることで、各主成分に沿った離散的な位置に対応する原子モデルを生成し、実験データから導き出された代替構造の可視化と比較が可能になります。

このプロトコルは、ほぼ原子から中間解像度(通常は約2〜6 Å)で再構築されたクライオEMデータセットに最適です。高解像度では、バックボーンの再配置や限定的な側鎖変動を捉えることができます。6、低解像度ではドメインレベルや二次構造の動きを特定するのにより適しています。この手法は、ヒンジ運動、ドメイン呼吸、ドメインやサブユニット間の協調的な再配置など、データセット内に広く存在する支配的で連続的な運動モードを捉えるのに適しています。十分な粒子数と角度のカバレッジが不可欠であり、側鎖の位置が曖昧な柔軟な領域や弱解像度の領域では解釈が制限されることがあります。フォーカス分類8や広範なサブクラス化戦略と比較して、3D変動性精緻化のワークフローは、離散クラスではなく連続的な軌跡として立体構造異質性を表現します。このため、この手法は酵素、分子マシン、多ドメイン複合体の探索的解析に特に有用であり、複数の構造を採取することが期待されます。

ヒトアスパラギン合成酵素(ASNS)が、プロトコルの実装を示すための例として用いられています。ASNSはグルタミン依存性アミドトランスフェラーゼで、分子内アンモニアトンネル9,10でつながれた2つの機能ドメインから成ります。これまでの研究では、Arg-142などの残基に関わる立体構造の変化がこのトンネル6の変調に寄与することが示唆されています。本記事では、ASNSは3DVAと変動性精緻化が変動マップの生成、精緻化された原子モデルアンサンブル、可視化をどのように生成するかを示す代表的なシステムとしてのみ機能します。詳細な機構的解釈は結果および議論のセクションに委ねられます。分子動態(MD)シミュレーションはしばしば構造的風景を探る補完的なアプローチとして用いられますが、このプロトコルにはMDは必須ではありません。MDシミュレーションとの比較はオプションの下流解析として実施されることもありますが、ここで説明するワークフロー(図1)は、クライオEMデータから立体構造異質性の抽出と可視化に専念しています。

図1
図1。ワークフローの概要。 単一粒子データからコンセンサス・クライオEMマップを再構築し、三次元変動解析(3DVA)を用いて主成分に沿った変動性マップを作成します。バリアビリティリファインメント(Phenix.varref)は、コンセンサス原子モデルを用いて対応する原子モデルを生成し、可視化と比較を行います。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. データ準備

  1. コンセンサスEMマップの生成
    1. 単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)を用いて、高分子錯体のコンセンサス3D構造を決定します。
    2. クライオグリッド上でビトリファイサンプルを撮影し、直接電子検出器を備えた高電圧透過電子顕微鏡を用いて画像化します。
    3. 収集された映画を処理してビームによる運動の補正、イメージングパラメータの推定、粒子画像の選択を行います。
    4. 粒子の反復分類と精緻化を行い、コンセンサスEMマップを作成します。
    5. 3D変動分析(3DVA)が実装されるため、CryoSPARC(v4以上)13を使用してデータ処理を行います。
  2. 合意モデルを生成する
    1. 原子モデルを構築し、コンセンサスマップに基づいて洗練させてください。標準基準を用いて洗練されたモデルの品質を検証する
      注:ASNSでは、構造はテンプレートベースの粒子選択戦略を用いて決定されました。DON修飾ヒトASNS(PDB 6GQ3)9のX線構造から得られたテンプレートを用いて、CryoSPARC13で高品質な粒子を効率的に選抜しました。これらの粒子は2次元分類、Ab initio再構成、C2対称性を課した異種的かつ非一様な精緻化を繰り返し、3.5 Åのコンセンサス写像を得ました。原子モデルは、結晶構造9をEMマップに組み込み、その後Phenix14,15で実空間の精緻化、Coot16で手動調整を行って生成され、6で記述された最終的な合意ASNS構造を生成しました。

2. 3D変動分析(3DVA)の実施

  1. 最終的な精錬にはパーティクルスタックとマスク(最終的な洗練マップではありません)を使いましょう
    注意:多くの場合、非均一な精錬作業の結果が3DVAに使われます。
  2. CryoSPARCで3Dの変動性ジョブを作成します。非一様な精錬ジョブから入力のパーティクルスタックとマスクを入力します。
  3. 解くモード数を設定する:主成分(PC)の数を5に。
    注:高分子構造は三次元空間に存在するため、主要な空間的運動モードを記述するには一般的に少なくとも3つのPCが必要です。機能的に重要な、より小さいかもしれない追加の構造変異を見落とさないように、さらに2つのPCが含められました。
  4. フィルターの解像度を4.0 Åに、ハイパス解像度を20に設定してください。他のパラメータはすべてデフォルトのままにしてください。仕事を始めろ。
    注:「フィルタ解像度」は4.0 Åに設定され、データセット全体の品質に合いつつ高周波ノイズへの過学習を避けるように設定されました。最終的なコンセンサスマップは3.5 Åの解像度で決定されたため、やや低いフィルタ分解能(4.0 Å)を適用することで、変動解析は分解能限界付近のノイズよりも実際の構造的動きに焦点を当てることができました。
  5. 出力として変動体積の集合を取得します(図2A)

3. 3D変動表示の実施

  1. CryoSPARCで3D変動表示ジョブを作成し、3DVAで識別された連続的な立体構造変化を可視化します。
  2. 3DVAジョブから生成されるパーティクルスタックと可変体を入力します。
  3. 出力モードとして 「シンプル」 を選択してください(下記参照)。
  4. フィルター解像度を4.0に設定し、ハイパス解像度を20に設定してください。他のパラメータはすべてデフォルトのままにしてください。仕事を始めろ。
  5. 結果として20の変動マップ(フレーム0から19)を取得し、5つの主成分(PC)に対応します(図2B)。
    注:3D変動表示プログラムの「シンプルモード」は、各主成分に沿った立体構造の変化をわかりやすく可視化します。このモードは3DVAによって特定された極限状態間に線形軌道を生成し、粒子集団内の運動を明確かつ直接的に解釈することを可能にします。

4. 映画およびフェニックス3D変数の精錬のためのデータ準備

  1. 3DVA変動マップをダウンロード:PCの0-4用変動マップを含むzipファイル(合計5つのzip)をCryoSPARCからダウンロードできます。
  2. ディレクトリの整理:親フォルダ(例:3DVA/)を作成します。内部で、各主要コンポーネント(comp0, comp1, comp2, comp3, comp4)ごとにサブフォルダを作成します。
  3. 各zipファイルを対応するフォルダに移動し、内容を解凍します。
  4. 各フォルダに20の変動マップ(フレーム0-19)が含まれているか確認し、comp1-comp4について繰り返します。
    注意:各主要コンポーネントごとに別々のフォルダを維持し、PC間でフレームが混ざるのを防ぎましょう。

5. UCSFキメラ(任意)17でクイックムービーを準備する

  1. ボリュームシリーズツールを開き、Chimeraを起動し、Volume Series→Tools → Volume Dataへ移動してください。新しい Volume Series ウィンドウが開きます。
  2. マップを読み込む:「開いて」をクリックし、1つの主成分(例:comp0)に対応する20のマップを選択します。
  3. 可視化パラメータを調整してください:ボリュームビューアーを開き、適切な密度の閾値を設定し、マップに色を割り当てます。
    注:この例では 空色 が使われています(図3)。
  4. プレビューモーション: ボリュームシリーズ ウィンドウで再生方向をOscillateに設定し、再生をクリックするとフレーム0→19→0までの連続的なトランジションが表示されます。
  5. 追加コンポーネントについては繰り返し:必要に応じて他の主要コンポーネントについてもステップ5.2-5.4を繰り返します。
  6. コマンドライン入力を使って映画ファイルを生成します:Chimeraコマンドラインを開き、 補助コーディングファイル1を実行して映画をエクスポートします。
    注:コンポーネントごとの20フレームmrcシリーズ(例:compX_frame000-019.mrc)はPhenix 3Dの可変調整の入力です。コンポーネントフォルダは(comp0-comp4)分けて、PC間でフレームが混ざるのを防ぎましょう。

6. フェニックスにおける変動性精緻化によるモデル生成

注:Phenix.varrefは、入力マップとモデルへの完全なパスが指定されていれば、任意のディレクトリから実行可能です。しかし、組織の明確さのために、各PCごとに専用のサブディレクトリで精錬を行うことが推奨されます。

  1. 最終的な洗練されたコンセンサスモデルファイルを各PCに対応するサブディレクトリにコピーします。
  2. 各サブディレクトリ内から、以下の構文を使ってコマンドラインからPhenix.varrefを実行します。
    phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.MRC Resolution=4 nproc=20 models_per_map=50
  3. 解像度を4.0 Åに設定して、3DVAマップの実効解像度に合わせます
  4. nprocを利用可能なプロセッサの数(この例では20個、ただし利用可能な計算資源によって変動します)に設定します。
  5. models_per_mapを50モデル(デフォルト)に設定してください。
    注:各マップに対して、3DVAデータの解像度に合わせて制約を調整した50モデルが生成されます。各マップに最適なモデルは自動的に保持されます。その結果、出力ファイルには20の変動マップに対応する20の精緻モデルが含まれています。出力は20の改良モデルを含むPDBバンドルと個別の地図ファイルで構成されています。
  6. バリアリティの精錬中に追加のマップシャープニングは適用しないでください。CryoSPARCで生成された変動マップ(4.0 Åでフィルタリング済み)をphenix.varrefの入力として直接使用してください。

7. 可視化

  1. ChimeraX18 でPDBバンドルを開いて、20台の精製モデルすべてを同時に読み込みます。
  2. モデルパネルを使って、個々のフレームや興味のある特定のモデルを選択的に表示し、比較や分析を行います(図4)。あるいは、各改良モデルをChimeraXやChimeraで個別に開くことも可能です。

8. 分析のためのデータ準備

注意:上記の構文を実行すると、20の変数モデルと各マップを含むPDBバンドルが生成されます。ほとんどの解析では、フレーム0とフレーム19に対応する2つのモデルのみで十分であり、これらは選択された主成分(PC)に沿った2つの極端な立体構造状態を表します。

  1. ChimeraXでPDBバンドルを開き、モデル1.1(フレーム0)とモデル1.20(フレーム19)を選択し、それぞれのモデルを別々のPDBファイルとして保存します(図4)。
  2. 得られたPDBファイルを編集して、関心のある残基を分離します。これは手動またはPhenix.pdb.toolsを使って行うことができます。
  3. 2つの修正されたPDBファイルを比較し、背骨や側鎖の立体構造変化を特定します。
  4. 2つのPDBモデルを比較するために、Chimeraの MatchMaker 関数を使って修正された構造を重ね合わせます。
    注意:信頼性の高いアライメントのために、 MatchMaker は通常、少なくとも10〜15個の重なり残留物が必要です。私たちの場合は6つの残基のみが分析されました。しかし、ASNSのホモ二メリック特性を活用することで成功した重ね合わせが達成されました。鎖Aには6残基のみが残っていましたが、鎖Bは無傷で整列の基準となりました。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このセクションでは、3D変動分析(3DVA)および変動調整ワークフローによって生成される代表的な出力を提示し、それらの解釈に関する指針を提供します。ヒトアスパラギン合成酵素(ASNS)は、プロトコルによって成功した成果、共通のアーティファクト、比較分析を示すための例示的なデータセットとして用いられます。3DVA由来の変動マップの全セットとASNSデータセットから生成された対応する精緻化モデルは、Zenodoの公開リポジトリに保存されています。詳細なアクセス情報は 補足表1に記載されています。

3DVAの変動マップと変動動画。
3DVAの主な出力は、構造変動1の支配的なモードを記述する変動マップのセットであり、各主成分(PC)に沿った順序付けられたマップ系列として可視化されています。ASNSデータセットでは、野生型(WT)およびR142I変異データセット(補足動画1および2)の両方で主成分0(PC0)に対応する地図系列が生成されま...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重要なプロトコルステップと意思決定ポイント
このプロトコルの効果的な活用は、ワークフローのいくつかの重要なステップに依存します。最終的なクライオEM精錬に使用される粒子スタックとマスクの品質は極めて重要であり、3D変動解析(3DVA)は後処理されたマップではなく直接これらの入力に基づいて動作します。主成分(PC)の数の選択は、データセットの規模と予想される複雑さを反映すべきです。成分が少なすぎると変動性が過小に反映され、多すぎるとノイズ支配的なモードが導入されることがあります。3DVAおよび変動精錬の両方で使用される解像度パラメータは、データの有効解像度と一致するべきです。どのフレームを可視化するか比較するかなどの下流の選択は、関心のある構造的特徴に基づいて導かれるべきです。

トラブルシューティングとよくある落とし穴
変動結果の解釈を複雑にする要因がいくつかあります。見かけの動きは、意味のある立体構造的変動ではなく、弱いまたは不十分に分...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には利益相反を主張するものはありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本記事の元となった出版物への貢献をしてくださった高木、朱、ヴォス、チャプタル、アルカロ、リチャーズ各研究室のメンバーに感謝します。著者は、本研究を支援してくださったインディアナ大学医学部電子顕微鏡施設およびNIH/NIGMS(S10 OD028723)に感謝の意を表します。追加の資金はインディアナ大学医学部(Y.T.)、一部はNIGMS(R01GM111695からY.T.)、およびアメリカがん協会(DBG-23-1038947-01-IBCDからY.T.)から提供されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARC v4.4+ストラクチュラ・バイオテクノロジーhttps://cryosparc.comクライオEM処理用のソフトウェア
フェニックス v1.24+フェニックス・コンソーシアムhttps://phenix-online.org変動性の精緻化のためのソフトウェア
UCSFキメラUCSFバイオコンピューティング、可視化、情報学リソースhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/分子可視化用ソフトウェア
UCSF ChimeraXUCSFバイオコンピューティング、可視化、情報学リソースhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/分子可視化用ソフトウェア
CPPTRAJAMBER 分子動力学ソフトウェアスイートhttps://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/RMSF計算のためのPythonツール
Linux Workstation(社内で組立されたGPUベースのシステム)
ワークステーションケーススーパーマイクロhttps://www.supermicro.comワークステーションケース:Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4Uサーバー スーパーシャーシ 
CPUインテル https://www.intel.comCPU:XEON E5-2690V3 x2
母委員会スーパーマイクロhttps://www.supermicro.comマザーボード:Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 マザーボード X10DAI-O
記憶重要だhttps://www.crucial.comメモリ:Crucial 64GBキット(16GBx4)DDR4 2133(PC4-2133)DR x4 ECC登録済み。288ピンサーバーメモリCT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
ハードドライブウェスタンデジタルhttps://www.westerndigital.comHDD:WD RE 4TBエンタープライズハードドライブ
RAIDコントローラLSIロジックhttps://www.broadcom.comRAIDコントローラー:LSI LOGIC MegaRAID SAS 9271-8iキット
GPUNVIDIA https://www.nvidia.com24GB GDDR5メモリを搭載したQuadro M6000グラフィックスカード

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).
  2. Afonine, P. V., et al. Conformational space exploration of cryo-EM structures by variability refinement. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1865 (4), 184133(2023).
  3. Schwartz, S. D. Protein Dynamics and Enzymatic Catalysis. J Phys Chem B. 127 (12), 2649-2660 (2023).
  4. Xu, D., Meisburger, S. P., Ando, N. Correlated Motions in Structural Biology. Biochemistry. 60 (30), 2331-2340 (2021).
  5. Gao, S., Klinman, J. P. Functional roles of enzyme dynamics in accelerating active site chemistry: Emerging techniques and changing concepts. Curr Opin Struct Biol. 75, 102434(2022).
  6. Coricello, A., et al. 3D variability analysis reveals a hidden conformational change controlling ammonia transport in human asparagine synthetase. Nat Commun. 15 (1), 10538(2024).
  7. Gobet, A., et al. Rhodamine6G and Hoechst33342 narrow BmrA conformational spectrum for a more efficient use of ATP. Nat Commun. 16 (1), 1745(2025).
  8. Barchet, C., et al. Focused classifications and refinements in high-resolution single particle cryo-EM analysis. J Struct Biol. 215 (4), 108015(2023).
  9. Zhu, W., et al. High-resolution crystal structure of human asparagine synthetase enables analysis of inhibitor binding and selectivity. Commun Biol. 2, 345(2019).
  10. Richards, N. G., Schuster, S. M. Mechanistic issues in asparagine synthetase catalysis. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 72, 145-198 (1998).
  11. Matsumoto, S., Ishida, S., Terayama, K., Okuno, Y. Quantitative analysis of protein dynamics using a deep learning technique combined with experimental cryo-EM density data and MD simulations. Biophys Physicobiol. 20 (2), e200022(2023).
  12. Vant, J. W., et al. Exploring cryo-electron microscopy with molecular dynamics. Biochem Soc Trans. 50 (1), 569-581 (2022).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Adams, P., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
  15. Afonine, P. V., et al. New tools for the analysis and validation of cryo-EM maps and atomic models. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 9), 814-840 (2018).
  16. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004).
  17. Pettersen, E., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  19. Roe, D. R., Cheatham, T. E. 3rd PTRAJ and CPPTRAJ: Software for Processing and Analysis of Molecular Dynamics Trajectory Data. J Chem Theory Comput. 9 (7), 3084-3095 (2013).

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