前庭性スワノーママウスモデルにおける腫瘍誘発性失調の特徴付け

サマリー

腫瘍誘発性失調症の研究および前庭神経鞘瘤マウスモデルにおける神経機能維持療法の評価のための行動アッセイパネルを開発しました。

要約

NF2関連シュワナマトーシス(NF2-SWN)は、 NF2 腫瘍抑制遺伝子の生殖細胞変異によって引き起こされる常染色体優性腫瘍素因症候群です。この疾患は、両側前庭性スワノノーマ(VS)の発症を特徴とし、進行性に拡大し、聴力低下、バランスの乱れ、運動失調症状を引き起こし、患者の生活の質に深刻な影響を与えます。現在、FDA承認の薬理学的治療法は利用可能ではありません。神経学的欠損の中でも、運動失調は特に衰弱させるものの研究不足の現れであり、その評価のための堅牢な前臨床モデルの欠如が主な理由です。本研究では、VS関連難聴および運動失調の定位性マウスモデルにおいて、腫瘍誘発性運動失調を体系的に評価するための行動解析のセットを開発しました。これらの検査により、腫瘍負荷に起因するバランスおよび運動協調の欠損を定量的に測定することが可能です。この実験プラットフォームは、腫瘍誘発性小脳機能障害の機構的研究を可能にし、治療戦略の前臨床評価に貴重なツールを提供します。行動評価を腫瘍生物学や聴力検査と統合することで、このアプローチは腫瘍抑制効果と神経保護効果の両方の特徴付けを促進します。最終的に、これらのアッセイは運動失調を特徴とする他の神経障害にも応用可能な多様な枠組みを提供し、 NF2-SWNを超えてその有用性を拡大します。

概要

NF2関連シュワナマトーシス(NF2-SWN)は、細胞骨格タンパク質マーリン1をコードする NF2 腫瘍抑制遺伝子の変異によって引き起こされる、まれで優性遺伝性の腫瘍素因症候群^です。マーリン機能の喪失は細胞増殖、癒着、生存を調節するシグナル伝達経路を妨げ、神経系の複数の良性腫瘍の発症リスクを高めます。 NF2-SWNの特徴は、両側の前庭性シュワノノーマ(VS)—非悪性のシュワン細胞由来腫瘍—が前庭蝸牛神経に沿って発生する—の形成です。これらの腫瘍は徐々に拡大し、隣接する神経構造を圧迫し、感音神経性難聴、 耳鳴り、顔面神経機能障害を引き起こします².

両側VSの患者はしばしば前庭神経および内耳前庭器官に進行性の損傷を負い、慢性的な不均衡、運動失調、歩行不安定性として現れる重度の前庭機能障害を引き起こし、可動性や生活の質を著しく損なう³。前庭機能障害の程度は、腫瘍負荷や神経の関与と相関することが多いです。これらの症状は腫瘍管理や聴力保護の努力後も続くことが多く、機械的圧迫を超えた複雑な神経生物学的メカニズムを示唆しています^4,5。めまい障害の調査、歩行分析、前庭眼反射(VOR)検査、姿勢造影などの臨床的手法が前庭障害の定量化に用いられていますが、腫瘍誘発性失調の根本的なメカニズムは依然として十分に解明されていません。分子理解の進展やベバシズマブのような標的治療の導入にもかかわらず、NF2-SWN患者の聴力とバランス機能の両方を確実に維持できるFDA承認の治療法は依然として存在しません。前庭症状の管理は依然として大部分が支持的であり、未解決の臨床的ニーズが大きくないことを示しています。

VS関連運動失調症の臨床管理を改善する大きな障壁は、患者に見られる前庭および運動の協調欠損を忠実に再現する前臨床モデルの欠如です。既存のVS動物モデルの多くは腫瘍の成長や難聴に焦点を当てており、特徴的なバランス障害や協調障害を再現していません。さらに、前臨床環境で運動失調や前庭機能障害を客観的に評価するための標準化された行動アッセイは十分に確立されていません。このギャップは機構の調査を妨げ、前庭機能の保存を目的とした候補療法の評価を制限します。

ここでは、測定可能な運動失調表現型を示すVSマウスモデルの開発と、腫瘍誘発性運動失調を定量化するために特別に設計された行動アッセイのパネルを報告します。このモデルは、VSに関連する前庭機能障害のメカニズムを調査し、 NF2-SWN患者のバランス、協調、神経機能全体の回復を目的とした治療的介入の有効性を評価するための非常に必要なプラットフォームを提供します。

プロトコル

動物実験は、マサチューセッツ総合病院ブリガム病院(MGB)の動物ケア・利用委員会(MGB)が承認したプロトコルに従って実施されました。

1. 動物モデル

1. 免疫能力を持つC57/FVBマウスにNf2^-/-細胞(マウスNf2^-/-シュワン細胞を発現するガウスィア・ルシフェラーゼ報告遺伝子Gluc)を接種します。立体定位注射装置(図1A)を用いて、マウスに2,500個の腫瘍細胞1μLを右半球のCPA領域に注入^します。
2. 8〜12週齢のオスとメスのマウス(比率1:1)の両方を用い、十分な統計的検出力を確保し、性別に関する差異の可能性を調べます。ネズミはケージごとに4匹ずつグループで飼い、12時間の明暗サイクルで飼い、餌や水は 自由に用意します。
   注:神経鞘腫は患者の前庭神経に発生するため、小脳角(CPA)モデルを用いました。CPAモデルはVSの頭蓋内微小環境を再現します。
3. シャムグループ:動物手術および腫瘍細胞移植が運動失調に与える影響を評価するために、マウスに偽手術とCPA領域への生理食塩水注射を行うシャム手術グループを含みます。
4. 対照群として腫瘍を持たないマウス群を含めること。
5. 腫瘍進行を監視するために、ガウスシア・ルシフェラーゼリポーター遺伝子を発現する Nf2^-/- 細胞(Gluc)を使用し、着床後3日ごとに血漿グルックを測定します。
6. 簡単に、凝固を防ぐために13μLの血液をEDTAチューブに集めます。血液サンプルを96ウェルプレートに移し、前述の6,7,8,9と同様にグルック活性を測定します。

2. 失調検査

1. 4つの行動アッセイを固定された順序で実施し、動物ごとのばらつきを最小限に抑えましょう。検査は以下の順で実施します:(1) 後肢の抱っこテスト、(2) レッジテスト、(3) 歩行評価、(4) 後弯症の評価。テスト間には最低でも2〜5分の休憩間隔を設け、マウスを元のケージに戻してください。休憩中に動物を監視し、通常の探索行動が再開してから次の検査に進みます。過度のストレスや疲労の兆候が見られた場合は検査を中止してください。10匹のマウスコホートに対して、検査間の休息期間を含め、約45〜60分以内に4回の運動失調アッセイを完了してください。
2. 後肢の拘束試験
   注:後肢抱っこテストは、マウスの神経筋協調、運動の緊張、姿勢制御を評価します。運動失調のマウスは後肢が後退したり腹部に向かって握りつく動きを示し、運動協調や筋緊張調節の障害を反映^{しています5。}
   1. 尾の付け根を優しく掴み、不快感を防げるように軽くしっかりと握ります。驚きの反応を減らすために、ケージの蓋や手で軽く動物を支えてから持ち上げます。
   2. マウスをゆっくり持ち上げて、体を完全に伸ばして障害物のない状態で空中に浮かせます。ネズミはケージやテスト面から少なくとも10cm上に保ちましょう。
   3. 約10秒間、宙吊りの姿勢を維持し、動物を回転させたり振り回したりせずに後肢と尾の位置を観察します。
   4. 後肢の姿勢を以下に説明するように評価します。
      1. 両後肢が腹部から外側に伸びている場合、正常な姿勢を特定します。
      2. 片方または両方の肢が腹部に向かって後退したり交差したりする異常姿勢を特定し、運動失調や神経障害に関連する後肢の抱擁を示します。
   5. あらかじめ定められたスコアリングシステムを使って行動を記録したり、ブラインドな事後分析のために短い動画を撮影してください。
      注意:ストレスを最小限に抑えるために、各テストの時間は≤10秒に制限してください。
3. レッジ試験
   注:この足場テストはマウスのバランス、協調性、微細運動制御を評価します。これは、動物が狭い縁を歩きながら安全にホームケージに降りてバランスを崩さない能力を測定します。小脳機能障害や前庭運動失調を持つマウスは、この作業中に滑ったり転倒したり、不安定な姿勢を示すことが多い⁵。
   1. ケージは安定した平らな場所にあり、ベンチの高さ(~1 m)に置きます。
   2. テストケージの一端(図1C)をハウジングケース(図1D)に接続し、ケージ間に垂直の隙間や障害物がないようにして、ネズミがスムーズかつ自然にホームケージ(図1B)にジャンプや落下せずに降り込めるようにします。
   3. 三脚にビデオカメラを設置し、30°〜45°の角度で縁に向け、横方向の動きと下降の両方を捉えます。
   4. 照明を調整してまぶしさを最小限に抑え、ネズミの手足や尾がはっきり見えるようにしましょう。
   5. 尾の付け根でネズミを優しく持ち上げ、もう一方の手で体を支えます。ネズミを足場の中央に置き、4本の足が水面に触れるようにします。ネズミがバランスを取り、警戒しているように見えたときだけ尾を離してください。
   6. ネズミが外部からの指示なしに足場を自由に歩けるようにしましょう。ネズミが少なくとも10秒、またはケージの中に降りるまで記録してください。
   7. 滑らずに足場の上でバランスを取り、檻やプラットフォームに向かって足場を歩く能力を観察してください。
   8. マウス1匹あたり3回の独立試験を行い、試験間は休息間隔~2分を保ちます。動物同士の足場の表面を70%エタノールで清掃し、匂いの手がかりを除去します。
   9. すべてのテストは、一定の照明と最小限の背景雑音や振動を避けた静かな環境で行ってください。同じ日に過度に繰り返しテストを行うのは避けてください。疲労や学習の影響がパフォーマンスに影響を与えることがあります。
4. 歩行評価
   注:歩行評価テストは、自由に動くマウスの運動協調性、歩幅パターン、姿勢安定性を評価します。運動失調のマウスは歩幅が短く、動きが不安定で、足の位置が不規則であることが多く、協調性や^{バランスコントロールの}欠如を示しています5.
   1. まっすぐで平らな滑走路に白いコピー用紙(8.5インチ×11インチ)を敷きます。ホームケージを紙の端に置いて、ネズミが紙の上を歩くよう促します。
   2. 前足と後足には、無毒のインクパッドを使って対照的な2色(例:前足は青、後足は赤)を軽く塗ります(図1E)。
   3. 滑走路の開始端にマウスを置き、外部からの押さえずに紙の上を自由に歩かせます。
   4. 以下のパラメータを観察し測定します。
      歩幅長:同じ足の連続した位置間の距離。
      ベース幅:左右の後ろ足跡の横方向距離。
   5. 1匹のマウスにつき2〜3回のランを行い、テストの合間に休憩を取ります。
      注意:無毒で速乾性のあるインクを使用し、肉球のみをコーティングしてください。試験後は紙を交換してにじみを防ぎましょう。インクを少量に塗り、足跡がぼやけないようにしてください。インクが多すぎると歩幅測定の精度が低下します。
5. 後弯症の評価
   注:後弯症の評価は、自然運動中の脊椎のアライメントや姿勢異常を評価するものです。神経学的または筋肉機能障害を持つマウスは、持続的な背側の湾曲や脊椎の前曲げを示す^{ことが多い5。}
   1. ネズミを表面に置き、数秒間自由に歩いたり探索させたりします。急な動きで一時的に姿勢が変わる可能性があるため、動物を驚かせないようにしましょう。
   2. 横から短い動画を録画して、幹の曲線を記録しましょう。
   3. 歩行中のマウスの姿勢を観察し、以下のように脊椎の整列や胴体の曲がりに注目してください。
      1. マウスが背中をまっすぐまたはやや反らせ、滑らかな体勢で正常な姿勢を識別します。
      2. 異常な姿勢を特徴とすると、異常な姿勢を特定します。背骨は異常に前曲り、体は硬く、歩行時の柔軟性が低下します。

3. 失調テストの解析

注意:観察者のバイアスを最小限に抑えるため、実験グループ割り当てを盲検した観察者による行動採点はすべて実施してください。

1. レーチテストの採点
   1. ネズミが足場を滑らかに歩き、バランスを保ち、滑らずにケージに降りた場合は3点をつけます。
   2. マウスがためらいや軽い足の滑りなどの軽度の障害を示しても回復し安全に降りた場合は2点をつけます。
   3. 頻繁な滑り、しゃがみ姿勢、バランスのために尾を過度に使うこと、下降の遅れなど、中程度の障害を示す場合はスコア1をつけます。
   4. マウスが重度の障害を示したり、バランスを取れなかったり、足場から落ちたり、動こうとしない場合は0点をつけます。
2. 後肢掴みテストの採点
   1. ネズミが後肢を一貫して外側に広げ、握りつぶしの証拠がない場合は3点をつけます。
   2. マウスが軽度の障害(例えば片方の後肢の断続的な後退)を示した場合は、スコア2をつけます。
   3. マウスが腹部近くで両後肢が部分的に後退する中程度の障害を示す場合はスコア1をつけます。
   4. 観察期間の大半で両後肢を腹部にしっかりと抱えている状態で重度の障害を示した場合は、スコアを0につけます。
3. 歩様の採点
   1. マウスが一定で協調の取れた歩き方でまっすぐ移動する場合、スコア3を割り当てます。
   2. マウスが軽度の障害(ゆっくり歩き、軽度の不安定さや横方向の偏り、片側に足を引きずる、広い円形の道を進むなど)を示す場合は2点をつけます。
   3. 中程度の障害(明確な歩き方の乱れ、2本または3本の前足だけで歩く、体の一部を引きずる、狭い円を描く動きなど)がある場合は1点をつけます。
   4. マウスが重度の障害を示し、効果的に歩行できず、動かずにいる、または制御不能に横に転がる場合は0点をつけます。
4. 後弯の採点
   1. マウスが休憩中も歩行中もまっすぐ後ろに倒れたままであれば、スコアを3に割り当てます。
   2. マウスが軽度の障害を示し、動作時に背中がわずかに曲がり、まっすぐに伸びる場合はスコア2をつけます。
   3. マウスが中程度の障害を示し、安静時に中程度に背中を丸め、歩行中も曲がったままであればスコア1をつけます。
   4. 観察期間中、マウスが重度の障害を示し、通常の動きが制限されるほどの背中を丸めている場合は0点をつけます。

4. 評価者間信頼性評価

1. 観察者は、正式な採点前に代表的な例映像を用いて採点基準の解釈を標準化する訓練を行います。
2. 観察者バイアスを最小限に抑えるために、治療群と実験時点を盲検した2人の訓練済み観察者が独立してすべての行動テストを採点します。
3. コーエンのカッパ係数を用いて各行動アッセイの評価者間信頼性を定量化します。カッパ値を次のように解釈します:<0.40、一致が悪い;0.40-0.60、中程度の一致;0.60-0.80、かなりの合意;そして>0.80、ほぼ完全一致。
4. 録画動画の共同レビューでスコアの不一致を解決し、コンセンサ^{ススコアに}到達します。

結果

CPA腫瘍の増殖はVSマウスモデルで運動失調を引き起こします

腫瘍誘発性運動失調を評価するために、2つの実験コホートを設立しました。まず、動物手術と腫瘍細胞移植が運動失調に与える影響を評価するために、マウスは偽手術とCPA領域への生理食塩水注射を受けました。偽群マウスの失調症状は、未手術の対照群マウスと比較して行われました。第2コホートでは、Nf2^-/-腫瘍をCPA領域に注入し、失調症状を腫瘍を持たない正常マウスと比較して研究しました。

運動失調の評価のために、i) レッジテスト、ii) 後肢拘束テスト、iii) 歩行評価、iv) 後弯症評価を行いました。これら4つのアッセイのスコアを合計して、全体的な失調スコアを算出しました。運動失調症状のない正常で腫瘍を持たないマウスは、常に最大失調スコア12を示し、スコアリングシステムの信頼性を裏付けています。このプロトコルによる運動失調の検出は、運動失調スコアの進行性低下によって反映されており、これは運動失調の重...

ディスカッション

ここで述べた行動アッセイは、VSおよび関連する前庭疾患のマウスモデルにおける失調および運動協調欠損を評価するための堅牢かつ定量的な枠組みを提供します。ハンチントン病や脊髄小脳運動失^{調症などの}神経変性疾患モデルの確立されたプロトコルを応用したこれらの検査は、NF2-SWNにおける腫瘍誘発性前庭機能障害の特性評価に適しています。複数の行動指標を組み合わせることで、両側VS患者で頻繁に影響を受ける運動協調、バランス、姿勢、移動の包括的な評価が可能です。

各アッセイは運動パフォーマンスの補完的な側面を測定します。この崖のテストは動的バランスと固有受容感に挑戦し、前庭神経障害に起因する微妙な協調性の欠損を明らかにします。後肢固定検査は 肢の引っ込め行動を定量化することで神経筋の筋力低下や脳幹機能障...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
胎児用牛血清	サーモフィッシャー	A5670701
GloMax 96マイクロプレートルミノメーター	プロメガ	GM3000
マッケッソンブループロシージャリングアンダーパッド	マッケソン	75402
シュワン細胞成長補助およびnbsp;	サイエンセル	1752