方法論記事

鯨類モニタリングのためのホエールウォッチング船からの環境DNAサンプリング

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DOI：

10.3791/70334

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2026年4月10日

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1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

この記事について

サマリー

このプロトコルは、鯨類環境DNA(eDNA)サンプルをホエールウォッチング船から採取するための標準化されたワークフローを記述しています。研究者や訓練を受けた市民科学者の実現可能性が優先され、環境条件、ろ過時間、濁度、船内物流が実際の適用限界を定めます。

要約

環境DNA(eDNA)は鯨類の監視に非侵襲的なアプローチを提供しますが、運用プラットフォームからの広範な応用には標準化され実現可能なサンプリングワークフローが必要です。本研究は、研究者や訓練を受けた市民科学者が定められた環境および物流条件下で実施するために設計された、鯨類のeDNA採取プロトコルを説明しています。この手法は、フルークプリントを対象とした海水収集、自己保存フィルターを用いた船上ろ過、下流の分子解析を統合し、実際の条件下で運用可能なデータ生成を支援しています。このプロトコルは、2024年に北大西洋および地中海の3地域(アイスランド、ポルトガル、イタリア)で実施された協調フィールドキャンペーンで実施され、複数の鯨類を対象としました。手法の性能は、ザトウクジラ(Megaptera novaeangliae)のミトコンドリアDNAを標的とした新たに開発された種特異的定量PCRアッセイを用いて評価され、環境および物流条件の変化下でも一貫した検出率を示しました。現場での実施と汚染管理に関する実践的な指針を提供することで、このプロトコルは再現可能なeDNAベースの鯨類モニタリングを支援し、海洋生物多様性研究における地域間の比較可能性を促進します。

概要

鯨類やその他の広範囲に分布する海洋大型動物の効果的な保全管理は、生物多様性保護のために不可欠です。鯨類は頂点捕食者であり生態系工学者として、栄養管理、栄養循環、海洋盆地全体の生態系の回復力に寄与しています。しかし、これら高度に移動する種の包括的な生態学的知識の生成は依然として困難であり、多くの場合、資源集約型のモニタリングプログラムに依存しています。生検サンプリング、写真識別、受動的音響モニタリング、衛星テレメトリー、航空調査などの従来の手法は、鯨類生態に関する重要な洞察をもたらしてきました。3,4,5,6,7 しかし、これらの方法はしばしばコストが高く、物流的にも負担が大きく、空間的にも制約があり、侵襲的であり、厳格な倫理的・規制的監督の対象となります 8 .その結果、サンプリングの頻度、地理的カバー範囲、関係者参加の機会は、特に広範囲または希少種の研究において限られていることが多いです。

環境DNA(eDNA、生物が環境に放出する遺伝物質と定義)サンプリングは、水域サンプルから水生生物を検出するための強力で非侵襲的な手法として浮上しています。ミトコンドリアDNA断片を標的とした種特異的定量PCR(qPCR)アッセイにより、クジラ類を含む海洋分類群の高感度かつ特異的な検出が可能です(11,12,14)。存在/不在検出を超えて、相対的なeDNA信号強度や標的DNA配列は、近接性、相対的存在量、集団レベルの遺伝的パターンに関する貴重な情報を提供します15,16,17,18,19。さらに、クジラの近くで採取された環境サンプルには、被食種、共生体、寄生虫などの共存する分類群のDNAが含まれていることが多く、より広範な生態学的関連を支持しています 20,21,22。これらの進展は、eDNAベースのアプローチが従来の手法を補完し、海洋システム全体で鯨類研究の範囲を拡大する可能性を示しています(23,24)。

これらの利点にもかかわらず、海洋大型動物のeDNAベースのモニタリングは、特にDNAが急速に希釈され、標的種が広範囲かつ低密度で分布する開放型海洋システムにおいて、代表的なサンプリング、空間的カバレッジ、方法論的再現性に関して継続的な課題に直面しています。これらの制約に対処するには、広範囲にわたる空間的・時間的スケールに適用可能なスケーラブルで運用可能なサンプリングフレームワークが必要です。市民科学イニシアチブは生態学的データ収集の拡大と海洋保全への一般参加促進に効果的であることが証明されており、大規模なeDNAベースのモニタリングの有望な道となっています 27,28,29,30。ホエールウォッチング船は、あまり活用されていないがeDNAサンプリングに非常に適したプラットフォームであり、季節や地域を問わず鯨類生息地への定期的なアクセスを提供します。世界のホエールウォッチング産業は広範な運用ネットワークを支えています。34、過去の研究では、商業船、フェリーなど他の機会主義的なプラットフォームから鯨類のeDNAを採取することの実現可能性が示されており、写真識別や行動観察と統合された標的サンプリングも含まれます。.eDNA研究の急速な拡大は大幅な方法論的革新をもたらしましたが、海洋システムごとの生物学的多様性や技術革新のスピードは、プロトコルの調和や研究間の比較可能性確保の取り組みを複雑にしています。したがって、標準化されつつも適応可能な現場手法は、特に大規模な多国籍モニタリングイニシアチブにおいて不可欠です。

eDNA検出は、ろ過水量、ろ過戦略、ろ過材料、孔径によって影響を受けます。より大きな体積をろ過することで、一般的にeDNAの生成率と脊椎動物標的(クジラ類を含む)の検出確率が向上します。しかし、生産的または濁った水域では、ろ過効率が急速なフィルター詰まりによって制約されることがあります(43,44)。これにより、達成可能な体積と運用実現可能性(45,46)とのトレードオフが必要となります。尾びれ(クジラの尾の動きによって生じる表面の乱れ)からのサンプリングは、最近脱落した生物物質が水面付近に集中しているため、鯨類のeDNA検出性を高めることが一貫して示されています。密閉型の自己保存フィルターシステムを使用することで、取り扱い手順や汚染リスクが減り、市民科学の応用に適しています(38,42)。さらに、生物学的複製やルーチンフィールドコントロールの導入により、検出失敗を最小限に抑え、データの信頼性を高めます(49,50,51)。

プロトコル開発と検証
eWHALEプロジェクト52 は、ヨーロッパ各地の研究者、ホエールウォッチングオペレーター、市民科学者を統合し、eDNAを用いて海洋メガファウナを監視する国際的な取り組みです。サンプリングは、北大西洋および地中海全域の複数の鯨類を対象にしており、地域ごとの適応を組み合わせたコアプロトコルを用いて、現地の環境や物流条件を考慮しています。

ここでは、2024年にアイスランドのスカルファンディ湾、ポルトガルのアゾレス諸島、イタリアのリグーリア海での協調的な現地調査で収集された308の海水eDNAサンプル(1サンプルあたり2回の重複を含む)と21件の現地対照群を分析し、洗練された、ホエールウォッチング船から鯨類eDNAを収集するための標準化された開始から終了までのプロトコルを提示します。この方法は、フルークプリントを標的とした海水の収集、自己保存型eDNAフィルターを用いた船上ろ過、そして下流の分子解析を統合しています。

このプロトコルは、訓練を受けた研究者や市民科学者が実際のホエールウォッチング条件下で実施することを想定しており、穏やかな海況から中程度の海況下でもホエールウォッチング活動を妨げることなく船上ろ過を行うことが可能となります。その実施には、参加組織(例:ホエールウォッチング業者、非営利団体、研究機関)との調整が求められ、サンプリング戦略や研究目標を定める必要があります。コアパラメータは再現性とクロススタディの比較性を確保するために固定される必要がありますが、高い濁度、船舶の動き、時間・空間・人員の制約がある場所ではプロトコルに沿った調整が必要になることがあります。そのような適応には、フィルターの種類、達成可能なろ過水量、補助機器が含まれます。各サンプリングキャンペーン内で一貫して適用され、透明性を持って報告されなければなりません。詳細な運用指針と物流上の考慮事項は、プロトコルのステップと議論で提供され、データの品質、透明性、地域との比較可能性を支援しています。

qPCRアッセイ設計
プロトコル性能を評価するために、スカルファンディ湾(アイスランド)53で定期的に見られ、季節的にアゾレス諸島にも見られるよく研究された渡り鳥であるザトウクジラ(Megaptera novaeangliae)のeDNAを現地で採取したサンプルから増幅されました。DNAの溶解、抽出、qPCRワークフローは、eWHALEプロジェクトの4つの参加研究所によるラボラトリーリングテストを通じて最適化され、機関間での一貫性と適用性が向上しました14。

ザトウクジラeDNAの存在を確実に検出するために、ミトコンドリアND5領域を標的とした種特異的MGB(マイナーグルーブバインダー)qPCRアッセイを設計・検証しました(表1参照)。オリゴヌクレオチドプライマーとプローブは、DNA配列のアラインメントおよび解析のためのソフトウェアを用いて作成され、種の特異性と増幅効率を最大化することを目指しました(補足ファイル1-補足図S1)。アッセイ特異性は、ターゲットおよび非ターゲット分類群(バラエノプテラ・アキュトロストラタ、デルフィヌス・デルフィス、フィセター・マクロセファルス、ホモ・サピエンス)を用いてin vitroで評価されました。qPCR標準曲線の作成に用いられたDNA濃度は、組織由来DNA標準42,57,58,59,60から定量されました。アッセイの検出限界(LOD)は、サンプルの95%で正の増幅が得られる最低濃度と定義され、11.61と測定されました。ザトウクジラeDNAの検出は、各サンプルの三重qPCR測定で陽性反応の割合と信号強度(サイクル閾値、Ct値)を推定し、増幅の変動を考慮し、検出信頼性を向上させるためにフィールドサンプルで評価されました。種検出は双方向サンガーシーケンシングで検証され、その後BLAST分析63で確認されました。

qPCRデータは平均±標準偏差(SD)として提示されます。グループ間の統計的有意性は、非パラメータのMann-Whitney U 検定およびWelchの2標本 t検定を用いて評価されました。差異はp<0.05で有意とされました。すべての解析は統計解析ソフトウェア64を用いて実施されました。

プロトコル

倫理と規制遵守
すべての鯨類観察活動およびその後の水質サンプリングは、国および地域の野生生物規制に従って実施されなければなりません。有効なホエールウォッチングまたは研究許可証のもとで運航される認可船からのみサンプリングを行います。地域の規則で定められた目標種からの最小接近距離を維持し、サンプリングのみを目的とした操縦は避けてください。アッセイ検証に使用されるクジラの組織サンプルは、それぞれの地域許可のもとで収集され、eWHALEプロジェクトパートナー間で国および機関の規制に準拠して共有されました。

注意:採取作業前に以下の書類を確認し、必要な機器を揃えてください: 材料表、eDNAサンプリングキット(補足ファイル1-補足図S2)、環境DNAサンプル採取に使用される材料(図1)、およびサンプリング手順の概要および機内ろ過ワークフロー(図2)。

1. eDNAサンプリングの調製

  1. フィールドデータシートやラミネートされたフィールドプロトコル(補足ファイル2 および 補足ファイル3)を含むフィールド文書資料を準備してください。
  2. 予備の手袋、予備のフィルター(サンプル1回のレプリケートにつき1個)、防水マーカー、専用の廃棄物容器を用意してください(図1A)。
    注:取り扱いや汚染リスクを最小限に抑えるために、自己保存型eDNAフィルター(1.2μmの孔径)を使用しましょう。
  3. 船舶の種類や船内構成に適した1つ以上の剛性バケットを準備してください(補足ファイル1-補足図S3)。
    1. バケツは10リットルで永久マーカーで印をつけます。10リットルの処理が難しい場合は、複数の小さなバケツを用意しましょう。
    2. もし水上に届く範囲が限られている場合は、バケツにしっかりとロープを結びます。
      注意:容器の動きが激しい場合、流出を最小限に抑えるために蓋付きのバケツを使用してください(図1B)。
    3. 小容量を組み合わせる二次的なeDNA容器と、必要に応じてバケツの汚染のない輸送を確保するための追加の輸送箱を準備します(図1C)。
  4. 携帯型の蠕動ポンプまたは真空水ポンプを準備します(図1D)。搭乗前にポンプを満充電し、使用直前に電源を切ってください。
  5. 出発前にサンプリング、ろ過、データ記録の役割を割り当ててください。
    注意:すべての機器を扱う際は手袋を着用し、作業間には手袋を交換してください。

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図1:環境DNAサンプル採取に使用されるフィールドワーク材料。 (A) 自己保存型eDNAフィルター、廃棄物容器、希釈した家庭用漂白剤(1:10)入り絞りボトル、手袋、フィールドデータシート、防水ペンを含むツールキット;(B) eDNAサンプリング用のバケットタイプの例;(C) 大量輸送・ろ過用の追加のeDNA容器および船内バケツ輸送用の容器の例;(D) 水ろ過用の携帯ポンプの例。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:ホエールウォッチングボートでの環境DNAサンプリングの概念図。 図は水サンプル採取や船上ろ過を含むガイド付き手順を説明しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. 機器の清掃

  1. 掃除の前に使い捨て手袋を着用してください。
  2. 家庭用漂白剤(次亜塩素酸ナトリウム5〜6%)を浄化水(1回あたり約50mL)で1:10で希釈して漂白剤溶液を準備します。
  3. バケツ、蓋、容器、ポンプチューブのすべての表面に均等に塗布してください。すべての表面に最低2〜5分の漂白剤接触時間を確保してください。
  4. 水道水で3回しっかりすすぐ(図3)。
  5. 材料は安全な場所で自然乾燥させ、安全で清潔な場所に保管してから搭乗してください。

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図3:洗浄機器の手順。 (A) (1:10)希釈した家庭用漂白剤溶液を塗布;(B) DNAフリー手袋で均等に広がること;(C) 水道水で3回しっかりすすがいをする;(D)該当する場合は追加材料(例:eDNA容器)に対しても同じプロセスを繰り返す。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. 水サンプル採取

注意:各船舶またはプラットフォームでは、必要に応じて救命胴衣や浮力オーバーオールの使用を含め、すべての安全規則を遵守してください。

  1. 乗客到着前にすべての資材を機内に持ち込み、指定された清潔な場所に保管してください。
  2. 船のサンプリングのタイミングと船の位置調整を船員と連携させること。
  3. クジラの潜航を予測するために浮上パターンを観察してください(図4)。サンプリング前に新しい手袋をはめてください。
  4. クジラが潜った後、フルークプリントからできるだけ早く(10分以内のタイムラプス)海水20Lを採取し、10Lのサンプルを2回作ります。
  5. 収集された水は、蓋や追加の滅菌容器を使って船内の指定されたろ過ステーションに運び、必要に応じてこぼれを防ぎます。
  6. データシートに種の同定、GPS座標、時間、サンプル複製IDを記録してください。
  7. 報告後すぐに手袋を交換してください。

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図4:ザトウクジラの浮上過程。 (A) クジラの吹き;(B) 潜航前に背中を反らせて尾を持ち上げる;(C)クジラが潜航した後の水面に残るフルークプリントパターン。画像提供:Ocean Missions(A、B、C、2024年)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. eDNAろ過

  1. フィルターバッグを開けて、フィルターを出口のそばでのみ扱ってください(補足ファイル1-補足図S4)。
  2. インレットをスノーケルに挿入し、ポンプのチューブを出口に接続します(図5A,B参照)。
  3. フィルターハウジングを水に浸さずにシュノーケルを水サンプルに浸します(図5C)。
  4. ポンプ(ポンプの種類については 材料表 を参照)を高速で安定した流量に設定してください。
  5. 流量の安定性を監視しながら10Lのフィルターを連続的に使い(気泡、裂け目、破損、密封不良の有無を確認しましょう)
    注意:ろ過は最大45分で終了してください。
  6. フィルターを逆さまにして、ポンプを30〜60秒稼働させて残留水を除去してください。フィルターハウジング内に目に見える湿気が残っていないか確認してください。
  7. ポンプの電源を切り、チューブを切ります。
  8. シュノーケルは廃棄物容器に捨て、フィルターを元の袋に入れてすぐにラベルを貼ります。
  9. フィルターは、機内で密閉された硬質容器や冷却ボックス(周囲>温度が20°Cの場合)に保管し、直射日光や乗客エリアから離れた場所で保管してください。
  10. 手袋を交換し、2回目の複製のためにフィルターを繰り返してください。

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図5:オンボードろ過セットアップの手順。 (A) フィルターの入口(白い部分)をシュノーケル(チューブ)に接続;(B) ポンプのチューブをフィルター出口(黄色の部分)に接続する;(C)シュノーケルの一部を水サンプルに浸すこと。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

5. 現場のネガティブコントロールとデータ報告

  1. フルークプリント5サンプルごとにフィールドネガティブコントロールを1つフィルタリングします。
  2. 陸に戻った直後、機器の清掃前にターゲットDNAフリーの水を使用してください。
  3. 各旅行後にすべてのデータをデジタルeDNAサンプリングスプレッドシートに転送してください(補足ファイル4)。

6. ろ過の保管と出荷

  1. 自己保存型eDNAフィルターは、安全で乾燥した容器の中、日陰の常温室、または20°Cを超える場合は冷蔵庫で保管し、発送前に3ヶ月以内に保管してください。
  2. 発送前にフィルターバッグの湿気を目で確認してください。
  3. フィルターは断熱容器に入れて氷嚢とともにラベルを貼り、指定された検査室へ配送してください。

7. 実験室分析

注:すべての検査室手順は、十分な換気とPCR用の作業台を備えた専用のUV滅菌室で、DNAフリー手袋と防護服(55、67、68)を使用して実施してください。

  1. DNA溶解
    1. フィルターごとに2mLの反応チューブをラベル付けしてください。
    2. フィルターを200mLのエルレンマイヤーフラスコに入れ、ゴム製の蓋を捨てます(図6A)。
    3. DNAフリー鉗子を使い、膜(補足ファイル1-補足図S5)を三角形に折りたたみ、先端を下向きにして2mL反応管に移します(図6B-D)。
    4. 各反応チューブに380μLのTESバッファーと20μLのプロテイナーゼK(材料 表参照)を加えると、400μLの溶解バッファーが得られます(図6E)。
    5. 短時間渦を巻き起こし、56°Cで≥3時間攪拌しながら抱卵します(図6F)。
    6. 遠心分離機チューブは18,626 g ×室温で10分間投与します。
      注意:透明から薄色の溶解液は消化が良好であることを示します。
      注:分解液が-20°Cで保存されている場合、この段階でプロトコルを一時停止することがあります。
  2. DNA抽出
    1. 抽出前に56°Cで10分間溶除します。
    2. ウォッシュプレートおよび洗脱板におけるピペット抽出試薬(負のコントロールおよびピペッティング誤差を考慮したもの)69 ( 補足ファイル1-補足表S1参照)。
    3. TESバッファーを使って、各プレートに1枚の抽出ブランクを含めてください。
    4. 各Bind plateのウェルに300 μLの溶解液を移します。各ウェルにバッファAL300μLとイソプロピルアルコール300μLを加えます。総溶解液量が300μLを超える場合は複数のバインドプレートを使用し、1ウェルあたり30μLの磁性粒子を1ウェルごとに追加して核酸結合を行います(材料表参照)。
    5. Bindプレートをロッドカバーで覆います。
    6. 磁気ビーズベースの実験ロボットで、2つの結合プレート(合計400μL溶離液;材料 表および図7参照 )および自動抽出プロトコルの予備DNA取り込みプログラムを実行してください。
    7. 抽出用の化学物質は指定された廃棄物容器に処分してください。
    8. 溶出したDNAを標識済み1.5 mL反応チューブに移し、−20°Cで保存します。
      注意:この段階でプロトコルは一時的に停止される場合があります。この時点で追加的な阻害剤除去の手順が実施されることがあります。
  3. qPCR
    1. 製造元の指示に従い、組織抽出物と蛍光ベースの高感度dsDNAアッセイを用いて標的種のDNA標準を準備・定量します(材料表)。10 ng/μL11,55 から開始する直列希釈(1:10)により8点標準曲線を生成する。qPCR前にアリコートの標準を配置し、凍結融解サイクルを最小限に抑えること。
      注意:この段階でプロトコルは一時的に停止される場合があります。
    2. すべてのqPCR反応を96ウェルプレートを用いて三重に準備します。
    3. qPCRプレートごとに1つのノーテンプレートコントロール(分子級水)と1つの抽出ブランクを含めてください。
    4. 補足ファイル1-補足表S2および図8Aに従ってマスターミックスを準備してください。
    5. DNAローディングフード内では、マスターミックスを含む各ウェルに、事前に準備されたDNA標準基と3μLのDNA抽出物を加えます(図8B)。
    6. プレートをシールフィルムで密封します(図8C参照)。
    7. 3,500 × gで10秒間遠心分離し、リアルタイム定量PCRサーモサイクラーに投入します(図8D,E)。
    8. 表2に指定された最適なサイクル条件でアッセイを実行し、製造元のソフトウェア(材料表)を使ってデータを記録します11。

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図6:DNA分解のワークフロー。 (A) 自己保存型eDNAフィルターのゴムキャップを外し、エルレンマイヤーフラスコに入れる;(B) 2組の鉗子を3回火で滅菌する;(C) フィルター膜を折りたたむ;(D) 2 mLのチューブに挿入すること;(E) 溶解バッファーとプロテナーゼKを加え、(F) サンプルを56°Cで3時間インキュベーションします。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

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図7:DNA抽出に使用される材料および機器。 (A) 抽出準備のための結合、洗浄、洗出板、消耗品、試薬;(B)サンプル処理に使われる磁気ビーズベースの実験室ロボット。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図8:qPCRのワークフロー。 (A) 事前にUV滅菌された部屋(マスターミックス専用の作業用フードの下で)でマスターミックスを準備する;(B) 示されたパターンに従ってDNAローディングステーションでDNA標準物質、抽出物、制御をロードすること;(C) シールプレート;(D) 遠心分離機;(E) リアルタイム定量PCRサーモサイクラーにロード。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

この最適化プロトコルを用いて2024年には合計154個のフルークプリントサンプル(308個のeDNAフィルター)が採取されました。その中には、3月から11月にかけてスカルファンディ湾(アイスランド;フィールドコントロール9件、ザトウクジラ複製76件)で96フィルター、アゾレス諸島(ポルトガル、フィールドコントロール12件、ザトウクジラ複製15件)が7月に取得、リグリア海(イタリア、フィールドコントロール4件)で61フィルターが取得されました。すべてのサンプルは、自己保存型eDNAフィルターを用いて最大10Lの海水(1フルークプリント1回の複製)を収集しました (表3)。フィールドワーク中に2種類のネガティブコントロールが採取されました。漂白剤洗浄後にろ過された浄水と、港に再入港時に採取した海水です。後者は漂白剤洗浄前に意図的にろ過され、サンプリング中の鯨類eDNAとの交差汚染の可能性を評価しました。各サンプリングサイトからサンプルは2回に分けて、オーストリアのインスブルック大学動物学部応用動物生態学研究ユニットに送られ、実験室で処理されました。

分析および制御性能
44のフィルターの一部(アイスランドのスカルファンディ湾からの2回のフィールドコントロールを含む30回の複製、ポルトガル・アゾレス諸島のファイアル島およびピコ島周辺の1回のフィールドコントロールを含む14回のフィルター)がザトウクジラのeDNAを分析しました(図9)。このシグナルは三重qPCR反応で測定されました。サンプル(すなわちeDNAフィルター)は、qPCRの3回中1回が増幅された場合、陽性とみなされました。本研究における検出限界(LOD)は0.0001 ng/μL(平均LODのCt = 35.8)と計算されました。分析された41種類のフィルターのうち、20台(49%)が増幅を示し、24台(58%)は増幅なしでした。検出不良(Ct値なし)は、標的DNAの欠如または極めて低い濃度を反映している可能性が高いです。検出されなかったのはアゾレス諸島の13フィルター中5フィルター(38%)、アイスランドのフィルター28フィルター中19フィルター(68%)を占めていました。抽出用ブランクはMarVer3アッセイ70を用いて海洋脊椎動物のDNAをスクリーニングしましたが、増幅は検出されず、DNA抽出中の交差汚染は認められませんでした。フィールドコントロール(NC)およびqPCRコントロール(NT)では増幅が得られず、フィールドワークおよびqPCRスクリーニング中の汚染の存在を確認しました(表4)。

20の陽性フィルターのうち、9件(22%)はアッセイの検出限界(LOD;0.0001 ng/μL)を少なくとも1回下回るCt値を得ており、信頼できる検出と分類されました。これにはアゾレス諸島の8つのフィルター中4つ(50%)、アイスランドの12個中5つのフィルター(42%)が含まれていました。さらに11個のフィルター(27%)がLODを超える1つ以上のCt値を検出し、アゾレス諸島から4つ(50%)、アイスランドから7個(58%)が含まれ、検出が妥当であることを示しました(図10)。比較解析では、アゾレス諸島フィルターの平均サイクル閾値(Ct)値がわずかに低く(34.7±3.60)、 n = 8)と比較すると、アイスランドのフィルター(36.9 ± 3.60; n = 10)。マン・ホイットニーU 検定 は、この差が統計的に有意でないことを示しました(U = 199.0、 p = 0.204)。Ct値とDNA信号の強度の反比例を考慮すると、アゾレス諸島のフィルターにおけるターゲットザトウクジラeDNAの濃度がやや高めであることが示されています(図11)。

実現可能性の制約
1回の旅につきフルークプリントのサンプル数は、旅の時間や天候によって異なりました。アゾレスでは約2〜3サンプル(最大6つのeDNAフィルターを獲得)が3時間のツアーで採取され、イタリアでは~8時間で2〜4サンプル(最大8個のフィルターを取得)、アイスランドでは3.2時間のツアー中に1〜2個のサンプル(最大4つのフィルターを取得)が採取されました。アゾレス諸島とイタリアでは、ろ過性能は概ね高い水準でした。アゾレス諸島では10〜15分以内に10リットルの海水が一貫してろ過され、イタリアでは同じ量が約10分でろ過されました。アイスランドでは、ろ過量は4.5〜10L(平均=8.5L)で、調査地域の水中の粒子状物質による頻繁なフィルター詰まりのため、平均ろ過時間は約40分~でした。具体的には、98フィルターのうち46フィルター(47%)で10Lのフィルターが成功し、31フィルター(32%)で7Lから10Lの容量が得られ、21フィルター(21%)で4Lから7Lの容量が得られました(補足ファイル1-補足表S3)。

プロトコルでは、フルークプリント5サンプルごとにフィールド陰性対照1件をろ過することを推奨しています。しかし、運用中のホエールウォッチング条件下では、フィルターの利用可能性の限界、時間制約、輸送遅延などの物流上の制約により、この条件を完全には満たすことはできませんでした。これにより、アイスランドでは1:10.7(9/96)、アゾレス諸島(12/151)、イタリア(4/61)では1:15.3に、制御対照とサンプルの比率は1:10.7に低下しました。これらの逸脱にもかかわらず、現場や検査室で陰性対照群が増幅を示したことはありませんでした。

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図9:サンプル位置の概要。 地図上の黒い点は、アイスランドのスキャルファンディ湾とアゾレス諸島でザトウクジラの尾虫足跡から採取された場所を示しています。eDNAフィルターの名前は対応するサンプリング領域の近くに示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図10:アゾレス諸島およびアイスランドのeDNAフィルターの一部から検出された結果。qPCR平均Ct値およびアゾレスおよびアイスランドの陽性検出(少なくとも1回の陽性PCR複製)に対するDNA信号強度、SDおよびLODを用います。バーはLODに対する信号強度で色分けされます。濃い青=強い信号(Ct ≤ 35.8)は信頼できる検出、淡い青=弱い信号(Ct > 35.8)はもっともらしい検出を示します。SDエラーバーはPCR複製間の変動を表します。赤い破線はLOD(Ct = 35.8)を示します。平均Ct値は各バーの上に示されています。略語:Ct = サイクル閾値;SD = 標準偏差;LOD = 検出限界。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図11:アゾレスおよびアイスランドからのザトウクジラDNA検出の平均サイクル閾値。 ボックスプロット内の黒い線は中央値を示し、赤い四角は平均Ct値(SD)、ひげはアゾレス諸島とアイスランドの最小値と最大値を示しています。マン・ホイットニーU 検定 は、この差が統計的に有意でないことを示しました(U = 199.0、 p = 0.204)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1:ND5標的qPCRアッセイのプライマーおよびプローブ配列。 これらの配列には、順方向および逆方向プライマー、MGBプローブ配列(5′-3′)、最適アニーリング温度、および検出限界(LOD)が含まれます。(*)LODとは、標的種のDNA中で最も低いDNA濃度(ng/μL)であり、その際のPCR複製の≥95%が正の増幅をもたらした状態と定義されます。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2:ザトウクジラeDNA qPCRアッセイの最適化されたサイクル条件。 最適化されたqPCR設定は、95°Cで10分間(酵素活性化)、その後95°Cで40サイクル15秒(変性)、60°Cで90秒(アニーリング/拡張)です。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表3:フィールドサンプリング構成の概要。 アゾレス諸島、アイスランド、イタリア全域のサンプリング地域、フィールドパートナー、船舶タイプ、対象種、サンプリング期間、サンプル複製の概要。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表4:環境サンプルおよび管理に対するqPCR検出要約。 陽性検出(黄色で強調)、qPCRのCt値の再現、検出結果が示されます。少なくとも1つのqPCR複製で増幅が認められた場合、サンプルは陽性と分類されました。「No Ct」は増幅なしを示し、陰性対照は増幅なしを示し、アッセイ性能とLODを定義するために用いられる M. novaeangliae 標準希釈系列は表の下部に含まれます。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル1:プロトコル適用に関する補足図と表を含み、プライマー設計の eDNAサンプリングキット、ホエールウォッチング用船舶の種類、自己保存型eDNAフィルター特性、DNA抽出およびqPCR反応用の試薬体積、サンプリング領域間のろ過速度の変動など。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル2:鯨類eDNAサンプリング中に使用されたフィールドデータシート。 巡航メタデータ、鯨類観測、サンプルおよびフィルター情報を記録するための標準化されたフォーム。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル3:鯨類eDNA採取の現場 手順(機器清掃、海水収集、船内ろ過、サンプル報告、保管を含む)。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル4:クジラ類eDNAサンプリングスプレッドシートテンプレート。 サンプル採取および船上ろ過後のサンプリング情報を記録するための標準化されたフォーム。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

運用実現可能性と現地実施
ここで提示されるプロトコルは、検出感度と現実世界の制約のバランスを取った標準化されたeDNAワークフローを提供します。大量のフルークプリント標的サンプリング、自己保存型密閉フィルターを用いた船内ろ過、標準化された汚染管理措置を統合することで、このプロトコルは地域やサンプリングキャンペーンに適用可能な再現可能な枠組みを提供します。このアプローチは、従来の海洋モニタリング技術のコスト効率が高く拡張性のあるeDNAの補完手段としての認識の高まりと一致しています。

これまでの鯨類eDNA研究は、大型研究船からのトランセクトに基づく海水採取や、鯨類目撃地付近での機会的少量サンプリングに依存してきました。トランセクトベースのアプローチは広範な空間的カバーを可能にしますが、希釈され時間的に断絶されたDNAシグナルを捉えることが多いため、表面近くでサンプリングが行われても希少または一時的な種71の検出が制限され、通常は専門的な容器とインフラが必要です 25,37,72。逆に、浮上しているクジラの近くで少量サンプリングを行うと遭遇特異性が向上しますが、水量の制限と不均一なろ過方法のために偽陰性が発生しやすいと72,73。明示的にフルークプリントを標的にし、船内で大量のフィルタリングを行うことで、ここで提示されたワークフローは、ホエールウォッチングに典型的な時間的・空間的制約の中でも低濃度の鯨類eDNAを捕捉する確率を高めます。密閉型の自己保存フィルターの使用により、取り扱いや汚染リスクがさらに最小限に抑えられ、現場で設置された保存バッファーの必要性がなくなり、制約された船内条件下での物流が簡素化されます。

相互比較性を確保するために、以下のパラメータはサンプリングキャンペーン内で固定されなければなりません:目に見える鯨類の尾虫足跡から直接海水を採取すること;1枚のフルークプリントにつき2回の10リットルの生物複製、自己保存型eDNAフィルターの使用により、標準化された汚染管理措置中に機内ろ過を形成し、定められた最低周波数での通常のフィールド負制御を含む。および適切な対照群のもとで3回ずつ実施された種特異的qPCRスクリーニング。他のパラメータは、水収集装置と取り扱い、ろ過孔径、ポンプの種類とチューブ構成、ろ過時間および詰まり条件下での達成可能なろ過容積、船内サンプルロジスティクス、出荷前の短期保管条件など、方法論的枠組みを損なうことなく変化することがあります。eDNA研究の処理ステップの多くが変動するため、すべてのサンプリングおよび分析ステップの厳密な報告が強く推奨されます。

このプロトコルの実現可能性は、穏やかから中程度の海況(≤ボーフォート3)で、低〜中程度の濁度の海況において、船内の時間と空間が1つあたり2つのeDNAフィルターを処理し、フィルターごとに10Lのろ過水量を処理できる場合に最も高く評価されます。実際には、訓練を受けた科学者はボーフォート3まで採測可能ですが、市民科学者は船の動きや乱気流のため、穏やかな環境でのみ作業すべきです(ボーフォート1-2)、ボーフォート3では時折ホエールウォッチングツアーが行われています。DNA分解を最小限に抑えるため、水採取後できるだけ早くろ過を開始すべきです。船の風下側や下側からのサンプリングなど、表面eDNAのプロペラによる希釈を最小限に抑えるサンプリング戦略は、ターゲット精度と信頼性の高い検出をさらに支援します47。逆方向の操作を避け、バケツに繋がったロープが海水サンプルに接触するのを防ぐことで、汚染リスクをさらに低減し、水生eDNAのベストプラクティスと一致しています。船舶の構成や物流(例:船高、動き、利用可能な船内スペース)に応じて、一貫して適用すれば2つのサンプリング戦略が支持されます。(i) 2つの別々のバケツを使って2つの10Lレプリケートを独立して採取・ろ過するか、(ii) 20Lの水サンプルを1つだけ収集し、密閉された滅菌容器に移して安全に船内輸送し、その後2つの10Lレプリケートに分割してろ過します。フィルター1つあたり10Lのろ過容積は、ホエールウォッチング条件下での検出確率とろ過労力の実用的な妥協点を表しています。

大きな体積は希少または低濃度のeDNAを捕捉する可能性を高め、鯨類研究で一般的な偽陰性を減らす39,40,75。自己保存フィルターや大孔径と組み合わせれば運用可能である42。粒子状負荷の高さ、船舶の動き、デッキスペースの制限、時間的制約はろ過効率や達成可能な体積を低下させ、プロトコルの適用範囲を制限する可能性があります。そのような場合、水量の減少や代替のフィルター孔径の調整など、プロトコルに沿った適応が必要となり、データの比較可能性を維持するためにサンプリングキャンペーン内で一貫して適用する必要があります。移動時間、クジラ遭遇のタイミング、ろ過能力が可能なサンプル数を決定します。標準的な3時間のホエールウォッチングツアーでは、通常は1〜2本(時には3本)のフルークプリントサンプルを完成させても、運営や市民科学体験を妨げることはありません。長期の探検では、サンプリング能力は日々のクジラ観察の努力に応じて増加します(例:イタリアのケーススタディでは1日あたり~8時間)。実際には、観光のピーク時にこれら3か所すべてでeDNAサンプリングを実施することも可能です。

eDNA増幅の成功と汚染制御
特に栄養豊富な水域で採取された環境サンプルには、増幅を抑制し偽陰性を生じさせるPCR阻害剤が含まれている可能性があります76。同じプロジェクト42内のアイスランドサンプルからの過去解析では阻害は検出されませんでしたが、阻害剤除去ステップの導入により一貫した増幅成功が保証され(材料表参照)、水生eDNAワークフローのベストプラクティス推奨事項と一致しています(14,55)。

領域間での一貫したqPCR検出性能は、プロトコルが多様な環境条件下で鯨類eDNAを確実に捕捉できることを示しています。わずかなCt変異は、温度、濁度、生産性の地域差を反映しており、これらがeDNAの放出、分解、分散に影響を与えると考えられています75,76。このアッセイの検出限界(0.0001 ng/μL)は、eWHALEプロジェクト14,11,42で開発された他の検証済み鯨類アッセイで報告されている感度範囲内に収まります。検出率は、これまで発表されたフルークプリントを用いた調査と一致しており、種の行動や浮上頻度が検出成功に与える影響を強調しました(41,42,47)。qPCR定量には組織由来DNA標準が用いられ、海洋eDNA研究で一般的な手法である57,72,77,78,79を反映しています。このアプローチは、特に低濃度かつ異質な環境サンプルに対して絶対量化11,61,80,81,82,83に分散をもたらす可能性がありますが、実際のサンプルの複雑さ55,86を反映しています。.合成標準の使用は定量的再現性や研究間比較性の向上に期待でき、将来の応用に推奨されます11,87。

潜在的な汚染源には、クロスサンプルの移動や、取り扱い段階でのヒトまたは非標的環境DNAの導入があり、これらは誤陽性検出につながる可能性があります88。現場および実験室の処理全体において、特に市民科学活動に典型的な制約のある条件下での厳格な汚染管理が不可欠です。定期的な手袋交換、DNAフリー機器の使用、密閉型ろ過システム、標準化された訓練、現場および実験室での管理の定期的な実施、潜在的な汚染事象の記録、確立された枠組みに基づくアッセイ検証は、データの信頼性と種検出の確保に不可欠です。11,31,49,51,55,89 .プラスチック使用は現場分子サンプリングの避けられない制限ですが、可能な限り消費を最小限に抑え、部分的に生分解性のろ過材を使用しました。

制限、スケーラビリティおよび将来の影響
フィルターの詰まりは、スカルファンディ湾(アイスランド)のような濁った環境や生産性の高い環境では依然として重要な制約であり、懸濁有機物やプランクトン密度がろ過効率43,90を低下させる可能性があります。ろ過時間、流量の減少、フィルター内の気泡の目に見える、ポンプの負荷などのフィルター詰まりの指標を記録し、1回の複製で約45分にろ過時間を制限することで、後流の解釈と比較を支援します。滅菌された浮遊装置を用いてフィルターを吊るしたり、重力給餌のろ過バッグを使えば、ろ過中の取り扱い時間を短縮できる可能性がありますが、後者は自己保存型eDNAフィルターや大量のフィルター(≥1 L)91には適合しない場合があります。より大きな孔径フィルター(≥ 5μm)はろ過率をさらに向上させる可能性がありますが、鯨類eDNA45,92のパイロットサンプリングでは分類群特異的な検出効率を評価するべきです。

本格的なサンプリング前の重要な考慮事項には、遅延処理よりも船内ろ過を優先すること、水量とフィルター構成の一貫性維持、局所条件下でのろ過最適化のためのパイロットサンプリング実施、船舶容量や航海時間に合ったサンプリングの調整が含まれます。市民科学者による構造化された現場記録を可能にするデジタルデータ入力ツールは、将来の応用に推奨されています93。

この開始から終了までのワークフローの成功裏の適用は、運用制約下での堅牢性を示すとともに、空間、時間、天候、汚染リスクに関連する制限を浮き彫りにし、市民科学の文脈に内在しています。これらの制約にもかかわらず、ホエールウォッチング船は標準化された訓練と監督が提供されるeDNA鯨類モニタリングにおいて強力かつ十分活用されていないプラットフォームとなっています。31,32,42,95。このワークフローを、写真識別、受動音響、生検サンプリングなどの確立された鯨類モニタリングツールと統合することで、遺伝的検出と行動データや人口統計データを結びつけることができます。本研究は種特異的qPCRに基づく検出に焦点を当てていますが、将来的にはDNAメタバーコーディングや集団遺伝解析を統合し、鯨類eDNAモニタリングの生態学的および保全的価値をさらに拡大する可能性があります。

eDNAベースのアプローチが発展し続ける中、このワークフローは遺伝モニタリングを既存の海洋観察・保全プログラムに統合するための拡張可能な基盤を提供します。特に鯨類のホットスポットや敏感な生態系において。

開示事項

ベレン・ガルシア・オビデは、アイスランド北東部フサヴィークに拠点を置く非営利団体「オーシャン・ミッションズ」の創設者兼エグゼクティブディレクターです。オーシャンミッションはアイスランドのホエールウォッチング船や北極探検船からのサンプリングを調整しています。また、フーサヴィークのホエールウォッチング会社ノース・セイリングのeWHALEプロジェクトの代表も務めています。これらの関係は研究の設計、データ収集、分析、結果の解釈に影響を与えませんでした。

謝辞

フィールドワークおよび実験室作業に関わったすべての方々に感謝の意を表します。

i) アイスランドのスカルファンディ湾で採取されたサンプルに参加したエイダン・メイベイ、マッテオ・トサト、アヌーク・アドルフ、ジャンヌ・ラポルテ、ロミ・ニーロ、イザベル・エステルレ;ii) ダニア・テセイ、マイケル・コスタ、リタ・ノルベルト、マルレーネ・シュヴァント、リタ・レイタン、リカルド・ヴェントゥーラ、マルティン・シャウテン、ジャダ・ヴィスコンティーニ、カタリーナ・リーブ、アンソニー・ル・フロック、フランシスコ・ヌネス、レナート・カルドーゾ、ファウスティーヌ・ダリウス、モニーク・シャウテン、ラウラ・ビエト(アゾレス諸島)にて(ポルトガル);iii) サンドラ・シャルハート、オーストリアのヤナ・ロバートソン;そしてiv) サビナ・アイロルディ、マリオ・ガブアルディ、マリーナ・コスタ、モルガナ・ヴィギ、ニーノ・ピエラントニオ、ロベルト・ライネリによるペラゴス保護区(イタリア)でのデータ収集。

本研究は、2021-2022年のBiodivProtect共同研究提案募集のもと、欧州生物多様性パートナーシップのBiodiversa+(欧州委員会GA番号101052342と共同資金提供され、資金提供機関は以下の団体と共同で提供されました:1) アイスランド研究センター(RANNÍS、助成金番号229030)、2) 大学・研究省(MUR)、欧州パートナーシップBiodiversa+ Call 2021 - eWHALEプロジェクトに関するFIRSTおよびIGRUE特別アカウントから。 3) オーストリア科学基金(FWF)[doi: 10.55776/I6389]およびインスブルック大学の出版基金。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
代替eDNAフィルター:SterivexTM /Waterraメルク・ミリポア/ウォーターラ・ポンプス・リミテッドSVHVL10RC/NA0.45 & micro;毛孔の大きさ。eDNA保存バッファーが必要とnbsp;
AW1、AW2、AEバッファQiagen  19081, 19072, 19077抽出中のDNA精製に使用される緩衝液
漂白剤溶液(1:10)DM - Denk mit, Hygienereinigerカスタム表面除染。実験室のすべての工程
バケツボートショップ、釣り道具、アマゾン硬直した。ゴムか硬いプラスチック(10リットル以上)です。サンプリングのセットアップや船内の物流によって、1つまたは複数
クリーンアップ試薬、エクスプレスPCR エクソサップ・イット75001.1.EAサンガーシーケンスのためのPCR産物の調製
冷却ボックス住宅断熱された硬質容器または冷却バッグ
使い捨て手袋、ラージ(L)およびミディアム(M)サイズ、
パウダーフリー		キンバリー・クラーク43431, 55090使い捨てニトリルまたはラテックス手袋、100個入りの箱。必要な量:10回あたり1箱 - 15回のトリップ
DNA標準(3 & μ;L) NAカスタムDNA組織由来の連続希釈(8ポイント、10 ng/µL)はザトウクジラから来ています。qPCRにおけるキャリブレーション
DNA安全な実験室用衣服ファラーノ、PP-総合081-2900これらはすべて実験室の工程の段階です。
eDNAコンテナ住宅店や金物店NA蓋付き、耐久性があり、透明(≥ 10 L)。nbsp;
エリュションプレート、ロッドカバー、ウォッシュプレート、バインドプレートキアゲン19581, 997004, 1031656, 302570DNA抽出に使われるプラスチック 
エタノール(8:10)耐えて、ACS ISOから電話が鳴りました様々なベンチ滅菌。すべての実験室の工程
フィールドデータシート
蛍光を用いた高感度アッセイサーモフィッシャー・サイエンティフィックQ32851Qubit dsDNA高感度アッセイ(サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、アメリカ)
高速遠心分離機(24,000 rpm)ヘティッヒ・ツェントリフューゲン DNAを含む上清液をゴミから分離します。DNA溶解
アイスパック住宅店輸送コンテナ内でのサンプル冷却
IPC順方向および逆方向プライマー統合DNA技術NA標的種DNA増幅に使用されるカスタム製品
IPC PrimeTime qPCRプローブ統合DNA技術NA標的種DNA増幅に使用されるカスタム製品
層流フード ケンドロ・ラボラトリー・プロダクツVFS1206qPCR製剤における試薬調製のための無菌環境
ラミネート図版フィールドプロトコル カスタム
溶解バッファーキアゲン79216DNeasyリシスバッファーAL。TESバッファー+プロテナーゼKの代替品
磁気ビーズ&ナッシュ;ベースドDNAロボットキングフィッシャー Apex 96 PCRヘッド5400910ソフトウェア:BindIx PC 
核酸結合のための磁性粒子(30および微小;L)キアゲン67563Magattract 粒子。DNA抽出において磁気ビーズへのDNA結合を促進します
マスターミックス(5 & mu;L)EMM、ライフ・テクノロジーズ4396838TaqMan 環境マスターミックス(2.0)
ミニプレートスピナー遠心分離機およびラボネットC1000PCRやマイクロプレートから液体の滴や縮合をスピンダウンします
OneStep-96 PCR阻害剤除去キットZYMOリサーチD6035eDNA抽出物中の汚染物質の精製および除去;
PCRプレートバイオ・ラッドHSP9601ハードシェル96ウェル
ピペット+滅菌ろ過先端ピペット:BIOHIT、フィルターのヒント:Biozym Safe シールのヒント プロ様々な手動または電子ピペットは、さまざまな最大容量で使用できます
プレートスピナー遠心分離機およびnbsp;NANAqPCR の前に気泡を除去します。
プロテイナーゼKアヴァントル VWRA4392.0010溶解時にDNAを放出するためにタンパク質を消化します
浄水ミリQNARNaseフリー水、陰性対照および洗浄液に使用されるnbsp;
反応チューブ(2 mL)エッペンドルフ30120094DNA溶解
リアルタイム定量PCRサーモサイクラーAnalytikjenaNAQTower 3Gプラットフォーム。DNAをリアルタイムで増幅・定量します
ロープボート、金物店、漁港NA強靭な素材(例:ポリエチレンや編み込みロープ)。船長は器の高さの少なくとも2倍にする
シーリングフィルム、接着剤、光学バイオ・ラッドMSB1001マイクロシール『B』。PCR前にPRCプレートを密封してください
自己保存型eDNAフィルタースミス・ルート 11579-251.2 & micro;毛孔の大きさ。サンプリングキャンペーンごとの量:必要に応じて
コンテナ研究所、薬局、Amazon様々な発泡スチロール断熱
生物学的配列アラインメントと解析のためのソフトウェアプロフィール編集バージョン7Windows 95/98/NT向けのユーザーフレンドリーな生物学的配列アラインメントエディタおよび解析プログラム
スクイーズボトル研究所、薬局様々な家庭用漂白剤で満たされている(1:10)
統計解析ソフトウェアRスタジオチーム。(2023)バージョン 4.2.1
滅菌されたDNAフリー手袋Sempercare 版79712実験室のすべての工程。nbsp;
TESバッファDNeasy解析バッファーに相当するカスタム製品
有害廃棄物容器有害廃棄物の安全な処分。すべてのステップ
UVランプ ステリルエアqPCR製剤のためのフード滅菌
ボルテックスジーニー2ボルテックスミキサー サーモフィッシャー・サイエンティフィック50728002試薬を均質化し混合します。DNA溶解、抽出
廃棄物容器住宅店小型の硬い容器
ウォーターポンプ(蠕動運動/真空ポンプ)アイケルカンプ;ソリンスト/スミス・ルート 12.34.SB;410/12099ポータブルポンプ
防水マーカー様々な

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