マウスデフォルトモードネットワークの縦方向多モーダル電気生理学記録を可能にする大型再封閉可能な頭蓋窓の手術プロトコル

サマリー

このプロトコルは、マウスに大きくて再封閉可能で硬膜を温存する頭蓋窓を作るための二段階の外科的手法を説明しています。この技術により、デフォルトモードネットワークのような分散型深部脳ネットワークから数週間にわたる慢性的かつ多モーダルな電気生理学的記録が可能になります。

要約

デフォルトモードネットワーク(DMN)は、認知機能や大うつ病障害(MDD)などの神経精神疾患に関与する、中央的かつ大規模な脳ネットワークです。動物モデルにおけるDMNの複雑な動態を研究することは、健康状態と病理状態の両方におけるその機能について貴重な洞察を提供します。しかし、覚醒時のDMNの複数の深部かつ分布したノードから安定した長期大規模電気生理学的記録を行うことは、依然として大きな課題です。

ここでは、マウスに4mm×7.6mmの大きな、耐久性があり再封閉可能な頭蓋窓を作るための新しい2段階手術プロトコルを提示します。この手術は、長期的な脳の健康と記録の安定性にとって極めて重要な硬膜の完全性を保つために設計されています。

このウィンドウにより、表面レベルのマイクロコルティグラフィー(μECoG)と2つの高密度頭蓋内電極プローブを組み合わせることで、1,000以上の電極からの同時かつ繰り返しの縦断記録が可能となり、DMNへの前例のないアクセスが可能となります。この技術は、数週間にわたるネットワーク全体の電気生理ダイナミクスを多モーダル・多スケールで検証するための堅牢なプラットフォームを提供し、脳疾患の病態生理の根底にある神経可塑性変化の調査や新規治療薬の慢性的影響評価に新たな道を開きます。

概要

デフォルトモードネットワーク(DMN)は、人間の脳画像研究で初めて、外部から指示された注意を要^{するタスク中に}一貫して抑制される領域の集合体として特定されました。現在では、自己言及的思考、自伝的記憶、^{将来の出来事}の計画など、内的指向的な認知過程を支える基本的な大規模ネットワークと考えられています^2,3。ヒトにおいて、標準的なDMNは内側前頭前野(mPFC)、後帯状皮質(PCC)、下頭頂葉(IPL)、海馬形成4を含む解剖学的に連結されたコア領域の集合から成^ります。このネットワーク内の機能障害は、いくつかの神経精神疾患の重要な特徴です。大うつ病性障害(MDD)では、DMNはしばしば多動性や機能的連結性の変化を示し、反芻や否定的な自己イメージなどのMDDの核心症状の根底にあると考えられています^5,6。

DMN機能障害を引き起こす細胞および回路のメカニズムを研究するためには、堅牢な動物モデルが不可欠です。齧歯類において、mPFC、帯状皮質、後脾後皮質(RSP)などの類似脳領域からなる相同DMNが確実に同定されており、これによりマウスが機構的調査における翻訳的に関連性の高いモデルであることが検証されました(^7,8)。さらに、うつ病の重要な要因である慢性ストレスは、人間のMDD^患者で観察されたものと同様の方法で齧歯類のDMN結合性を変化させることが示されています9。

疾患状態や慢性的な治療介入に反応して起こる神経可塑性の変化を理解するには、神経活動の縦断的観察が必要です。なぜなら、単一の記録セッションでは神経回路の動的な適応を時間をかけて捉えられないからです。¹⁰。生体内電気生理学は、局所電界電位(LFP)における神経振動や同期を研究するために必要なミリ秒スケールの時間分解能を提供します。LFPは、ネットワーク通信の基本基質である局所神経集団の同期されたシナプス活動を反映した細胞外信号を合計して示します^11,12。しかし、覚醒マウスでの慢性的かつ大規模な電気生理記録は技術的に依然として困難です。従来の慢性頭蓋窓は覚醒マウスの光学イメージング用に開発され、標準的な準備として使われています。典型的な単球のフットプリントと透明なガラスカバースリップが意図された読み取り^{に最適です。}しかし、これらは覚醒時の多サイト電気生理学向けに設計されておらず、作業領域と光インターフェースのため、DMN¹⁴のようなネットワークの分散型両側ノードからの同時高密度記録は困難です。慢性的な電極インプラントは縦断記録を可能にしますが、恒久的に位置したシャンク周辺に進行性の異物カプセル化やグリア瘢痕を引き起こし、時間とともに信号品質を低下させます^15,16。

ここで説明する二段階の手術は、これらの制限に直接対応しています。この装置は、受動的ポリジメチルシロキサン(PDMS)膜、シリコーンシーラント、3Dプリントキャップによって閉鎖された大きな再封閉可能な頭蓋窓を生成し、メソスケールLFP記録のためのμECoGグリッドの非終端重複挿入を可能にし、マイクロスケールの層流分解単一ユニットおよびLFP活性用に複数の高密度頭蓋内電極プローブを組み合わせて使用可能です^17,18.従来の慢性的アプローチでは、長期的に電極を固定してグリアカプレーションを蓄積したり、末期急性開頭術が必要で縦方向の設計を避けたりするのに対し、ここで述べたウィンドウは硬膜を完全な状態に保ち、異物との永久接触を回避します 15,16,18.さらに、頭蓋窓を3回(術後0日目、21日目、22日目)再開けし電気生理学的記録を行った検証コホートでは、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)およびイオン化カルシウム結合アダプター分子1(IBA1)の定量免疫反応性は非手術対照群と有意な差がなく、ここで用いる反復開口スケジュールの下でアストログリオシスおよびマイクログリオシスが低いことを示唆しました。この手法は特に、DMNを含む分散した皮質ネットワークの縦方向多部位記録と、覚醒した頭部固定マウスの深部構造への層状高密度頭蓋内電極プローブアクセスに適しています。主な運用上の制約は、硬膜を保存する骨皮弁除去に信頼性のある顕微外科的専門知識が必要であることと、高密度頭蓋内電極プローブが頭部固定を必要とするため、自由に動く録音との互換性がないことです。

プロトコル

すべての動物実験はフィンランドの国家動物実験委員会(ライセンス番号:ESACI/40845/2022)によって承認されており、実験は欧州議会の科学目的の動物利用保護に関する指令2010/63/EUおよび実験動物のケア・利用に関する国内ガイドラインに従って実施されました。

注:すべての手術は、紫外線照射(最低15分間)または徹底的なエタノール表面除染によって事前滅菌された層流型手術フード内で行われます。イソフルラン廃ガスはボンネット内に設置された活性炭スカベンジングシステムによって回収されます。オペレーターは使い捨てのヘアカバー、外科用マスク、長袖の実験用コート、そしてボンネットに入る前に80%エタノールをスプレーした単層非滅菌ニトリル検査手袋を着用します。フード内には鋭利な処分容器が設置され、メス刃や注射針を即座に処分できます。

1. 術前準備と麻酔

1. C57BL/6JRjのマウスを使い、少なくとも10週間経っていて、体重は20g以上です。
2. 手術前に、すべての器具を温かい超音波浴で洗浄してください。すすいで、乾かし、最低15分間70%エタノールに浸します。
3. あるいは、使用直前にガラスビーズや赤外線滅菌器を短時間通して滅菌する方法もあります。無菌のカーテンは使用されません。同じセッション内の連続した動物間で、器具をエタノール浸水に戻して少なくとも2分¹⁹秒浸けます。
4. 各マウスを校正済みスケールで個別に体重測定し、術前薬の量を計算します。
5. 無菌PDMS膜は事前に準備してください(急性手術日以外にバッチごとに1回実施)。
   1. 製造者の指示に従って10:1のエラストマーと硬化剤の混合物から、未硬化混合物を2枚の平らなホウケイ酸ガラス板の間に挟んで約500μmの目標厚さに鋳造した無菌PDMS膜を鋳造し、その後60°Cで少なくとも2時間硬化させます。
   2. 硬化したシートをオートクレーブパウチに密封し、蒸気のオートクレーブで滅菌します。消毒済みの手術用フードで、滅菌用の#11メスと小さなステンレス製定規を使って、各シートを頭蓋窓の寸法に合わせて長方形の膜状に切り分けます。
   3. 事前に切断された膜は、使用まで滅菌された実験器具(例:6ウェル細胞培養プレートの個別ウェル)に保管してください。
6. 各録音セッションの前にハードウェアの品質管理を実施してください。
   注:μECoGアレイでは定期的なインピーダンスチェックは行われません。生のトレースでは参照線の故障が容易に確認され、ハードウェアの問題が疑われた場合にのみインピーダンステストが行われます。高密度頭蓋内電極プローブには、録音ソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェースを通じてアクセス可能な内蔵インピーダンスおよびケーブル完全性診断機能が含まれています。信号品質が明らかに損なわれている場合にこれらの動作を実行してください。

2. フェーズ1:動物製備とヘッドプレートの埋め込み

1. 動物の調理
   1. イソフルランで麻酔します(誘導量:4%、維持量:1.5−2.5%、酸素流量0.5 L/min)。麻酔の深さをつまみ反射の喪失で確認してください。
   2. 頭頂部から目から首まで毛を剃ります。
   3. 体内温度センサーを備えたフィードバック制御式の加熱パッドに動物を置き、処置中は体温を37°Cに保つよう調整されます。角膜乾燥を防ぐために炭酸の眼軟膏を塗布してください。
   4. 破れないイヤーバーでマウスを立体定位フレームに固定します。切歯バーを調整して頭蓋骨が平らになり、ブレグマとラムダが背腹側の高さ(頭蓋骨の平面向き)に位置します。鼻錐から酸素流量0.5 L/minで注入したイソフルラン(1.5〜2.5%)で麻酔を維持します。
   5. 術前鎮痛剤および抗炎症薬は皮下注射(S.C.)で投与します:カルプロフェン(5 mg/kg)、ブプレノルフィン(0.05 mg/kg)、デキサメタゾン(2 mg/kg)。
   6. 剃った部分をポビドンヨウ素溶液で消毒してください。
   7. リドカイン・エピネフリン溶液(S.C.)を頭皮の下に局所麻酔として注入します。
2. 頭蓋骨露出
   1. 耳のラインに小さな横切開(約1cm)を開けます。
   2. 切開部を耳の周囲と頭部の両側に沿って目に向かって側面に伸ばし、切開部を徐々に拡大しますが、切開の範囲を目まで超えすぎないようにしてください。露光を締めくくるのは、両側に斜めに切って中央線に向かって、背中の頭蓋骨全体を露出させます。
3. 頭蓋骨の清掃
   1. 露出した頭蓋骨を実験室用のアセトンで丁寧に洗浄します。滅菌綿棒をアセトンに浸し、余分な溶剤を取り除き(隣接組織への滴りを防ぎ)、骨に塗布してすべての見える骨膜を取り除きます。
   2. アセトンは、骨表面の脂肪残留物や持続的な膜質の残留物を溶かす能力を重視して使うのであって、消毒剤としては使いません。
      注:骨膜および骨表面の脂質残留物を完全に除去することは、ヘッドプレートと歯科セメントの強い接着のために非常に重要です。インプラントは覚醒したマウスによる機械的応力に耐えなければならないため、骨接着界面に残留する骨膜や脂質膜が主要な破損点となります。
   3. 鈍い顕微外科用(円形)メス刃を使って、アセトン洗浄で完全に溶けなかった残留骨膜や結合組織の断片を取り除きます。骨面に対して約45°の角度で持ち、ブレグマと正中線の接合部から露出した骨の外側の縁に向かって軽く放射状に頭蓋骨をこすりつけます。
   4. 露出した骨全体を少なくとも一度は通し、均一に清潔でマットな状態になるまで続けます。
   5. 最後に、綿先端のアプリケーターにアセトンを塗って簡単な洗浄を行います。
4. 開頭切開部位のマーキング
   1. デジタル定位腕に生体適合性のある外科用皮膚マーカーを取り付けます。
   2. ブレグマに対して頭蓋骨に4 mm×7.6 mmの長方形の面積をマークします。
      1. マーカーの先端をブレグマに移動させ、デジタル表示のX座標とY座標をゼロにリセットします。
      2. アームを計画された窓の四隅それぞれに移動させ、長方形が両側のブレグマから横に2mm、前方に3mm、後方に4.6mm伸びるようにし、各角に1点ずつ配置します。
5. 右半球の頭蓋内プローブ挿入部位を2箇所マークしてください。
   1. 頭縁プローブの位置をブレグマから1.66 mm A/P、1.95 mm M/Lにマークしてください。
   2. 尾部プローブ部位をブレグマから-2.2 mm A/P、1.9 mm M/Lにマークしてください。
      注:これらのサイトはDMN特異領域を対象としています。このプロトコルにより挿入部位は複数の異なる領域に調整可能です。
   3. 立体定位アームからマーカーを外してください。
   4. 滅菌された柔軟な直線の縁(例:薄いプラスチックカード)を頭蓋骨に当て、4つの角の点をマーカーでつなげて、将来の頭蓋窓を連続した長方形として輪郭を描きます。
6. 接着力を高めるために表面積を増やす
   1. 双眼顕微鏡の下でセクション4まで以下のすべての手順を進めてください。
   2. 指定された窓域外のすべての露出した骨面に#11手術用ブレードを使って交差模様を彫り、浅くも0.2〜0.4mmの深さの溝を作って、約1mm×1mmの正方形の均一なグリッドを形成します。
      注意:これにより、上層接着剤やデンタルセメントの有効表面積が増加し、それに伴い機械的なグリップ力が向上します。
   3. 細かい接着剤アプリケーターは、滅菌された30Gの針を長い首の綿棒の先に当て、針をV字型に曲げて作りましょう。
   4. シアノアクリレート接着剤を使い捨てのプラスチック製の計量ボートに注ぎ、塗布器を接着剤の貯水槽に浸します。
   5. 露出した骨や彫刻されたすべての表面にデポジットグルーを塗り、1箇所あたり1回程度のデポジットを塗布し、徹底的にカバーしつつ過剰に塗りません。接着剤を7分間乾かします。
7. 参照ソケットの埋め込み
   1. 左小脳の上に、浅い血管が目立たない位置にドリル部位を選びます。
   2. 歯科用ドリルを立体定位アームのドリルホルダーに取り付けます。
   3. パイロット穴を5〜10秒ごとに、丸鋼バーを20,000〜25,000 RPMで開け、バーストの合間にビットを引っ込めて双眼鏡で現場を観察します。
   4. 穴がより透き通るようになり、薄いピンク色の色合いが現れ、薄くなった骨を通して硬膜が見えるまでドリルを開けます。
   5. この時点ですぐに掘削をやめて、硬膜の侵入を防ぎましょう。完成穴のサイズは約0.5mmにし、基準ソケットの外径よりわずかに大きい程度にします。
   6. 金メッキのリファレンスソケットをパイロットホールに差し込み、シアノアクリレート接着剤で固定し、UV硬化可能なデンタルセメントで接合部を補強します。デンタルセメントを405nmの発光ダイオード(LED)硬化ペンライトで1分間硬化させます。
8. ヘッドプレートの埋め込み
   1. 露出した前部骨の先端(鼻に最も近い部分)に少量のUV硬化可能なデンタルセメントを置き、レベリングサポートとして使います。
   2. ヘッドプレートを頭蓋骨の上に置き、一方の端が基準ソケットの周囲に硬化した歯科用セメントの足場の上に置かれるようにします(ステップ2.7.6)、反対側の端は新しいロストラルセメントのダブの上に乗せます。
   3. ヘッドプレートの長軸が矢状面の正中線を中心に位置し、2つの固定ハンドルが正中軸に対して垂直(90°)に伸びるように整列します。UVライトの下でコンポジットを硬化させてヘッドプレートを固定します。
   4. ヘッドプレートの基部の周囲に約1mm厚のUV硬化可能な歯科用セメント層を連続して塗布し、彫刻骨と基準ソケットを囲み、将来の頭蓋窓の周囲に連続した密閉された囲いを作ります。
   5. 各層を405nmのLED硬化ペンで個別に40秒、作業距離1〜2cmで修復し、次の層を塗布する前に完全な重合を確実にします。仕上げられたセメント壁がヘッドプレートの上面とほぼ平らに伸び、露出した骨の周囲を完全に囲い、マークされた窓の部分で重ならないことを確認してください。
9. マウスが麻酔から回復するまで待ってください。ネズミは少なくとも48時間は元のケージに戻してください。
10. セクション3に進む前に、動物が術前体重の5%以内に回復し、マウスのしかめ面スケール²⁰で痛みの兆候がないことを確認します。これらの条件のいずれかが満たされない場合は、回復期間を延長して満たしてください。
    注:この段階的な設計と術間回復間隔は非常に重要です。これにより、開頭手術前の初期の生理的ストレスや炎症から動物が回復し、手術の成功率やインプラントの長期的な健康向上が確認されています。ここでは最低48時間が用いられ、頭部プレート固定と開頭術の間に数日間の回復間隔を設ける段階的な頭蓋インプラントは、周術期の炎症を軽減し、長期的な準備品質を向上させることが示されています。¹⁴。

3. 第2段階:慢性的な頭蓋窓の作成

1. 術前準備
   1. 第1節に記載された手術部位と器具を準備してください。
   2. イソフルランで再麻酔(誘導4%、維持1.5〜2.5%)を投与します
   3. ステップ2.1.4で説明した通り、マウスを立体視系に位置させます。
   4. 術前薬はステップ2.1で記載されたのと同じ用量で投与してください。ただし、リドカイン・エピネフリンの局所麻酔薬は除きます(頭皮の皮膚はフェーズAで既に除去されているため、現在は適用できません)。
2. 窓に穴を開ける
   1. フェーズ1(ステップ2.4)に示された長方形の輪郭に沿って歯科用ドリルで骨を薄くし始めます。25,000回転で、ドリル装置を骨面に対して直角(≈90°)に持ち、長方形の縁に沿って1〜2回やや深く切って初期の切断溝を形成します。
      注意:開始ドリルの速度はオペレーターの経験レベルに合わせて調整される場合があります。
   2. ステップ2.5で示された2つのプローブ挿入座標の頭蓋窓に、骨と歯科セメントに約0.2〜0.3mmの深さのドリル溝を開けます。
      注:これらの溝は骨弁除去後も目に見える持続的な視覚的ランドマークとして機能し、その後の電気生理学的セッションで頭蓋内プローブの再配置に使われます。
   3. 鑽削中は氷のように冷たい無菌人工脳脊髄液(ACSF;Goldeyらのセファゾリン含有レシピに従って調製)を定期的に使用し、基底皮質への熱損傷を防ぎ出血を最小限に抑え^ます。
   4. 骨が薄くなるにつれてドリルの速度を徐々に20,000 RPMに落とし、ハンドピースを≈ 45°に傾けて、操作者がドリルを手にしっかりと固定し、より穏やかでコントロールされたストロークへと移行できるようにします。
3. 骨弁の除去(重要なステップ)
   1. 長方形の周囲に沿って穴を開け続け、輪郭内の骨が約90%薄くなるまで続けます。頭蓋骨を完全に貫通しないでください。
   2. 残りの骨厚を2つの補完的なチェックで確認します:
      1. 双眼顕微鏡の下で、鈍い器具で薄くなった骨棚の縁を優しく叩きます。軽い叩きによるたわみの大きさは、残留骨厚を直接的に示します。
      2. 氷のように冷たいACSFを開孔窓に当て、すぐに双眼鏡で観察します。ACSFが骨に浸透するまでの最初の20〜30秒間、流体層は視覚的なコントラストを鋭く強調し、骨が硬膜に近い薄くなった部分の皮質毛細血管を解消しますが、残存厚みのある領域は液体の下で比較的不透明なままです。フラップが均一に半透明で柔軟性が示されたら、ステップ3.3.3に進みます。
   3. 細かい曲線のデュラフックに切り替え、先端が90度曲がったものにします。骨の表面に対して約15°の角度で細かく骨の縁の下に慎重に先端を差し込み、フックを窓の周囲に沿って滑らせながら、骨フラップを周囲の頭蓋骨やその下の組織から慎重に外します。
   4. 両側の側面に沿って一角からもう一角へと徐々に進み、最後に角から長方形の中心に向かって進み、周囲全体が下の硬膜から切り離されるまで進みます。
   5. スライド中に硬膜フックに下向きの圧力をかけず、脳に触れないようにしてください。
      注意:浅いフック角度で斜めに反対方向の角を交互に配置することで、骨フラップの周囲に機械的応力が均等に分散されます。この戦略は硬膜断裂を防ぎ、基礎となる脳組織の長期的な健康を守ります。
   6. フックがどの角で焦点抵抗に遭遇しても無理に動かさないでください。代わりにフラップを下げてステップ3.4に戻り、接着部をさらに薄くします。
      1. 硬膜裂傷が発生した場合は、その動物の処置を中止してください(突然の局所膨隆、ピンク色がかった液体の浸出、またはヘッドプレート腔を氷のように冷たいACSFを3回注いでも収まらない鮮やかな赤色動脈出血で認識され、各洗浄を30秒間放置します)。
         注:成功した剥離は、骨弁が周囲全体に沿って均一に可動的になり、硬膜の膨隆がなく、軽度の毛細血管出血のみであることを示します。
   7. 硬膜フックで切断に成功した骨弁を後方から前方方向に慎重に持ち上げ、頭蓋骨表面から約35°上へ移動させます。
   8. 持ち上げられた縁を鉗子で掴み、プレートが完全に外れるまで左右に優しく揺らします。もしプレートがどの角でも抵抗する場合は、元の位置に戻し、ステップ3.3.4に戻って接着部分を薄くしてから再度除去を試みます。このような抵抗は、局所的に骨が薄くなっていることを示しています。
   9. 氷のように冷たいACSFを繰り返し洗浄して、露出した凝固した血液を優しく除去します。
   10. 進める前に硬膜が無傷で透明であることを確認してください。
       注意:後端からのゆっくりとしたリフトは、基礎となる上矢状静脈洞および横静脈洞および皮質表面への損傷リスクを最小限に抑えるために不可欠です。
4. 頭蓋の窓を封印する
   1. 出血が収まったら、無菌のプレキャストPDMS膜(セクション1で準備済み)を直接硬膜表面に置きます。適切なサイズで調整すれば、窓を正確に覆い、硬膜に受動的に付着して脳にぴったりと固定します。
   2. 窓の周囲から残留するACSFを非繊維性のワイプで吸収します。
      注意:ワイプは露出した硬膜に絶対に触れてはならず、窓は繰り返し開けられ、この段階で汚染が入ると後続の縦断記録に影響が出るため、常に厳格な無菌技術(無菌操作、工具、現場)を維持する必要があります。
   3. 製造元の指示に従って二成分シリコーンエラストマーシーラントを準備し、ディスペンションから30秒以内に混合エラストマーを塗布し、デンタルセメントのエンクロージャーとヘッドプレート内縁の間の隙間をすべて埋め、PDMS膜の縁を完全に囲み重ねます。
   4. エラストマーを約2分間(またはメーカーが指定した時間)硬化させます。硬化シールが連続的で液体密閉性でありながら、各録音セッション開始時に機械的に取り外し可能な状態であることを確認しましょう。
   5. 録音の合間に窓を保護するために、ヘッドプレートに少量のシアノアクリレート接着剤を塗ったカスタム3Dプリントの保護キャップを取り付けます。
   6. 麻酔から回復するまで待ってから、インプラントへの損傷を防ぐために、マウスを元のケージに戻して個別のハジングに入れてください。

4. 術後のケアと習慣化

1. 手術後少なくとも2日間はマウスの健康状態を注意深く観察してください。マウスのしかめ面²⁰に基づく痛みの兆候が見られた場合は、手術後2日間追加の鎮痛剤(S.c.)を投与してください。
2. 手術後最低4日間はネズミを妨害せずに回復させてください。その後、5日間の慣れ期間を開始します。1日目は5分、続いて2日目、3日目、4日目、5日目はそれぞれ15分、30分、4日目、60分ずつで、マウスの取り扱いと頭部固定記録プラットフォームに慣れさせます。
   注:開頭術後の組織浮腫や局所炎症は、最大^{2週間持続}することが知られています。実験的なスケジュールが許す限り、最初の録音セッションまでの回復期間を延長することが望ましいです。最初の記録セッションの前に、双眼顕微鏡で頭蓋の窓が透明で不透明や線維組織がないこと、そして動物の体重や行動が正常であることを確認しましょう。

5. 縦方向電気生理記録の手順

1. 動物を録音台に置く
   1. マウスを録音プラットフォームに置き、マウスヘッドの固定クランプを誘導します。頭部固定時の動物の自然な立ち姿勢を保つために、身長が事前に調整されていることを確認してください。
      注意:マウスが持続的に頭部固定に抵抗する場合は、無理に操作を強制しないでください。動物を元のケージに戻し、慣れ期(セクション4)をさらに1〜2回延長してから再び固定を試みます。
   2. クランプのロックネジを締めてください。
   3. 使用直前に鈍い顕微外科用円形刃を80%エタノールに浸してください。
   4. ブレードを3Dプリントされたキャップとヘッドプレートの上部の間に差し込み、ブレードはほぼヘッドプレート表面と平行に保ちます。脳に接触するリスクを避けるため、刃はヘッドプレートの開口部の内縁を超えて動かさないでください。
      注意:キャップは意図的に透明樹脂で印刷されており、刃の深さが全体的に見えるようにしています。
   5. キャップの周りを左右に優しく揺らしながら、接着層を少しずつ割っていきます。
   6. 細かい解離鉗子を使ってキャップを持ち上げ、完全に解放されたら捨てます。
   7. シリコンエラストマーシールの外縁を掴み、尾側からゆっくりと前端側に向かって持ち上げます。エラストマーシールとその下のPDMS膜は一体化して剥離し、無傷の硬膜が露出します。
   8. ACSFを数滴塗って脳を潤してください。
2. 録音機器の配置
   1. μECoGアレイを磁気ベース付きの関節アームに取り付けます。操作者の経験に基づいてアームの摩擦ダイヤルを調整し、経験豊富な操作者は位置調整中の細かい運動制御を保つ低摩擦設定を好みます。
   2. アレイを誘導し、その電極面が頭蓋窓の右端に沿って皮質表面に対して垂直(90°)に着地するように導きます。満足のいく位置に取り付けたら、摩擦ダイヤルを締めてアームを固定します。
   3. 尖ったシリコン製の先端工具を使って、アレイの平らなリボンケーブルをヘッドプレートの上面に優しく叩きつけ、ケーブルがヘッドプレートとぴったり合い、アレイ自体が硬膜にぴったりと収まります。残留ACSFが受動的な接着を提供します。頭蓋窓は2つのサブグリッドアレイを単一の方向で収容できるように寸法が設計されているため、粗い整列を容易に検出できます。
   4. シリコーンツールで最後に細かい調整を行い、矢状面の中央線が半透明アレイの中心に明確になるまでアレイを横方向に押し上げます。
      注:半透明のμECoGグリッドは矢状洞を明確な解剖学的アライメント手がかりとして露出し、アレイを通じて可視化し、同じ側方のずれを縦方向のセッションで再現できるようにします。このアレイは、前縁半分の前帯状皮質(ACC)と尾半分の両側の後脾皮質(RSP)を覆う配置で、本研究で対象としたDMNリンパ節をまたぐ。オープンソースの解析パッケージ(ephy_spatial_fidelity-toolkit、https://github.com/RazBalin/ephy_spatial_fidelity-toolkit で入手可能)は、保守的な録音からセッション間のグリッド配置ドリフトを定量化しています。
   5. μECoGの基準線をステップ2.7で埋め込まれた金メッキ基準ソケットに接続します。
      注意:事前の品質管理チェックとして、プローブとアレイを50mLのACSF円錐管に浸した状態で簡単な記録を取得し、ファラデーケージが環境電磁干渉を効果的に減衰させていることを確認してから生 体内 記録を進めてください。
   6. 尾側の高密度頭蓋内電極プローブを、脳表面に対して垂直(≈90°)に配するマイクロマニピュレーターアームに、頭側の高密度頭蓋内電極プローブを50°傾けた別の腕に置きます。
   7. 双眼顕微鏡の下で、各プローブを硬膜の約1mm上方まで進め、各プローブのY軸をステップ3.2.4で加工した対応する彫刻ガイド溝と合わせます。
   8. 双眼鏡でメモまたは写真で記録し、μECoG電極グリッドが各プローブの計画された入り口のすぐ隣に位置しています。
      注:手術が適切に行われ、皮質浮腫がない場合、骨縁とμECoG配列間の間隔は最小となり、入口選択が明確になります。縦方向のセッションで最大の空間精度を得るために、アレイが設置された露出した皮質の写真を撮影し、骨縁とμECoGアレイの間の狭い領域内で特徴的なピアル血管を特定します。この画像は参照容器とμECoGパッドとの相対位置を注釈付きで示し、同じ入力点を次の記録日に再現するためのセッション間参照マップとして機能します。
   9. 硬膜穿刺中に脆弱な電極シャンクを保護するため、プローブとパッドの対応が記録されたら各プローブを約15mm上方に引っ込めます。
   10. 無菌の30G注射針を綿先端のアプリケーターの先端に固定し、歯のない細かい鉗子で針先を90度に曲げてデュラル穿刺ツールを製作します。
   11. パンクツールをゆっくりとヘッドプレートの上に向けて動かします。双眼鏡で見て、μECoG電極パッドを数えて、ツールを記録された入り座標に合わせます。曲げた先端を硬膜面に下げ、切断先端が硬膜に90度近づくようにし、工具の軸はネズミの背中の長軸に平行に保ちます。
   12. 先端を硬膜面から約1mm下に進めて引っ込めます。穿刺部での軽度の一時的な出血が予想されます。繊維のないワイプのねじれた角で拭き取ります。
   13. 穿刺直後、高密度の頭蓋内電極プローブを連続的な両眼観察のもと、硬膜表面に下げます。穴が正確に刺されていれば、プローブはシャンクのたわみなく滑らかに穿孔を通過します。
   14. 各プローブは約0.1mm/s(遅い^22mm)で徐々に目標深度の硬膜下5mmまで降りていきます。
   15. プローブを機械的に10分間静置させてからデータ取得を開始します。
       注:30Gの針によって形成される小さな硬膜穿孔は数分以内に自動的に閉じます。したがって、プローブの挿入は穿刺後に遅れずに行わなければなりません。
3. データ取得
   1. データ収集を開始しろ。
      注:μECoG信号は4つの128チャンネルデジタルヘッドステージで増幅され、SPIインターフェースケーブルを介してオープンソースの取得ボードに接続されています。一方、2つの高密度頭蓋内電極プローブは、同期およびデジタル信号用の多機能入出力およびデータ取得モジュールと並んでモジュール内にある専用の高密度プローブ取得モジュールで取得されます。共通のTTLマスタークロックは、オープンソースのμECoG取得ボードによって生成され、ハードウェア同期ラインとしてプローブ取得シャーシ(多機能I/Oモジュールを介して)に配布され、2つの取得ストリームがサンプルアラインメントされたタイムベースを共有します。すべてのデータストリームは、取得システムのグラフィカルユーザーインターフェースを通じて同期的に記録されます。完全なハードウェアモデルとカタログ番号は 材料表に記載されています。
   2. 記録セッション終了時に、μECoGグリッドに0.5mLのACSFを投与し、挿入時と同じ速度(≈6 mm/min)で各高密度頭蓋内電極プローブを引き戻し、μECoGアレイを優しく取り外します。
   3. プローブとアレイを、新しく準備した1%(w/v)酵素洗剤溶液に45分間浸して洗浄します。
   4. 酵素洗剤浸水後、逆浸透圧精製水に3回連続浸して電極をすすぐ。各リンスごとに新しいチューブを使い、
   5. PDMSの膜をステップ3.4.1の新しい滅菌シートに交換してください。
   6. エラストマーシーラントを再塗布(ステップ3.4.3–3.4.4)し、新しい3Dプリント保護キャップを取り付けます(ステップ3.4.5)。
   7. 再密封した組みを5分間自然乾燥させてから、ネズミを元のケージに戻します。この手順は数週間にわたる複数回の録音セッションで繰り返されることもあります。

結果

手術が成功すれば、皮質の上に透明で透明な窓ができ、血管が目に見え、炎症や感染の兆候は最小限に抑えられます。この透明度は21日以上維持可能で(図1)、長期的な縦断的研究が可能です。インプラントの頑牢性は、21日間の慢性コルチコステロン投与パラダイムでも安定を保つ能力によって示されており、これは齧歯類にうつ様状態を引き起こす一般的なモデルです10,23,24。これにより、慢性疾患モデリングにおけるこの手法の適性が確認されました。

慢性ウィンドウを通じて記録された生の電気生理学的信号は、縦断的なタイムラインを通じて高い品質を保っています。後部後脾格子から採取した代表的な広帯域μECoGトレースと、表層皮質チャネルから採取された同時期の頭蓋内プローブ局所電位トレースが、図

ディスカッション

本報告書は、マウスに大きく慢性的かつ再封閉可能な頭蓋窓を作る信頼性が高く非常に効果的な方法を提供する、2段階の硬膜温存手術プロトコルを詳述しています。この技法の意義は窓の大きさにとどまりません。主な利点は、長期的な時間スケールにわたる大規模な脳ネットワークを同時かつ多スケールで調査できることです。表面μECoGグリッド(メソスケールLFPデータ提供)と深部高密度頭蓋内電極プローブ(マイクロスケール、層流分解単一ユニットおよびLFPデータ提供)を組み合わせることで、研究者は深部DMNノード内の特定の回路活動が、皮質上で観測されるネットワークレベルの動態にどのように寄与するかを直接調査できます。さらに、この方法はマウスの脳の大部分へのアクセスを提供するため、大規模なネットワークにも適しています。

このプロトコルの成功には、2つの側面が根本的なものです。まず、手術を2つのフェーズに分け、それぞれ48時間の回復期間を設けるという設計上の重要な選択です。この戦略は動物への蓄積的な生理的ストレスを最小限に抑え、急性炎症反応を軽...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
µECoG array & mdash;512チャンネルカスタム(2倍256チャンネル)	ニューロネクサス	E256-200-30-80	パッケージ:IH256。16&2回;16のサブグリッド(各3.3 mm×3.5 mm);200 & mu;mピッチ;80 & mu;m電極直径。表面的なDMN録音。
3軸左手用マイクロマニピュレーターアーム	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(WPI)	504926	10 & mu;m解像度;デジタルディスプレイ;手術中のヘッドプレート/プローブの位置調整に使用
3Dプリントされた保護キャップ	社内(Anycubic Photon Mono 4K)	該当なし	カスタムデザイン;Anycubic High Clear UV樹脂で印刷;STLファイルは https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap で入手可能です
アセトン(実験室グレード)	シグマ・オルドリッチ	179973	接着剤塗布前の頭蓋骨表面脱脂と骨膜除去
Adson デュラフック 5mm(ファインデュラフック)	gSource	gS 25.2570	骨板を硬膜から外すために使われ、細いタングステン線などで作られています
Anycubic ハイクリアUVレジン	エニキュビック	STMGCL-102B	Anycubic Photon Mono 4Kプリンターで3Dプリント保護キャップに使用されるフォトポリマー樹脂
Anycubic Photon Mono 4K 3Dレジンプリンター	エニキュビック	フォトンモノ4K	Anycubic High Clear樹脂から保護用窓キャップを印刷するために使用
Anycubic UVレジンウォッシュ&キュアマシン2.0	エニキュビック	285-550	3Dプリントキャップのプリント後洗浄とUV硬化
磁気ベースを備えた関節アーム(および時間;2)	ハース・ツール	09-0535	かつては保持し、記録中の皮質表面に配置されたECoGサブグリッド
人工CSF(aCSF)	社内準備	該当なし(社内)	aCSFレシピ:124 mM NaCl、3 mM KCl、26 mM NaHCO3、2 mM CaCl2、1 mM MgSO4、1.25 mM KH2PO4 10 mM D-グルコース;調製直後に95%のO2 / 5%のCO2で酸素を含みます。カタログ番号は別途記載されています。
鈍い顕微外科用ブレード(円形メス)	イオゲン	374769	頭蓋骨表面のスクレイピングやキャップの取り外しに使用
ブプレノルフィン(テムゲシック)	インディヴィア	BE-112515	オピオイド鎮痛剤;術前0.05 mg/kgをS.C.で投与
C57BL/6JRjマウス	ジャンヴィエ研究所		男性・女性問わず;最低10週齢、手術時体重>20g)
塩化カルシウム二水和物(CaCl2·2H<サブ>2人O)	シグマ・オルドリッチ	C-7902	2 mM;月数 147:02;0.29 g/L。Ca および 時間として調製;100株。社内aCSFの構成要素です。
カルプロフェン(リマジル)	ゾーティス動物保健	RXRIM-INJ	NSAID鎮痛剤;術前5 mg/kgをS.C.で
コルチコステロン	シグマ・オルドリッチ	C2505	21日間慢性ストレス/うつ病モデルの飲料水に溶解
綿棒	フィッシャーブランド	22-363-157	30G硬膜穿刺装置の取っ手や、頭蓋骨表面のアセトン除去用の取っ手として使われます
シアノアクリレート接着剤とmdash;ロックタイト401	ヘンケル接着剤	ロックタイト401	薄粘性シアノアクリレート;頭蓋骨表面プライマー、ヘッドプレートおよびキャップ固定に使用されます
歯科用ドリルとmdash;フォアダム K.1070	フォアダム	K.1070	フレキシブルシャフト回転ドリル;開頭術の薄化やパイロットホール掘削に使用
デキサメタゾン	ドファーマ	1DEX004	コルチコステロイド抗炎症薬;術前2 mg/kgの手術
D-グルコース	シグマ・オルドリッチ	G-7021	10 mM;MW 180.20;1.80 g/L。グルコースとして調製され、100株。社内aCSFの構成要素です。
ドリルビット スチールバー ラウンド1/007W	ヘイガー&マイジンガー	18089	参照部位および頭蓋窓に使用されました
エタノール80%(v/v) - A12tジルタス	ベルナー	13221132	手術器具および殺菌のための外科用ラミナーフードの術前浸漬
ガス排出装置	RWDライフサイエンス	R546W	スカベンジは手術部位から麻酔ガスを排出します
金メッキリファレンスソケット	DigiKey	310-13-102-41-001000	左小脳の上に埋め込まれた。ECoGの接地/基準として機能します
GRANT超音波クリーナー—モデル17002A	グラント・インストゥルメンツ	17002A	EAN:4064343191654。温水超音波浴;TICKOPUR TR 3と併用して計器洗浄に使用。
ヒートパッドとmdash;スーパーテックTMP-5B	スーパーテック	TMP-5B	体温を37度と維持します。麻酔中のC。
イソフルラン	ピラマル・ヘルスケア	66794-017-25	吸入麻酔薬;誘発分娩4%、メンテナンス1.5%とNDASH;2.5%
Kimtech Science、精密ワイプ(非線維組織)	キンバリー・クラーク	7552	尖った先端と併用して残留ACSFを乾燥させ、PDMS膜の硬膜接着を助ける
クイックキャスト無菌エラストマーシーラント	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(WPI)	KWIK-キャスト	モデル:KWIK-CAST-S。生体適合性シリコーン;PDMS膜の周囲に取り外し可能なシールを作成するために使用されます。
LED紫外線硬化筆 405nm	キュアUV	514424-405	植骨時にUV活性化歯科セメント(Total C-Ram)を硬化させるために使用しました
リドカイン-エピネフリン溶液	オリオン・ファーマ	05 10 31	局所麻酔;頭皮下のS.C.注射
硫酸マグネシウム(MgSO4およびmiddot;7H2O)	シグマ・オルドリッチ	M-7774	1 mM;MW 246.48;0.25 g/L。Mgおよび時間として調製;100株。社内aCSFの構成要素です。
金属製のヘッドプレートとmdash;ニューロターモデル13	ニューロタール	モデル13	チタン製ヘッドプレート;直径11mmの丸い開口部;頭蓋骨にシアノアクリレートとデンタルセメントで固定
NeuroNexus ヘッドステージアダプター )	ニューロネクサス	カスタムIH256 64時以上;4 モレックス	カスタムアダプターボード;サンドイッチはそれぞれとマイクロ;2台のインタンRHD 128チャンネルヘッドステージ間のECoGサブグリッド
Neuropixels 1.0プローブに金属キャップ(および時間;2)	IMEC	PRB_1_4_0480_1_C	960の録音サイト;10mmのシャンク。1つは海馬-視床-視覚柱を標的とし、もう1つはmPFC柱を標的とします
NI PXIe-1083 シャーシ	ナショナル・インストゥルメンツ	PXIe-1083	NeuropixelsモジュールとNI DAQカードを収容した9スロットPXI Expressシャーシ
NI PXIe-3839 多機能I/Oモジュール	ナショナル・インストゥルメンツ	PXIe-3839	NI PXIe-1083シャーシに搭載;同期および補助I/Oに使用されます
NI PXIe-6363 多機能DAQ	ナショナル・インストゥルメンツ	PXIe-6363	NI PXIe-1083シャーシに搭載;同期のためのアナログおよびデジタルI/O対応
ノヴァ・マイクロシネレーター - 赤外線滅菌器	アルゴス・テック	S3022	露出した脳組織に触れる可能性のある器具の迅速な滅菌に使用されます
オリンパスSZ51ステレオ双眼顕微鏡	オリンポス	SZ51	外科的可視化;開頭術および移植の全過程で使用されます
オープンEphys取得ボード(ワンボックス、第1世代)	オープン・エフィス	OEPS-9029	レシーブ&マイクロ;SPIを経由したECoGのデータストリーム;オープンソースハードウェア。参照 open-ephys.org
Ephys GUI を開く	オープン・エフィス	該当なし(オープンソース)	無料のオープンソース電気生理学取得ソフトウェア。入手可能:open-ephys.org
塩化カリウム(KCl)	シグマ・オルドリッチ	P-5405	3 mM;水曜日 74:55;0.22 g/L。社内aCSFの成分。
二水素リン酸カリウム(KH2PO4)	シグマ・オルドリッチ	P-5655	1.25 mM;MW 136.09;0.17 g/L。社内aCSF成分(Klebsおよび時間;ストック10)。
ポビドンヨウ素溶液(ベタジン)	武田	45 70 28	外科現場準備のための局所消毒剤
PXIe取得モジュール	ニューロピクセル	PXIE_1000	Neuropixels 1.0のデータ取得用PXIフォーマットモジュール;NI PXIe-1083シャーシに搭載
リファレンスソケットコネクタ	DigiKey	342-10-102-00-591000	上記の参照ソケットに対応する接続コネクタ;DigiKeyで部品番号を確認してください
RHD 128チャンネルヘッドステージ(および時間;4)	インタン・テクノロジーズ	RHD 128	1つのヘッドステージは1つにつき2つあります。ECoGサブグリッド;モデルを確認する(例:RHD2132またはRHD2164)
右手SPIインターフェースケーブル、0.9 m	インタン・テクノロジーズ / オープン・エフィス	C3203	右手ヘッドステージとオープンEphys取得ボックスを接続する標準SPIケーブル
後輪駆動エアポンプ	RWDライフサイエンス	R510-29	麻酔回路を通じて空気の流れを提供します
後輪駆動型動物麻酔用ヴェポライザー	RWDライフサイエンス	R5835	麻酔誘導および維持のための精密イソフルラン蒸気化器
メスブレード #11	スワン・モートン	SM0103	接着力を高めるために頭蓋骨表面に交差模様を彫刻するために使用されます
小動物用ヘアトリマー - GT416	アスキュラップ・シェルマシーネン GmbH	D-98528H	手術前に動物の頭皮をトリミングするために使われます
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)	シグマ・オルドリッチ	S-5761	26 mM;MW 84:01;2.18 g/L。社内aCSFの成分。
塩化ナトリウム(NaCl)	シグマ・オルドリッチ	S-5886	124 mM;山岳 58分44秒;7.25 g/L。社内aCSFの構成要素。
SOL-M(滅菌注射針 30 G)	ソル・ミレニアム・ヨーロッパ	113005	曲げ90度;先端に取り付けて綿棒に固定して硬膜穿刺装置を作ります
標準的なマニピュレーターアーム、左軸3軸(ストールティング)	ストールティング社	51604	録音セッション中のニューロピクセルプローブ挿入に使用されます
標準的なマニピュレーターアーム、3軸右(ストールティング)	ストールティング社	51606	録音セッション中のニューロピクセルプローブ挿入に使用されます
立体定位フレームとmdash;後輪駆動 F67001	RWDライフサイエンス	F67001	標準的な立体型フレーム;頭部安定化および座標参照インプラントの挿入に使用されます
定規付きサージカルマーカースキンペン(バイオレットインク)	ファニン	SM0372	生体適合性のあるゲンジアン・バイオレット系外科用皮膚マーカーは、計画された開頭切開および骨へのインプラントフットプリントを概説するために使用されました。シアノアクリレートプライミングに耐性があり(ロックタイト401)、頭蓋骨の脱脂やヘッドプレー固定でも視認可能で、立体定位座標を骨表面に確実に転送できます。
SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット(PDMS)	ダウ(ドイツ)	1673921	ポリジメチルシロキサン;薄く鋳造された(<1 mm)膜;脳を保護するために硬膜表面に置かれます
テルガザイム酵素洗剤	アルコノックス	1304-1	プロテアーゼ系クリーナーは、1%(w/v)でぬるま湯RO水に使用し、セッション後の電極洗浄(45分間浸かした後、浄化水で三度洗い流す)に使用します。
Total C-RAM Automix UVデンタルセメント(白)	イテナ	R301950	モデル:TTCRAM-BLC。UV硬化可能な歯科樹脂;ヘッドプレート補強およびソケット固定に使用されます
超音波洗浄液(TICKOPUR TR 3)	Dr. H. Stamm GmbH	TR-3-913	クエン酸系濃縮物;術後の器具洗浄のための超音波浴で使用
ビスコティアーズ アイジェル 2 mg/g	アルコン	503849	カルボマーベースの潤滑眼軟膏;麻酔中に角膜に塗布し、乾燥を防ぐ
ツァイス・コールドライトソース KL1500 LCD	カール・ツァイス	KL1500 LCD	外科分野向けの光ファイバー冷照明、熱損傷を防ぐ