Method Article

ホルマリン固定パラフィン埋め込みマウス胚組織における初期歯形形成の空間的トランスクリプトミクス

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

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現在のプロトコルでは、マウス胚のE13.5およびE15.5頭蓋顔面領域からホルマリン固定されパラフィン埋め込みされた切片を用いて、空間的トランスクリプトミクスを用いて遺伝子発現プロファイルの差異解析を行うことを説明しています。

Abstract

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発達中の歯は、多様な高度に専門化された細胞集団で構成されており、適切な形態と機能を維持するために協力しています。これらの細胞とその周囲の微小環境との相互作用を明らかにすることは、正常な歯の発達の基盤となる調節メカニズムを理解する上で極めて重要です。これらの過程の乱れは、歯の無形成、象牙質形成不全症、アメロゲネーシス不全症などの先天性疾患を引き起こすことがあります。単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)による細胞の異質性の明らかな進展は大きいものの、組織内の細胞の空間的文脈を保持できず、遺伝子発現と組織構造を関連付ける能力を制限しています。空間トランスクリプトミクス技術は、高解像度の遺伝子発現プロファイリングとネイティブ組織構造の保存を統合することで、この制約に取り組み、分子シグネチャーの 現地 定位を可能にします。ここでは、マウス胚性頭蓋顔組織の採取、固定、パラフィン埋め込みのためのステップバイステッププロトコルを説明し、下流の空間転写体応用に適しています。ワークフローは、高解像度空間解析のためにRNAの完全性と組織形態を保存するために、ホルマリン固定およびパラフィン埋め込み組織の最適な切片と取り扱いを詳細に行っています。この手法はシーケンシングおよび画像ベースの空間トランスクリプトミクスプラットフォームと互換性があり、マウス胚における初期歯の形態形成の再現可能な空間トランスクリプトミックプロファイリングを可能にします。このアプローチは、発達状態および病理状態における頭蓋顔面構造の空間的組織と機能的動態に関する強力な洞察を提供し、分子メカニズムと組織形態を結びつける重要な枠組みを提供します。

Introduction

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歯の発生は、初期胚成長中の高度に協調した形態形成過程の序列1,2,3,4に依存しています。遺伝学的および発生的研究を通じて多くの主要な遺伝子やシグナル伝達経路が特定されていますが、これらの因子が個々の頭蓋顔面構造をどのように形成するかについては、まだ限られた理解が残っています。特筆すべきは、特定の遺伝的変異を症候群性および非症候群性歯疾患と結びつける上で大きな進展があったにもかかわらず、構造特異的形態形成の詳細な分子メカニズムはまだ完全には解明されていません(1,2,3,4)。この知識のギャップは、歯の無形成症やその他の歯の異常に対する標的治療戦略の進展を引き続き制限しています。

単細胞mRNAシーケンシング(scRNA-seq)により、健康な組織と病変組織の両方でこれまで認識されていなかった細胞型の発....

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Protocol

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すべての動物処置は、国立衛生研究所(NIH)国立児童健康・人間発達研究所動物ケア・利用委員会(ACUC)の動物研究プロトコル#21-031のもとで承認されています。

1. 実験動物の準備および組織の採取

  1. 健康で繁殖可能なオスとメスの Mus musculus をペアで、タイミングよく交尾させましょう。妊娠中のメスのマウスは、胚発生日(E)0.5とされる膣栓の存在で識別します。
  2. 妊娠中のメスマウスはCO₂吸入後、子宮頸部脱臼で安楽死させます。動物の仰向けを無菌の吸収手術面に置き、腹部を70%エタノールで切開部に沿って消毒します。
  3. 無菌の外科用ハサミで腹部の中央切開を行い、顕微外科的ハサミで腹膜壁を慎重に開いて子宮角を露出させます。鈍器鉗子を使って子宮鎖を優しく外側に取り除きます。子宮組織を筋層に沿って解放し、卵管と正中子宮角の付着部で切断して胚を分離します。
  4. すぐに全胚を氷のように冷たい無菌の1x PBS1x10cmペトリ皿に移植します。
  5. 各胚を周囲の子宮、羊膜、絨毛膜から慎重に分離し、氷のように冷たく無菌の1倍PBSを含む新鮮な10cmの皿に移します。
  6. 胚の頭部を、無菌の外科用刃で発生段階で解剖し、さらに処理する前に氷のように冷たい1倍....

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Results

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この方法は、新たに解剖されたマウス胚の頭部を処理し、発育中の歯を含む頭蓋顔面組織のFFPEサンプルを作成し、マイクロトームで容易に切断しつつRNAの完全性を保つ方法を示しています(図1)。このプロトコルは、E13.5(胚発生日13.5)、E15.5、E16.5のマウス胚頭部に対して、高解像度画像ベース(図2)およびシーケンスベースの空間トランスクリプトミクス(図3)に対して成功裏に適用されました。シーケンシングベースの空間トランスクリプトミクスデータセットでは、マーカー遺伝子は空間クラスター間の発現差異を解析し、特定のクラスター内で濃縮された転写産物を検出し、空間的に発現パターンが制限された遺伝子の検査を行います。この複合的なアプローチにより、異なる細胞タイプや空間領域に遺伝子を確実に割り当てることが可能になります。候補マーカーの検証により、トランスクリプトム解析で特定された遺伝子が、完全な組.......

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Discussion

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本研究では、シーケンシングおよび画像ベースの空間トランスクリプトミクスを含む高解像度空間RNAイメージングプラットフォームでの利用に最適化されたマウス胚頭のFFPEブロックを準備するための詳細なプロトコルを提示します。このプロトコルの重要な目的は、組織の形態と核酸の完全性を頭部全体の切片全体で保持し、特に発達中の頭蓋顔面領域に重点を置くことです。このレベルの保存は、発達中の口蓋や歯の構造など複雑で多組織的な環境下での空間的遺伝子発現パターンを正確に解明するために極めて重要です。

最近の研究では、頭蓋顔面発生中の細胞異質性や系統特化を解析するための空間的トランスクリプトミクスの重要性が強調されています。例えば、単細胞RNAシーケンスと空間トランスクリプトミクスの統合により、歯の発達に関する包括的な転写アトラスの構築が可能になりました(14,15)。これらの統合データセットは、ヒト胚歯における異なる上皮.......

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Disclosures

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著者には開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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実験設計および技術支援に関する助言をいただいたセルゲイ・L・ライキン博士、エレナ・マカレエワ博士(NICHD/NIH物理生化学部門)、ジェレミー・オリバー・ピニャ博士(骨・歯の分子生物学部門、NIDCR/NIH)に心より感謝申し上げます。シーケンシングベースの空間トランスクリプトミクスランに技術支援を提供してくださったIben James博士、Molecular Genomics CoreのVivek Mahadevan博士に感謝します。画像ベースの空間トランスクリプトミクスに関する技術的支援を提供してくれたグスタフ・ウィガーブラッド博士(国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患国立研究所系統自己免疫部門)に感謝いたします。画像ベースの空間トランスクリプトオミクスランの技術支援を提供してくださったマイケル・ケリー博士とジャティンダー・シン博士(CCR単細胞分析施設(SCAF)、NCI/NIHに感謝します。NICHD動物施設のスタッフの皆様、動物飼育と繁殖のご協力に感謝いたします。 図1 は BioRender.com を用いて作成されました。

現在の原稿は、NIH/NIDCR(助成金、1RO1DE033520)からのM.B.への資金によって支えられています。資金提供者は研究設計、データ収集・分析、出版の決定、原稿の作成に関与しませんでした。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1倍PBSサーモ・フィッシャー10010023Use ワークフロー中にウォッシュを行うために
50 mL円錐形チューブ(Ambion)RNAseフリーサーモ・フィッシャーAM12502サンプルを異なる溶液で保存するために使用
高度軌道シェーカーVWR6683-470インキュベーション中に固定液中の組織を振る際に使用
アルコール70%、フィッシャーブランド、ヒストプレップフィッシャー・サイエンティフィックHC-1000-1GL作業スペースの清掃と消毒に使う
自動真空組織プロセッサーライカ・バイオシステムズASP300Sサンプルのクリアリング、脱水、再水和、ワックス浸透に使用します
ガラスのカバー厚さ:1.5、25 mm x 25 mm コーニング2850-25Visium HDワークフローにおけるスライドの取り付けに使用
Dako Bluing Buffer、すぐに使える状態アジラント・テクノロジーズCS70230-2H&での利用E染色
フロキシンを含むイオシンYフィッシャー・サイエンティフィック22050198H&での利用E染色
ヘマトキシリン、メイヤーズ、すぐに使える水溶液アジラント・テクノロジーズS330930-2H&での利用E染色
ヒストコア水浴ライカ・バイオシステムズHIS232640-43 & degの区画をフロートにしてください;CはFFPEのセクションのしわを取り除くため、nbsp;
Loupe ブラウザ 9.0.010X Genomics, Inc. Visium HDデータの解析に使用してください。
ロープロファイル使い捨てブレード DB80LXライカ・バイオシステムズ14035843496FFPEブロックを区切るために使います。
中性緩衝ホルマリン 10%アザー・サイエンティフィックNBF-4-G組織を直すために使う
RNaseZap RNase 除染溶液サーモ・フィッシャーAM9782RNaseの洗浄と除去に使用してください
半自動ロータリーミクトミーライカ・バイオシステムズRM2245ガイドラインで報告された通り、FFPEブロックを区切るために使用してください。
カバー付きスライドウォーマープレミア XH2004異なる温度でのスライドのキュベーションに使用
Superfrost Plus スライド フィッシャー・サイエンティフィック12-550-15 Vsium HD用のセクションを取り付けるために使用
手術用刃第11号インテグラ・ミルテックス4-311FFPE組織のスコアリングへの使用
サージパス・パラプラストライカ・バイオシステムズ39601006組織の浸潤および組織埋め込みを行うために使用
TISsue培養皿 100X20MM 500/CSフィッシャー・サイエンティフィック8772221倍PBSでのサンプル採取および解剖に使用
ウルトラピュアグリセロールサーモ・フィッシャー15514011CytAssist以前のカバーガラスのVisium HDスライド取り付けに使用
Visium CytAssist10X Genomics, Inc. PN-1000442Visium HDワークフロー実験への使用
Visium HD 空間RNAシーケンス10X Genomics, Inc. 1000676空間転写体実験の実施に使用
ゼニウム5K In Situ RNA局在化 10X Genomics, Inc. PN-1000724空間転写体実験の実施に使用
ゼニウムアナライザー10X Genomics, Inc. PN-1000481XeniumおよびXenium 5K RNAイメージングを実施。
ゼニウム・エクスプローラー410X Genomics, Inc. Xeniumのデータ解析に使用してください。
ゼニウムIn Situ RNA局在化10X Genomics, Inc. 1000672空間転写体実験の実施に使用

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al.

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