ホルマリン固定パラフィン埋め込みマウス胚組織における初期歯形形成の空間的トランスクリプトミクス

Summary

現在のプロトコルでは、マウス胚のE13.5およびE15.5頭蓋顔面領域からホルマリン固定されパラフィン埋め込みされた切片を用いて、空間的トランスクリプトミクスを用いて遺伝子発現プロファイルの差異解析を行うことを説明しています。

Abstract

発達中の歯は、多様な高度に専門化された細胞集団で構成されており、適切な形態と機能を維持するために協力しています。これらの細胞とその周囲の微小環境との相互作用を明らかにすることは、正常な歯の発達の基盤となる調節メカニズムを理解する上で極めて重要です。これらの過程の乱れは、歯の無形成、象牙質形成不全症、アメロゲネーシス不全症などの先天性疾患を引き起こすことがあります。単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)による細胞の異質性の明らかな進展は大きいものの、組織内の細胞の空間的文脈を保持できず、遺伝子発現と組織構造を関連付ける能力を制限しています。空間トランスクリプトミクス技術は、高解像度の遺伝子発現プロファイリングとネイティブ組織構造の保存を統合することで、この制約に取り組み、分子シグネチャーの 現地 定位を可能にします。ここでは、マウス胚性頭蓋顔組織の採取、固定、パラフィン埋め込みのためのステップバイステッププロトコルを説明し、下流の空間転写体応用に適しています。ワークフローは、高解像度空間解析のためにRNAの完全性と組織形態を保存するために、ホルマリン固定およびパラフィン埋め込み組織の最適な切片と取り扱いを詳細に行っています。この手法はシーケンシングおよび画像ベースの空間トランスクリプトミクスプラットフォームと互換性があり、マウス胚における初期歯の形態形成の再現可能な空間トランスクリプトミックプロファイリングを可能にします。このアプローチは、発達状態および病理状態における頭蓋顔面構造の空間的組織と機能的動態に関する強力な洞察を提供し、分子メカニズムと組織形態を結びつける重要な枠組みを提供します。

Introduction

歯の発生は、初期胚成長中の高度に協調した形態形成過程の^{序列1,2,3,4}に依存しています。遺伝学的および発生的研究を通じて多くの主要な遺伝子やシグナル伝達経路が特定されていますが、これらの因子が個々の頭蓋顔面構造をどのように形成するかについては、まだ限られた理解が残っています。特筆すべきは、特定の遺伝的変異を症候群性および非症候群性歯疾患と結びつける上で大きな進展があったにもかかわらず、構造特異的形態形成の詳細な分子メカニズムはまだ完全には解明されていません(^1,2,3,4)。この知識のギャップは、歯の無形成症やその他の歯の異常に対する標的治療戦略の進展を引き続き制限しています。

単細胞mRNAシーケンシング(scRNA-seq)により、健康な組織と病変組織の両方でこれまで認識されていなかった細胞型の発見や、異なる遺伝子発現プロファイルに基づく複数の細胞サブタイプの同定が可能になりました。しかし、scRNA-seqは組織を単一細胞に分離させる必要があるため、各細胞の元の組織内の空間的位置に関する情報は失われます。その結果、これらのデータセットは細胞の組織構造に対する配列の様子を捉え^{ていません。}さらに、予測される細胞間相互作用は転写産本の補完的な相互作用の存在に依存しますが、実際の空間情報は考慮していません。これは、そのような相互作用が生体内で起こるかどうかを判断する上で^{重要です。}

空間トランスクリプトミクス技術により、組織切面^8,9内の空間情報を保持しつつ、遺伝子発現のハイスループットプロファイリングが可能となります。空間トランスクリプトミクス技術は、画像ベースの10,11,12またはシーケンスベースの^12,13のいずれかです。画像駆動型空間トランスクリプトミクスのアプローチでは、FISHを用いて細胞内または細胞内空間的な精度で標的遺伝子発現を検出・測定します。これに対し、シーケンシングベースの技術は、より低い空間分解能でトランスクリプトーム全体の遺伝子発現を捉えます。シーケンシングベースの空間トランスクリプトミクスは、全転写体カバレッジ(~20,000遺伝子)でほぼ単一細胞分解能を達成する戦略を採用し、偏りのない探索解析を支援します。一方、画像ベースの空間トランスクリプトミクスは最大~5,000遺伝子の遺伝子パネルを標的とし、特定の経路や細胞相互作用の正確な仮説に基づく解析を可能にします¹⁴。

空間トランスクリプトミクスの技術進歩により、保存された組織構造内での遺伝子発現の解析が可能になりました。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)およびクライオセクションベースのワークフローは、空間トランスクリプトミクスに対する補完的なアプローチを提供します 15,16,17。FFPEは組織構造の優れた保存を提供し、発達中の歯や口蓋棚など構造的に複雑な組織における遺伝子発現の正確な空間マッピングを可能にします。本研究および他の研究において、FFPE固定とアーカイブは非常に正確かつ再現性の高い空間転写体データを得ています¹⁸。クライオセクションのワークフローはRNAの完全性を保ちますが、^組織の歪みが起こりやすいです。したがって、FFPEが本研究に選ばれました。scRNAシーク序の成功は主に高いRNA完全性の維持に依存しますが、空間的トランスクリプトミクスは遺伝子発現シグナルを特定の組織学的特徴に正確に定位するために高品質な組織形態学も必要です。

このプロトコルは、空間的トランスクリプト解析において微細組織構造の保存が重要な初期発生段階のFFPEマウス胚性頭蓋顔面組織に最適です。過剰固定サンプル、配向が悪いパラフィンブロック、またはRNAの完全性が損なわれた組織では、ワークフローが最適でない可能性が高く、信号品質の低下や空間分解能の低下につながる可能性があります。この方法の成功した適用は、組織形態が完全な状態、切断歪みが最小限、組織学的特徴と整合した強靭で空間的に解明されたトランスクリプトムシグナルによって示されています。

Protocol

すべての動物処置は、国立衛生研究所(NIH)国立児童健康・人間発達研究所動物ケア・利用委員会(ACUC)の動物研究プロトコル#21-031のもとで承認されています。

1. 実験動物の準備および組織の採取

1. 健康で繁殖可能なオスとメスの Mus musculus をペアで、タイミングよく交尾させましょう。妊娠中のメスのマウスは、胚発生日(E)0.5とされる膣栓の存在で識別します。
2. 妊娠中のメスマウスはCO₂吸入後、子宮頸部脱臼で安楽死させます。動物の仰向けを無菌の吸収手術面に置き、腹部を70%エタノールで切開部に沿って消毒します。
3. 無菌の外科用ハサミで腹部の中央切開を行い、顕微外科的ハサミで腹膜壁を慎重に開いて子宮角を露出させます。鈍器鉗子を使って子宮鎖を優しく外側に取り除きます。子宮組織を筋層に沿って解放し、卵管と正中子宮角の付着部で切断して胚を分離します。
4. すぐに全胚を氷のように冷たい無菌の1x PBS1x10cmペトリ皿に移植します。
5. 各胚を周囲の子宮、羊膜、絨毛膜から慎重に分離し、氷のように冷たく無菌の1倍PBSを含む新鮮な10cmの皿に移します。
6. 胚の頭部を、無菌の外科用刃で発生段階で解剖し、さらに処理する前に氷のように冷たい1倍PBSで一度だけすすいでください。

2. 組織の固定と処理

1. 発生段階で胚性マウスの頭部を解剖し、10%中性緩衝ホルマリンを室温シェーカーで一晩固定します。
2. 固定後、ホルマリンを除去し、サンプルを1x PBSで洗い流した後、保存のために70%エタノールに移します。自動組織処理機を用いて組織脱水、クリアリング、パラフィン浸潤を行います。
3. 胚の頭部を冠状面または矢状面のいずれかに配置したパラフィンに埋め込む。
4. ワックスの固化後、パラフィンブロックを型から取り出し、ラベル付きの気密容器またはジップロック袋に入れ、4°Cで保存して区切りします。
   注:FFPEブロックは切片前に数年間保存しても組織の完全性を損なうことはありません。

3. 空間的トランスクリプトミクスのためのFFPE組織の処理

1. 作業面や器具を70%エタノールで消毒し、RNase除染液で処理してRNA分解を最小限に抑えます。
2. 脱イオン水を含む水浴を準備し、40°Cで維持し、胚期や組織特性に応じて40°Cから43°Cの温度を調整します。
3. マイクロトームを設置し、RNase除染液で優しく拭き取った後に新しい刃を取り付け、刃を固定し、クリアランス角度を10°に設定します。
   注意:正確な組織スライスを行うためには、新しい刃を切片に使用してください。ミクロトームブレードの角度を変えることは切片の品質に大きな影響を与え、組織の完全性、厚さの均一性、形態的特徴の保存に影響を及ぼします。
4. 埋め込み組織の周囲から余分なパラフィンをトリミングし、FFPEブロックをマイクロトームのコールドステージに取り付けます。
5. 使用前に、清潔なピンセットやブラシをRNase除染液で準備し処理してください。
6. パラフィンブロックの面をミクロトームブレードに合わせ、約12μmのトリミングカットを行い、関心のある領域に近づくまで(例:冠状切片で奥歯の内側部分が見えるまで)。必要に応じてブロックやブレードの位置を調整し、ヘッド全体の冠状断面が対称的かつ適切に向き合うようにします。
7. 組織切片のRNA分離を行う場合は、10μm切片を直接1mLのマイクロ遠心分離機管に採取し、製造者の推奨事項に従って処理してください。DV200品質^{評価のため}。
8. 厚さ5μmの連続断片を切断し、通常のスライドのテスト断面を顕微鏡で観察することで、対象領域への近接性を継続的に監視します。
9. 関心のある領域に近づいたら、No.11メスの刃で組織部分を完全に切断せずに、2つの戦略的に間隔を空けて組織部分の反りや接着を防ぎます。区切り後は、細いブラシの毛で付着したパラフィンを除去します。
10. 組織の断片を41°Cの水浴に浮かせて、穏やかなリラックスと平らな状態にしてからスライドで拾い上げます。

4. シーケンシングベースの空間トランスクリプトミクス

1. 推奨されるガラススライドに組織断片を採取し、関心のある領域が6.5×6.5mmの範囲内に収まるようにします。複数の隣接するセクションが同じスライドに置かれた場合は、40°Cのスライドウォーマーで短時間スライドを温めて接着を促進し、以前に置かれたセクションの剥離を防ぎます。すべての切片を位置づけた後、60°Cの蓋付きのスライドウォーマーで2時間培養し、組織の付着を強化します。
   注:6.5mm×6.5mmの範囲を超える区画は処理されませんでした。
2. 培養後、標準的なH&E染色プロトコルを用いてヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行い、RNAの完全性を保つために水道水の代わりに脱イオン水を使用します。
3. マウントは80%グリセロールを用いてカバースリップをし、高解像度のH&E画像を取得し、スライドイメージングや組織移植システムで生成される従来のH&E画像に代わる高品質な参照画像を提供します。
4. 画像診断後、スライドを脱イオン水入りの50 mLチューブに個別に浸してカバースリップを取り出し、その後の処理のためにコア施設に提出する準備をします。

5. 画像ベースの空間転写体学

注:スライドは製造元²⁰から供給され、それぞれ12mm×24mmの指定画像領域(輪郭線)があり、サンプル配置領域は約235mm²(10.45mm×22.45mm)です。

1. 組織切片はこの定義された領域内に完全に配置し、残留パラフィンを含む切片が重ならないようにしてください。複数の隣接セクションを設置する際は、スライドウォーマーで40°Cで短時間スライドを温めて接着を促進し、以前に取り付けられたセクションの剥離を防ぎます。
2. すべての組織切片が位置決められたら、スライドを覆われたスライドウォーマーに入れ、40°Cで一晩培養して適切な付着を確保します。
3. インキュベーション後は、製造元の¹⁹ プロトコルに従いスライドを処理し、RNAシーケンスのためにマシンにロードします。プロトコルは最新のバージョンと照合し、手順の詳細は定期的に更新されることがあります。
   注意:プロトコル期間中に生成されたホルマリン、エタノール、RNase除染剤などすべての有害物質は、適切な化学廃棄物容器、バイオハザード処理方法、換気フードの操作を用いて、機関の安全方針および地域規制に従って処分されるべきです。

Results

この方法は、新たに解剖されたマウス胚の頭部を処理し、発育中の歯を含む頭蓋顔面組織のFFPEサンプルを作成し、マイクロトームで容易に切断しつつRNAの完全性を保つ方法を示しています(図1)。このプロトコルは、E13.5(胚発生日13.5)、E15.5、E16.5のマウス胚頭部に対して、高解像度画像ベース(図2)およびシーケンスベースの空間トランスクリプトミクス(図3)に対して成功裏に適用されました。シーケンシングベースの空間トランスクリプトミクスデータセットでは、マーカー遺伝子は空間クラスター間の発現差異を解析し、特定のクラスター内で濃縮された転写産物を検出し、空間的に発現パターンが制限された遺伝子の検査を行います。この複合的なアプローチにより、異なる細胞タイプや空間領域に遺伝子を確実に割り当てることが可能になります。候補マーカーの検証により、トランスクリプトム解析で特定された遺伝子が、完全な組...

Discussion

本研究では、シーケンシングおよび画像ベースの空間トランスクリプトミクスを含む高解像度空間RNAイメージングプラットフォームでの利用に最適化されたマウス胚頭のFFPEブロックを準備するための詳細なプロトコルを提示します。このプロトコルの重要な目的は、組織の形態と核酸の完全性を頭部全体の切片全体で保持し、特に発達中の頭蓋顔面領域に重点を置くことです。このレベルの保存は、発達中の口蓋や歯の構造など複雑で多組織的な環境下での空間的遺伝子発現パターンを正確に解明するために極めて重要です。

最近の研究では、頭蓋顔面発生中の細胞異質性や系統特化を解析するための空間的トランスクリプトミクスの重要性が強調されています。例えば、単細胞RNAシーケンスと空間トランスクリプトミクスの統合により、歯の発達に関する包括的な転写アトラスの構築が可能になりました(^14,15)。これらの統合データセットは、ヒト胚歯における異なる上皮...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1倍PBS	サーモ・フィッシャー	10010023	Use ワークフロー中にウォッシュを行うために
50 mL円錐形チューブ(Ambion)RNAseフリー	サーモ・フィッシャー	AM12502	サンプルを異なる溶液で保存するために使用
高度軌道シェーカー	VWR	6683-470	インキュベーション中に固定液中の組織を振る際に使用
アルコール70%、フィッシャーブランド、ヒストプレップ	フィッシャー・サイエンティフィック	HC-1000-1GL	作業スペースの清掃と消毒に使う
自動真空組織プロセッサー	ライカ・バイオシステムズ	ASP300S	サンプルのクリアリング、脱水、再水和、ワックス浸透に使用します
ガラスのカバー厚さ:1.5、25 mm x 25 mm	コーニング	2850-25	Visium HDワークフローにおけるスライドの取り付けに使用
Dako Bluing Buffer、すぐに使える状態	アジラント・テクノロジーズ	CS70230-2	H&での利用E染色
フロキシンを含むイオシンY	フィッシャー・サイエンティフィック	22050198	H&での利用E染色
ヘマトキシリン、メイヤーズ、すぐに使える水溶液	アジラント・テクノロジーズ	S330930-2	H&での利用E染色
ヒストコア水浴	ライカ・バイオシステムズ	HIS2326	40-43 & degの区画をフロートにしてください;CはFFPEのセクションのしわを取り除くため、nbsp;
Loupe ブラウザ 9.0.0	10X Genomics, Inc.		Visium HDデータの解析に使用してください。
ロープロファイル使い捨てブレード DB80LX	ライカ・バイオシステムズ	14035843496	FFPEブロックを区切るために使います。
中性緩衝ホルマリン 10%	アザー・サイエンティフィック	NBF-4-G	組織を直すために使う
RNaseZap RNase 除染溶液	サーモ・フィッシャー	AM9782	RNaseの洗浄と除去に使用してください
半自動ロータリーミクトミー	ライカ・バイオシステムズ	RM2245	ガイドラインで報告された通り、FFPEブロックを区切るために使用してください。
カバー付きスライドウォーマー	プレミア	XH2004	異なる温度でのスライドのキュベーションに使用
Superfrost Plus スライド	フィッシャー・サイエンティフィック	12-550-15	Vsium HD用のセクションを取り付けるために使用
手術用刃第11号	インテグラ・ミルテックス	4-311	FFPE組織のスコアリングへの使用
サージパス・パラプラスト	ライカ・バイオシステムズ	39601006	組織の浸潤および組織埋め込みを行うために使用
TISsue培養皿 100X20MM 500/CS	フィッシャー・サイエンティフィック	877222	1倍PBSでのサンプル採取および解剖に使用
ウルトラピュアグリセロール	サーモ・フィッシャー	15514011	CytAssist以前のカバーガラスのVisium HDスライド取り付けに使用
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Visium HDワークフロー実験への使用
Visium HD 空間RNAシーケンス	10X Genomics, Inc.	1000676	空間転写体実験の実施に使用
ゼニウム5K In Situ RNA局在化	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	空間転写体実験の実施に使用
ゼニウムアナライザー	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	XeniumおよびXenium 5K RNAイメージングを実施。
ゼニウム・エクスプローラー4	10X Genomics, Inc.		Xeniumのデータ解析に使用してください。
ゼニウムIn Situ RNA局在化	10X Genomics, Inc.	1000672	空間転写体実験の実施に使用