CAR T 細胞の機能プロファイリングのためのビーズベースの多重フローサイトメトリーアッセイ

Summary

この記事では、キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞由来のスーパーナタントから最大12種類のサイトカインとエフェクター分子を定量化するためのマルチプレックスビーズベースのフローサイトメトリーアッセイを紹介します。これにより、少量のサンプルでエンジニアリングされたT細胞の機能性を迅速かつ再現性のある分析が可能になります。

Abstract

CAR T細胞のプロファイリングは、その多様性、複雑な免疫反応、および限られたサンプル入手可能性のため、課題を提示します。マルチプレックスアッセイは、サイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性メディエーターなど、幅広いエフェクター分子の同時検出を可能にすることで機能評価を可能にします。ここでは、フローサイトメトリーと互換性のあるビーズベースのマルチプレックスアッセイについて説明し、これはヒトのキメラ抗原受容体（CAR）T細胞によるエフェクター分子分泌の分析に使用されます。CAR T細胞のスーパーナタントは、解析物特異的な抗体に結合した複数の蛍光コード化された集団からなる捕捉ビーズの混合物とインキュベートされます。これらのビーズはサンプル中の可溶性の標的と結合し、ビーズ-解析物複合体を形成し、これらは次に、標識された検出抗体を使用して検出されます。このアッセイには、インターフェロン（IFN）-α、インターロイキン（IL）-2、腫瘍壊死因子（TNF）-α、IL-6、IL-10、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、およびグランザイムBなどの免疫メディエーターパネルが含まれます。事前に定義された基準の使用により、単一のサンプルから複数の解析物の定量測定が可能になります。データ取得と分析は、機器に関連付けられたまたはウェブベースのソフトウェアツールによって提供される自動ゲーティングアプローチを使用して実行でき、データ処理を容易にします。結論として、提示されたマルチプレックスアッセイは、CAR T細胞の機能性の多変量分析を可能にし、研究、品質管理テスト、メカニズム研究、機能的特徴付けなどの文脈で適用できます。

Introduction

機能的特性評価は、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞の試験において不可欠であり、これらの治療法の効力、安全性、および作用メカニズムに関する洞察を提供します。サイトカインおよび細胞傷害性メディエーターのシグネチャーを理解することは、治療効果と潜在的な有害効果を評価し、安全で効果的な治療法の開発を確実にするために役立ちます。酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）などの従来の単一プレックスアッセイには、高いサンプル量、長時間の処理時間、各解析物に対する個別の実行が必要であり、個々のサンプル内での限られた動的範囲を提供するという制限があります^1,2。対照的に、ビーズベースのマルチプレックスアッセイは、複数の可溶性メディエーターの同時検出を可能にし、処理時間を短縮しサンプル要件を減少させながら動的範囲を拡大します^1,2。この効率性と分析の深さにより、マルチプレックスアッセイはCAR T細胞の研究開発を進めるための貴重なツールとなります^3,4,5。

この研究で提示されるマルチプレックスアッセイは、カプチャービーズを使用し、これらはフオレスセインイソチオシアネート（FITC）およびファイコエリスリン（PE）チャネルで定義された蛍光プロファイルを示し、可溶性解析物に対する特異的な抗体でコーティングされています。サンプルとインキュベーションすると、これらのビーズは溶液から標的解析物を選択的に結合します。解析物の捕捉後、検出抗体が加えられ、解析物特異的なサンドイッチ複合体を形成します。これらの抗体は直接アロフィコシアニン（APC）に結合（直接検出）またはビオチンに結合（間接検出）しています。間接検出には、APC結合抗ビオチン抗体を用いた追加のインキュベーションが必要です（図1）。結果として生じる複合体 – カプチャービーズ、解析物、検出抗体からなる – はフローサイトメトリによって分析され、解析物濃度を定量化します。マルチプレックスアッセイはプレートベースの技術であり、解析物特異的な標準曲線を生成するために使用される事前定義された標準が含まれています^1,2。

図1: サイトカイン技術の原理とアッセイのワークフロー。 アッセイは、解析物特異的な抗体に結合した12の蛍光コード化されたカプチャービーズの集団に基づいています。サンプルのインキュベーションにより、フローサイトメトリを用いて特定の検出抗体で検出可能なビーズ-解析物複合体が形成されます。アッセイのワークフローには、1) フィルタープレート上の解析物標準および対象サンプルの準備、2) カプチャービーズによるインキュベーション、3) サンドイッチ複合体を形成するためのビオチン標識抗解析物抗体のインキュベーション、4) APC標識抗ビオチン抗体によるインキュベーション、5) 測定用バッファーでの再懸濁、6) サンプルの取得が含まれます。 こちらをクリックして、この図の拡大版をご覧ください。

この研究で説明されているマルチプレックスアッセイは、青色（例：488 nm；FITCおよびPEチャネル）と赤色レーザー（例：635 nm；APCチャネル）を備えた標準的なフローサイトメーターと互換性があります。フローサイトメーターが研究室、臨床現場、品質管理環境で広く利用されているため、この互換性により追加の専門機器を必要とせずに実装が可能となります⁵。CAR T細胞機能性試験の文脈では、このアプローチにより、一般的に利用可能な分析ワークフロー内で多変量の機能的反応評価が可能になります⁶。このアッセイは、GM-CSF、グラヌザイムB、インターフェロン（IFN）-γ、インターロイキン（IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、モノサイトケモアトラクタントプロテイン-1（MCP-1）、ペルフォリン、および腫瘍壊死因子（TNF）-α（ヒト細胞傷害性パネル）など、主要な解析物の同時定量化を可能にすることで、CAR T細胞研究に大きな利点を提供します。これらのメディエータは、CAR T細胞の活性化、エフェクター機能、および安全性に関連するサイトカイン放出を理解する上で重要です^4,5,7,8。

アッセイのワークフローには、機器に関連するソフトウェアによる自動ゲーティングおよびデータ分析のオプション、および機器に依存しないウェブベースの分析ツールが含まれています⁵。これらの機能により、手動介入の範囲を減少させることで、CAR T細胞エフェクター分子のプロファイリングデータの効率的な処理がサポートされます。自動分析の使用は、データ処理の一貫性の向上と、機能的読み取りのより効率的な評価に寄与する可能性があります⁸。

本プロトコルは、CAR T細胞免疫メディエータープロファイリングのための再現可能でスケーラブルなマルチプレックス方法を概説しています。単一のサンプルで12の異なる解析物を測定することで、このアプローチはメカニズム調査、初期段階の研究、および併行研究に特に関連しています。CAR T細胞療法の後期段階では、特に薬剤放出試験のための規制された時間制約のある品質管理（QC）環境で測定されるサイトカインの数を減少させることが有益である場合があります。この目的のために、提示されたパネルから1～7のサイトカインを組み立てて、工学的T細胞分析のために検証できるカスタムサイトカインアッセイを設計することができます。これにより、CAR T細胞療法の初期および後期段階の研究およびQC設定の両方での多様な用途に、説明されたプロトコルが理想的に適しています^3,4,5,9。

Protocol

すべてのヒトサンプルは、書面による同意を得た上で、健康な匿名のボランティアから採取されました。すべての手順は、ノルトライン・ウェストファーレン州医師会倫理委員会（#2020272）によって承認され、必要な倫理および生物安全規制に従って実施されました。

1. CAR T 細胞の共培養

1. コグネート抗原の有無（例：抗原提示腫瘍細胞）で、工学的ヒトCAR T細胞の培養液を2.5:1（エフェクター：標的細胞）の比率で調製します。
2. 分泌サイトカインを1回分析するか、または定義された時間枠（例：4、8、16、24、48時間）におけるサイトカイン動態を分析するために、上清を収集する1つまたは複数の時間点を定義します。
   注：上清は直接使用するか、後で使用するために凍結保存することができます。

2. 標準およびサンプルの準備

1. 試料標準を再構成し、ペレットに200 μLの緩衝液または細胞培養培地を加え、ゆっくりと混合します。6つの試薬チューブを調製し、再構成された標準を1:5希釈シリーズで3.2 pg/mLまたは0.6 pg/mL（試料に応じて）まで希釈し、ブランクを調製します。
2. 共培養後16時間または24時間のCAR T 共培養上清を採取します。オプションで、フローサイトメトリーを用いて平行してCAR T 細胞を収穫し、表現型分析を行います。
3. サンプルを10,000 × g で10分間4°Cで遠心分離します。上清をそのまま使用するか、標準曲線の範囲に合わせて希釈します。

3. アッセイワークフロー

1. キャプチャービーズミックスを渦混合し、よく再懸濁します。96ウェルフィルタープレートのウェルに、標準またはサンプルの50 μLと、予め希釈されたビーズ20 μLを加えます。
2. 室温で2時間、450 rpmで振とうしながら、暗所でインキュベートします。真空マニホールドまたは遠心分離機を用いて、200 μLの緩衝液でウェルを2回洗浄します。
3. 1:50に予め希釈された検出試薬1（緩衝液中）を100 μL加えます。室温で1時間、450 rpmで振とうしながら、暗所でインキュベートします。2回洗浄します。
4. 1:50に予め希釈された検出試薬2（緩衝液中）を100 μL加えます。室温で30分、450 rpmで振とうしながら、暗所でインキュベートします。1回洗浄します。
5. 検出のために、サンプルを200 μLの緩衝液で再懸濁します。アッセイワークフローの概要は図1に示されています。

4. データの取得と解析

1. 青色および赤色レーザー（PE、FITC、およびAPCチャンネルが必要）を搭載したフローサイトメーターでデータを取得します。MACSQuantフローサイトメーターを使用する場合は、完全自動ゲーティングとデータ解析のためにExpress Modeテンプレートを使用します。
2. または、FSCまたはMQDデータファイルをWebベースのInspectoRツールにアップロードします。このツールは自動的な定量サイトカイン測定を行い、使用する機器に関係なく、エクスポート可能な結果を提供します。
3. FITC対PEチャンネルでの12種類のキャプチャービーズ集団の適切な分離を確認してください。
4. 標準曲線を用いてサイトカイン濃度を計算し、結果をエクスポートして視覚化します。
5. MACSQuantフローサイトメーターでのデータ取得には、キャプチャービーズバイアルの2Dバーコードを使用します。これには、すべての関連する取得設定が含まれています。
   1. ソフトウェアにログインした後、サンプルラックとしてMACSPlex Filter Plateを選択し、ツールバーのBarcodeボタンをクリックして2Dコードリーダーを起動します。
   2. バイアルをリーダーに提示し、コードが点滅する光に向けて最適な距離（0.5–2.5 cm）で向きを合わせます。
   3. Autolabelタブで、Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h)とNoLabelを割り当てます。細胞傷害性T/NK細胞標準のシリアル希釈では、グループ位置を定義し、Settings タブでExpress Modeを選択し、Type: AnalysisとMode: MACSPlex_Standardを設定し、必要に応じて緩やかな混合を適用します。
   4. 未知のサンプルは同様に割り当てられ、位置が定義され、オプションのグループ化、Express Mode、Type: Analysis、およびMode: MACSPlex_SampleをSettingsタブで選択し、オプションのサンプルIDと説明を含めます。
   5. Experimentテーブルでラック定義が正しいことを確認し、フィルタープレートのウェルに適切な液体レベルがあることを確認し、測定を開始します。

Results

12の可溶性分析物を符号化する代表的なカプチャービード群の同定

カプチャービード群はフローサイトメーターのFITCおよびPEチャネルを使用して同定されました。個々の分析物を示す異なるビードクラスターが二軸プロットで明確に解像され、IL-10、グランザイムB、MCP-1、IL-17A、パーフォリン、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-4、GM-CSFが含まれます（図2）。各群は独自の蛍光シグネチャを示し、測定したサイトカインとエフェクター分子の成功した多重検出と明確な区別を確認しました。

図2: 代表的な多重カプチャービード群の検出。 カプチャービードには異なる分析物に特有の群を区別するために使用できる固有の蛍光強度が含まれています。散布図はFITC（B1）とPE（B2）チャネルの蛍光強度に基づく分析物に特有の信号の分離を表示しています。この画像は、GM-CSF、グランザイムB、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、MCP-1（CCL2）、パーフォリン、TNF-αを符号化する12のカプチャービード群の代表的なプロファイルを示しています。 こちらをクリックして、この図の拡大版をご覧ください。

腫瘍細胞と共培養後のCAR T細胞の代表的なサイトカイン濃度プロファイル

CAR T細胞と腫瘍標的細胞の共培養後、サイトカイン濃度は多重アッセイのヒューマンサイトトキシンパネルを使用して定量化されました（図3）。CAR T細胞はグランザイムB（49,950.2 pg/mL）、IFN-γ（48,367.8 pg/mL）、TNF-α（7,055.2 pg/mL）、GM-CSF（6,653.5 pg/mL）の高レベルを分泌し、腫瘍との接触に応じて強力な活性化と細胞傷害性エフェクター機能を示しました。IL-2レベルは上限検出限界を超えました（>10,000 pg/mL）、強力な増殖シグナリングと一致しています。サンプルはさらに希釈または再測定されませんでした。対照的に、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、MCP-1を含む調節または代替ヘルパーT細胞応答に関連するサイトカインは低レベルまたは検出不能に近くありました。これらの結果は、CAR T細胞が高いエフェクター活性と限られた免疫抑制性サイトカイン産生を特徴とする主にタイプ1（Th1/細胞傷害性）免疫応答を展開したことを示唆しています。

図3: 腫瘍細胞と共培養後のCAR T細胞の代表的なサイトカインプロファイル。 エンジニアリングされたキメリック抗原受容体（CAR）T細胞はJeKo-1腫瘍細胞と1晩共培養されました。16時間のインキュベーション後に細胞培養上清液を収穫し、懸濁物を除去するために遠心分離しました。希釈したサンプルは多重アッセイのヒューマンサイトトキシンパネルを使用して分析されました。2つの標準曲線が実行され、12のすべての分析物の濃度が決定されました。フローサイトメーターのExpressモードを使用した分析および分析物に特有の濃度の計算のための代表的なデータ出力を示しています。棒グラフと付随する表には、12のエフェクター分子（ピコグラム/ミリリットル）の計算されたレベルを示しています。 こちらをクリックして、この図の拡大版をご覧ください。

抗原特異的刺激によるCAR T細胞のサイトカイン分泌動態

CAR T細胞と（抗原−）または（抗原+）相同抗原を有するまたは欠く標的細胞との共培養後、サイトカインの分泌は多重アッセイのヒューマンサイトトキシンパネルを使用して時間経過にわたってモニタリングされました。CAR T細胞は抗原−標的の認識時にグランザイムB、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-2の強い上方制御を伴う抗原+標的の迅速かつ強力なサイトカイン放出を示し、8〜24時間でピークレベルに達しました（図4）。このパターンは、抗原接触後の強力な活性化と細胞傷害性エフェクター機能を示します。IL-6、IL-17A、IL-21の緩やかな増加も観察されましたが、IL-4、IL-10、MCP-1、パーフォリンは低レベルまたは適度に上昇したままでした。対照的に、抗原−標的との共培養はすべての分析物にわたって最小限のサイトカイン誘導を示しました（図4）。これらのデータは、CAR T細胞の活性化とエフェクターサイトカインの産生が抗原認識に応じて特異的に発生し、時間とともに強化すると示しています。

図4: 抗原陽性または抗原陰性標的細胞と共培養されたCAR T細胞のエフェクター分子分泌動態。 エンジニアリングされたキメリック抗原受容体（CAR）T細胞は、相同CAR T細胞抗原を有する（抗原−）または有しない（抗原+）標的細胞と4、8、16、24、48時間共培養されました。各時間点で、培養上清液を収集し、ヒューマンサイトトキシンパネルの多重アッセイを使用して時間経過にわたる幅広い可溶性エフェクター分析物を定量化するために分析されました。12の分析物のサイトカイン動態を示しています（ピコグラム/ミリリットル）。

Discussion

マルチプレックスアッセイは、CAR T 細胞の共培養における可溶性免疫メディエーター反応のプロファイリングに使用されました。抗原陽性標的細胞と共培養されたCAR T 細胞は、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、グラニザイムB、およびIL-2の分泌が増加し、エフェクターの活性化と細胞傷害機能に一致していました^4,5,8。対照的に、抗原陰性の対照では、サイトカイン産生が低く、試験条件下で抗原特異的反応を区別する能力を示しました^5,8。これらの結果は、効力関連分析、安全性関連プロファイリング、およびメカニズム解析を含むCAR T 細胞機能性を評価するためのアッセイの適用可能性を支持しています。

固定された12種類の分析物パネルはCAR T 免疫活性の広範な概要を提供しますが、すべての用途で完全な分析物の範囲を捉えることは実用的ではない場合があります。アッセイ検証やCAR T 細胞製品の品質管理（QC）試験などの焦点を絞ったワークフローでは、パネルを縮小されたサブセット（例：IL-2、IFN-γ、およびTNF-α}）にダウンスケールして、機能的感度を維持しながら分析を効率化することができます^1,2。

プロトコルにおける重要なステップには、CAR T 細胞共培養の設計とサンプリング条件の適切な選択が含まれます。特に、共培養期間とエフェクター細胞数（E:T 比）はサイトカインの大きさを直接決定し、アッセイ設定時に定義されるべきです^5,6。さらに、サンプル希釈はアッセイのダイナミックレンジ内に分析物の濃度が収まるように調整すべきです^1,2。したがって、トラブルシューティングは標準曲線のパフォーマンスを確認し、信号が定量可能な範囲外に落ちる場合に共培養条件または希釈係数を調整することに焦点を当てるべきです^1,2。

従来のシングルプレックスELISAと比較して、フローサイトメトリーベースのマルチプレックスプラットフォームは、最小の試料量から高密度多分析データセットを生成します。単一の試料内で複数の分析物を同時に測定できるマルチプレックスは、複数のシングルプレックスアッセイを実行するのと比較して、全体的な試薬消費を減らし、試料の処理能力を向上させ、アッセイ時間を短縮することができます^1,2。自動化された取得と標準化された分析オプションは、ユーザー依存性の変動を減らし、実験または製造設定全体での再現性とスケーラビリティをサポートする可能性があります^5,8。標準ELISA検出感度は通常16から2000 pg/mLの範囲です（高感度キットではより低くなる場合があります）⁷。この研究で提示されたプラットフォームでは、最低検出可能な濃度は最も感度の高い分析物で0.05 pg/mLから、本質的に検出感度の低い分析物で約93.8 pg/mLの範囲です。内部評価全体で、測定された分析物の74％以上が5 pg/mL未満の検出限界を示し、38％は1 pg/mL未満で検出可能であり、システム全体の感度の高いことを強調しています。マルチプレックス感度はサイトカインによって異なる可能性があるため、潜在的なエピトープ競合は重要な考慮事項です。このような干渉を最小限に抑えるために、アッセイは各分析物の捕捉と検出に重複しないエピトープを使用し、マルチプレックス条件下での測定の信頼性を向上させています。

マルチプレックスアッセイのパフォーマンスは、アッセイ感度と生物学的文脈に応じて分析物によって異なる可能性があり、特定の条件下では分析物の濃度が検出の上限に近づく可能性があるため、アッセイ設定時に評価する必要があります。逆に、実験条件によっては、MCP-1やIL-4など、一部の分析物は検出不可能である場合があります。さらに、サンプル処理などの前分析的要因がサイトカイン測定に影響を与える可能性があり、比較可能性を確保するために一貫した処理条件を維持する必要があります。

全体として、このマルチプレックスアプローチはCAR T 細胞機能性の効率的かつ定量的な特徴付けを可能にします。既存のマルチプレックスサイトカイン検出プラットフォームと比較して、このアッセイは標準的なフローサイトメーターと互換性があり、効率的なデータ取得と分析を容易にするソフトウェアツールが含まれています。マルチプレックスサイトカイン検出は他の免疫設定でも使用されてきましたが、この研究では標準化されたワークフロー内でCAR T 細胞機能プロファイリングへの応用を示しています。ビーズベースの形式により、単一プレックス法と比較して高い処理能力を持つ複数の分析物の同時検出が可能になります。潜在的な応用には、CAR バインダー評価、ベクター最適化、プロセス開発などの薬剤製品の機能評価が含まれます。アッセイのスケーラビリティと自動分析機能は、効力試験、安全性プロファイリング、CAR T 細胞の挙動と機能性を理解することを目的としたメカニズム研究もサポートします^5,7,8。

サイトカイン分泌プロファイルはCAR T 細胞の活性化と機能的効力 in vitro に関する貴重な洞察を提供しますが、患者の治療効果を決定する複雑な生物学を完全に再現することはできません。腫瘍微小環境、抗原密度、免疫調節、およびin vivo の持続性などの要因は、制御されたアッセイで測定できるものを超えてCAR T 細胞の性能に影響を与えます^6,8,10。それにもかかわらず、マルチプレックスサイトカインプロファイリングなどの堅牢で標準化された機能アッセイを確立することは、薬剤製品の機能的特徴付けに向けた重要なステップです^3,4。サイトカインパターンはCAR T 細胞の活性だけでなく、サイトカイン放出症候群（CRS）や免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ICANS）などの毒性現象とも密接に関連しています^3,6,7。現在、測定方法と報告限度の変動性が試験

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	ビードベースの多重サイトカインアッセイ、フローサイトメトリー用
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	MACSPlexデータの自動ゲーティングと分析のためのウェブベースツール
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	多重データ測定のフローサイトメトリー機器
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	多重データ測定のフローサイトメトリー機器
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	自動ゲーティングと分析のためのソフトウェア
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	ヒトおよびマウスのT細胞の培養と増殖のために開発された最適化された無血清培養培地