CAR T細胞の機能プロファイリングのためのビーズベース多重性フローサイトメトリーアッセイ

サマリー

本稿では、キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞由来上清液から最大12種類のサイトカインおよびエフェクター分子を定量する多重ビーズベースのフローサイトメトリーアッセイを紹介し、少量サンプルで設計されたT細胞機能の迅速かつ再現性のある解析を可能にします。

要約

CAR T細胞のプロファイリングは、異質性、複雑な免疫応答、限られたサンプルの入手可能性から課題を伴います。マルチプレックスアッセイは、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性メディエーターなど幅広いエフェクター分子を同時に検出することで機能評価を可能にします。ここでは、ヒトキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞によるエフェクター分子分泌の解析を目的としたフローサイトメトリーと互換性のあるビーズベースの多重アッセイを説明します。CAR T細胞上清液は、複数の蛍光コード集団からなるキャプチャビーズと分析物特異的抗体の混合で培養されます。これらのビーズはサンプル中の可溶性標的に結合し、ビーズ-分析物複合体を形成し、標識検出抗体を用いて検出します。このアッセイには、インターフェロン(IFN)-γ、インターロイキン(IL)-2、腫瘍壊死因子(TNF)-α、IL-6、IL-10、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびグランザイムBなどの免疫メディエーターのパネルが含まれます。あらかじめ定義された標準を用いることで、単一のサンプルから複数の分析対象物を定量的に測定することが可能です。データ取得と解析は、機器関連またはウェブベースのソフトウェアツールによる自動ゲーティング手法を用いて行うことができ、データ処理を容易にします。結論として、提示された多重アッセイはCAR Tセル機能のマルチパラメトリック解析を可能にし、研究、品質管理試験、機構的研究、機能特性評価などの文脈で応用可能です。

概要

機能的特徴付けは、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞検査において不可欠であり、これらの治療法の効力、安全性、作用機序に関する洞察を提供します。サイトカインおよび細胞毒性メディエーターの特徴を理解することは、治療効果や潜在的な副作用の評価に役立ち、安全かつ効果的な治療法の開発を可能にします。従来の単一プレックスアッセイ(酵素結合免疫吸着アッセイ)は、大量のサンプル量、長時間の処理時間、各分析対象ごとに別々のランが必要、^{個々のサンプル内で}のダイナミックレンジが限られているという制限^{があります。}これに対し、マルチプレックスビーズベースのアッセイは複数の可溶性メディエーターを同時に検出できるため、処理時間とサンプル要件を削減し、ダイナミックレンジを拡大します^1,2。この効率性と分析の深さにより、マルチプレックスアッセイはCAR T細胞の研究開発を推進するための貴重なツールとなっています^3,4,5。

本研究で提示された多重アッセイはキャプチャビーズを利用しており、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)チャネルおよびフィコエリスリン(PE)チャネルに明確な蛍光プロファイルを示し、可溶性分析物に対する特異的抗体でコーティングされています。サンプルとのインキュベーション中、これらのビーズは溶液中の標的分析物に選択的に結合します。分析物捕獲後、検出抗体が添加され、分析物特異的サンドイッチ複合体が形成されます。これらの抗体は、アロフィコシアニン(APC)(直接検出)またはビオチン(間接検出)に直接結合します。間接検出には、APC結合抗ビオチン抗体を用いた後生培養が必要です(図1)。得られた複合体は、キャプチャビーズ、分析物、検出抗体から構成され、フローサイトメトリーで分析され、分析物濃度を定量します。マルチプレックスアッセイはプレートベースの技術であり、分析対象特異的標準曲線を生成するために用いられるあらかじめ定義された標準を含み^ます。

図1:サイトカイン技術の原理とアッセイワークフロー。 このアッセイは、12個の蛍光コード化されたキャプチャビーズ集団と分析物特異的抗体を組み合わせて行われます。サンプルインキュベーション時にビーズ-分析物複合体が形成され、特異的検出抗体を用いたフローサイトメトリーで検出されます。アッセイのワークフローには、1) 分析標準物質および対象サンプルをフィルタープレート上で調製すること、2) Capture ビーズでの培養、3) ビオチン標識抗分析抗体によるサンドイッチ複合体形成の培養、4) APC標識抗ビオチン抗体での培養、5) バッファーでの再懸濁による測定、6) サンプル採取が含まれます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

本研究で述べた多重アッセイは、青色(例:488nm)を装備した標準的なフローサイトメーターと互換性があります。FITCおよびPEチャネル)および赤色レーザー(例:635 nm;APCチャンネル。フローサイトメーターは研究室、臨床現場、品質管理環境で広く利用可能であるため、この互換性により、追加の専門機器を必要とせずに実装が可能となります⁵。CAR T細胞機能検査の文脈では、このアプローチにより、一般的に利用可能な分析ワークフロー内で機能応答のマルチパラメトリック評価が可能^{となります。}このアッセイは、GM-CSF、グランザイムB、インターフェロン(IFN)-γ、インターロイキン(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、単球化学誘導タンパク質-1(MCP-1)、パーフォリン、腫瘍壊死因子(TNF)-α(ヒト細胞毒性パネル)などの主要分析物を同時に定量できることにより、CAR T細胞研究に大きな利点をもたらします。これらのメディエーターは、CAR T細胞の活性化、エフェクター機能、安全性関連のサイトカ^イン放出4,5,7,8の理解に不可欠です。

アッセイワークフローには、機器関連ソフトウェアを用いた自動ゲーティングやデータ分析、機器に依存しないウェブベースの^{分析ツールの}オプションが含まれています。これらの機能は、手動介入の頻度を減らし、CAR T細胞エフェクター分子プロファイリングデータの処理を効率化します。自動分析の利用は、データ処理の一貫性を向上させ、機能的読み取りデータのより効率的な評価を促進する可能性があります^。

本プロトコルは、CAR T細胞免疫メディエータープロファイリングのための再現可能かつ拡張可能な多重化手法を示しています。1つのサンプルで12種類の異なる分析対象を測定することで、このアプローチは機構的調査、初期段階の研究、そして同時研究において特に重要です。CAR T細胞療法の後期段階では、特に薬物放出試験のための時間敏感な品質管理(QC)環境下で、測定されるサイトカインの数を減らすことが有益である場合があります。この目的のために、提示されたパネルから1〜7個のサイトカインを組み合わせて、設計したT細胞解析のために検証可能なカスタムサイトカインアッセイを設計できます。これにより、記載されたプロトコルはCAR T^{細胞療法の}初期および後期段階における研究および品質管理の多様な応用に理想的に適^{しています。}

プロトコル

すべてのヒトサンプルは、書面によるインフォームド・コンセント取得後に健康な匿名ボランティアから採取されました。すべての手続きはÄrztekammer Nordrhein(#2020272)倫理委員会の承認を受け、必要な倫理およびバイオセーフティ規則に従って実施されました。

1. CAR T細胞の共培養

1. 関連する抗原(例:抗原提示腫瘍細胞)を2.5:1(エフェクター:標的細胞)の比率で、遺伝子操作されたヒトCAR T細胞の細胞培養を準備します。
2. 分泌されたサイトカインを一度分析するための上清液採取の1時または複数の時点を定義し、定められた時間枠(例:4、8、16、24、48時間)でのサイトカイン動態を分析します。
   注意:上清液は直接使用する場合もあれば、後で使用するために凍結保存することも可能です。

2. 標準および試料の準備

1. ペレットにバッファーまたは細胞培養培地200μLを加え、優しく混ぜて分析物標準を再構成します。試薬チューブを6本準備し、再構成した標準液を3.2 pg/mLまたは0.6 pg/mL(分析対象により異なる)まで1:5希釈系列で処理し、ブランクを準備します。
2. 例えば、共培養後16時間または24時間後にCAR T共培養上清液を収集します。オプションとして、フローサイトメトリーを用いて並行表現型解析のためにCAR T細胞を採取することも可能です。
3. サンプルを10,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清液はきれいにするか、標準的な曲線範囲に合わせて薄めてください。

3. アッセイのワークフロー

1. キャプチャービーズの混合物を渦巻きて完全に再懸浮させてください。標準または試料50μLと、希釈済みビーズ20μLを96ウェルのフィルタープレートのウェルに加えます。
2. 暗闇の中で室温で2時間、450rpmで振る。真空マニホールドまたは遠心分離機を使って200μLのバッファーでウェルを2回洗浄します。
3. バッファーに100μLの1:50の希釈済み検出試薬1を加えます。暗闇で室温で1時間、450rpmで振る。2回洗ってください。
4. バッファーで100μLの1:50の希釈済み検出試薬2を加えます。暗闇の中で室温で30分間、450rpmで振って孵化させます。一度洗ってください。
5. 取得時には、サンプルを200μLのバッファーに再懸浮します。アッセイワークフローの概要は 図1に示されています。

4. 取得とデータ分析

1. 青色レーザーと赤色レーザー(PE、FITC、APCチャネルが必要)を備えたフローサイトメーターでデータを取得してください。MACSQuantフローサイトメーターを扱う際は、完全自動化ゲートおよびデータ解析のために Expressモード テンプレートを使用してください。
2. または、FSCまたはMQDのデータファイルをウェブベースのInspectoRツールにアップロードする方法もあります。これにより、自動定量的サイトカイン測定が行われ、使用する機器に依存しないすぐにエクスポート可能な結果が得られます。
3. FITCチャネルとPEチャネル内の12種類の異なるキャプチャビーズ集団の適切な分離を確認してください。
4. 標準的な曲線を適用してサイトカイン濃度を計算し、結果をエクスポートして可視化します。
5. MACSQuantフローサイトメーターでのデータ取得を行う際は、キャプチャビーズバイアルの2Dバーコードを使用してください。これには関連する取得設定がすべて含まれています。
   1. ソフトウェアにログイン後、 MACSPlexフィルタープレート をサンプルラックとして選択し、ツールバーの バーコード ボタンをクリックして2Dコードリーダーを起動します。
   2. バイアルをリーダーに提示し、コードが点滅する光に対して最適な距離(0.5〜2.5 cm)に向いていることを確認してください。
   3. Autolabelタブでキャプチャビーズ(MPx Cyt T-NK,h)とNoLabelを割り当てます。細胞毒性T/NK細胞標準の連続希釈については、基位を定義し、設定タブでExpressモード(Type: Analysis)およびMode: MACSPlex_Standardを選択し、必要に応じて穏やかに混合します。
   4. 未知のサンプルも同様に割り当てられ、位置が定義され、オプションのグループ分けや設定タブ内のエクスプレスモード、タイプ:分析、モード:MACSPlex_Sampleの選択、オプションのサンプルIDや説明も含まれます。
   5. 実験表のラック定義が正しいか確認し、フィルタープレートウェル内の適切な液体レベルを確認し、その後測定を開始します。

結果

12種類の可溶性分析物を符号化する代表的なキャプチャビーズ集団の同定

キャプチャビーズ集団はフローサイトメーターのFITCチャネルおよびPEチャネルを用いて同定されました。IL-10、グランザイムB、MCP-1、IL-17A、パーフォリン、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-4、GM-CSFなど、個々の分析物を表す異なるビーズクラスターが明確に分離されました(図2)。各集団は独自の蛍光シグネチャーを示し、多重検出の成功と測定されたサイトカインおよびエフェクター分子の明確な分化を確認しました。

図2:代表的な多重捕獲ビーズ集団の検出。 キャプチャビーズは固有の蛍光強度を持ち、分析対象の異なる集団を区別するために利用できます。散乱図は、FITCチャネル(B1)およびPE(B2チャネル)における蛍光強度に基づく分析物質特異的信号の分離を示しています。画像はGM-CSF、グランザイムB、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、MCP-1(CCL2)、パーフォリン、TNF-αをコードする12個のキャプチャビーズ集団の代表的なプロファイルを示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

腫瘍細胞との共培養後のCAR T細胞の代表的なサイトカイン濃度プロファイル

CAR T細胞と腫瘍標的細胞の共培養後、多重アッセイのヒト細胞傷害パネルを用いてサイトカイン濃度を定量化しました(図3)。CAR T細胞はグランザイムB(49,950.2 pg/mL)、IFN-γ(48,367.8 pg/mL)、TNF-α(7,055.2 pg/mL)、GM-CSF(6,653.5 pg/mL)を高濃度分泌し、腫瘍結合に対する強力な活性化および細胞毒性効果の機能を示しています。IL-2レベルは検出上限(>10,000 pg/mL)を超えており、強い増殖シグナル伝達と一致しました。サンプルはこれ以上希釈や再測定は行われませんでした。対照的に、調節的または代替補助T細胞応答に関連するサイトカイン(IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、MCP-1など)は、低いレベルまたはほぼ検出不能なレベルで存在していました。これらの結果は、CAR T細胞が主にタイプ1(Th1/細胞毒性)免疫応答を発揮し、高い効果活性と免疫抑制性サイトカイン産生の制限を特徴としていることを示唆しています。

図3:腫瘍細胞との共培養後のCAR T細胞の代表的なサイトカインプロファイル。遺伝子操作されたキメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、JeKo-1腫瘍細胞と一晩共培養されました。細胞培養上清液は16時間の培養後に採取され、遠心分離で粒子を除去しました。希釈されたサンプルは多重アッセイのヒト細胞毒性パネルを用いて分析されました。2つの標準曲線が測定され、12種類の分析対象物すべての濃度が決定されました。フローサイトメーターのエクスプレスモードを用いた分析および分析物特異濃度の計算に代表的なデータ出力を示します。棒グラフと付随する表は、12のエフェクター分子の計算レベル(ピコグラム/ミリリットル)を示しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

抗原特異的刺激によるCAR T細胞のサイトカイン分泌動態

CAR T細胞と標的細胞が共培養された後、標的細胞が発現する(抗原⁺)または欠如する(抗原⁻)に対して、多重アッセイのヒト細胞毒性パネルを用いてサイトカイン分泌を経て時間をかけてモニタリングしました。CAR T細胞は抗原標的の認識時に迅速かつ強力なサイトカイン放出を示し、グランザイムB、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-2が8〜24時間以内に強くアップレギュレーションされ、48時間でピークレベルに達しました(図4)。このパターンは抗原結合後に強力な活性化と細胞毒性効果子機能を示します。IL-6、IL-17A、IL-21の中程度の増加も観察され、IL-4、IL-10、MCP-1、ペルフォリンは低水準またはやや高めのままでした。対照的に、抗原標的との共培養では、すべての分析対象物でサイトカイン誘導が最小限であった(図4)。これらのデータは、CAR T細胞の活性化とエフェクターサイトカイン産生が抗原認識に特異的に反応し、時間とともに強まることを示しています。

図4:抗原陽性または抗原陰性標的細胞と共培養されたCAR T細胞のエフェクター分子分泌動態。遺伝子操作されたキメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、関連するCAR T細胞抗原を発現(抗原)または欠如(抗原⁻)する標的細胞と共培養し、4、8、16、24、48時間にわたり使用しました。各時点で培養上清液を収集し、多重アッセイのヒト細胞毒性パネルを用いて分析し、時間をかけて可溶性エフェクター分析物の広範なパネルを定量化しました。12種類の分析対象物のサイトカイン動態(ピコグラム/ミリリットル)を示します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

マルチプレックスアッセイは、CAR T細胞共培養における可溶性免疫メディエーター応答のプロファイリングに用いられました。抗原陽性標的細胞と共培養されたCAR T細胞は、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、グランザイムB、IL-2の分泌増加を示し、エフェクターの活性化および細胞^{毒性機能4,5,8}と一致しました。対照群はサイトカイン産生が低く^{、試験条件下}で抗原特異的応答を識別できることを示し^ました。これらの結果は、CAR T細胞機能の評価、効力関連解析、安全性関連プロファイリング、機構的調査への応用を支持しています。

固定12分析対象パネルはCAR T免疫活性の広範な概要を提供しますが、すべての用途で分析対象の全範囲を捉えるのは実用的ではありません。CAR T細胞製品のアッセイ検証や品質管理(QC)試験などの重点的なワークフローでは、パネルを縮小したサブセット(例:IL-2、IFN-γ、TNF-α)に縮小し、機能感度を維持しつつ分析を効率化できます^1,2。

プロトコルの重要なステップには、CAR T細胞の共培養設計と適切なサンプリング条件の選択が含まれます。特に、共培養期間とエフェクター細胞数(E:T比)はサイトカインの大きさを直接決定し、アッセイ^5,6のセットアップ時に定義すべきです。さらに、試料希釈は分析対象物濃度がアッセイの^{ダイナミックレンジ内に}収まるよう調整する必要があります^。したがって、トラブルシューティングは標準曲線の性能検証と、信号が定量的範囲外に出た場合の共培養条件や希釈係数の調整に焦点を当てるべきです。^1,2。

従来の単一プレックスELISAと比較して、フローサイトメトリーベースのマルチプレックスプラットフォームは、最小限のサンプル量から高密度・多分析データセットを生成します。単一の試料内で複数の分析対象を同時に測定できることで、マルチプレクシングは試薬消費量を削減し、試料スループットを向上させ、複数の単一プレックス^アッセイを行うよりもアッセイ時間の短縮^{が可能です。}自動化された取得および標準化された解析オプションは、ユーザー依存の変動性を低減し、実験的または^{製造環境間}での再現性とスケーラビリティを支援する可能性があります^5,8。標準的なELISA検出感度は通常16から2000 pg/mLの範囲です(高感度キットではさらに低くなることもあります)⁷。本研究で提示されたプラットフォーム内では、検出可能な濃度は最も感度の高い分析対象で0.05 pg/mL、本質的に感度が低い分析対象では約93.8 pg/mLに及びます。内部評価では、測定された分析物の74%以上が5 pg/mL未満の検出限界を示し、38%が1 pg/mL未満で検出可能であることが示され、システム全体の感度が強調されました。多重性感度はサイトカインによって異なるため、潜在的なエピトープ競合は重要な考慮事項です。このような干渉を最小限に抑えるため、アッセイは各分析対象物の捕捉と検出に重なりのないエピトープを用い、競争関連バイアスを低減し、多重化条件下での測定信頼性を向上させます。

マルチプレックスアッセイの性能は、アッセイの感度や生物学的文脈によって分析対象物ごとに異なり、特定の条件下では分析物濃度が検出上限に近づくことがあるため、アッセイ設定時に評価すべきです。逆に、本研究のMCP-1やIL-4のような分析対象物は実験条件によって検出不能な場合があります。さらに、サンプル取り扱いなどの事前分析要因もサイトカイン測定に影響を与えることがあり、比較可能性を確保するために一貫した処理条件を維持する必要があります。

全体として、この多重性アプローチはCAR T細胞機能の効率的かつ定量的な特性評価を可能にします。既存の多くの多重サイトカイン検出プラットフォームと比較して、このアッセイは標準的なフローサイトメーターに対応しており、機器関連のソフトウェアツールを含んで、データの取得と解析を効率化します。マルチプレックスサイトカイン検出は他の免疫環境でも用いられてきましたが、本研究は標準化されたワークフロー内でのCAR T細胞機能プロファイリングへの応用を示しています。ビーズベースのフォーマットにより、複数の分析対象を同時に検出でき、シングルプレックス法に比べて高いスループットを実現します。潜在的な応用例としては、CARバインダー評価、ベクター最適化、プロセス開発などの薬剤製品の機能評価が含まれます。このアッセイのスケーラビリティおよび自動分析機能は、CAR T細胞の挙動と機能を理解するためのポテンシー試験、安全性プロファイリング、機構学的研究も^{サポートします。}

サイトカイン分泌プロファイルは、CAR T細胞の活性化や機能的効力に関する貴重な洞察を提供しますが、患者の治療効果を決定する複雑な生物学的特徴を完全に再現することはできません。腫瘍微小環境、抗原密度、免疫調節、生体内持続率などの要因が、制御されたアッセイ^6,8,10で測定可能な範囲を超えてCAR T細胞のパフォーマンスに影響を与えます。それでも、マルチプレックスサイトカインプロファイリングのような堅牢かつ標準化された機能的アッセイの確立は、医薬品の機能的特性評価に向けた重要な一歩となります^3,4。サイトカインパターンはCAR T細胞活性を示すだけでなく、サイトカイン放出症候群(CRS)や免疫効果細胞関連神経毒性症候群(ICANS^)などの毒性現象とも密接に関連しています^3,6,7。現在、測定方法や報告のばらつきにより試験間比較が制限されており、標準化され再現性のある免疫メディエータープロファイリングの必要性が浮き彫りになっています^。分析技術と臨床データセットの進歩が続く中、最終的な目標は治療の可能性と患者の安全性の両方を確実に反映する予測分泌シグネチャーを定義し、前臨床の効力アッセイと臨床効果のギャップを埋めることです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	フローサイトメトリー用のビードベースのマルチプレックスサイトカインアッセイ
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	MACSPlexデータの自動ゲーティングおよび分析のためのウェブベースツール
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	マルチプレックスデータ測定のフローサイトメトリー機器
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	マルチプレックスデータ測定のフローサイトメトリー機器
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	自動ゲーティングと分析のためのソフトウェア
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	ヒトおよびマウスのT細胞の培養と増殖のために開発された最適化された無血清培養液