形状の形態計測解析:ゼブラフィッシュにおける頭蓋顔面形状定量化のための解析ソフトウェアツールボックス

Summary

本研究は、ゼブラフィッシュ幼生の顔面構造変化を測定するために、無料ソフトウェア(tpsDigs2、MorphoJ、PAST)を用いて頭蓋顔面軟骨の形状を定量化するプロトコルを説明しています。

Abstract

胎児アルコールスペクトラム障害(FASD)は、出生前のエタノール曝露によって引き起こされるさまざまな身体的、認知的、行動的障害を特徴とし、顔の骨格に影響を与えるものも含まれます。エタノール感受性遺伝子座はFASDの高い変異性に寄与しており、顔の形状解析を複雑にしています。私たちは以前に、ゼブラフィッシュの遺伝子-エタノール相互作用からこれらの顔の形状変化を解析できることを示しました。ゼブラフィッシュは、いくつかの理由からこの変異を分析するのに理想的なモデルです。(i) 遺伝子の70%はヒトとゼブラフィッシュ間の直系同胞である;(ii) 外部受精により、研究者はエタノール処理のタイミングと投与量を制御することが可能です。(iii) 顔の骨格構造は脊椎動物によって保存されている;(iv) 半透明の幼虫は、発生過程における頭蓋顔面骨格構造の変化を直接観察することを可能にします。しかし、頭蓋顔面骨格の形状を分析することは、単純な線形測定では全体的な形状変化を捉えきれないため、完全に評価するのは難しい場合があります。さらに、頭部のサイズの変化はデータの解釈を複雑にすることがあります。これに対処するため、私たちは形態計測法を採用し、フリーウェアソフトウェア、tpsDigs2、MorphoJ、PASTを用いた主成分解析を通じて顔の形状全体を解析しました。このソフトウェアの組み合わせにより、顔の全体的な形態をペアワイズで比較することが可能です。ここでは、これらのプログラムを用いてエタノール処理されたゼブラフィッシュ変異株の顔形の分析とアプローチを概説し、一連の補完的な多変量統計解析を実施します。

Introduction

胎児アルコールスペクトラム障害(FASD)は、行動的、神経学的^、身体的障害を含む幅広い発達障害を特徴とします^1,2。これらの身体的欠損には、顎の形成不全^3,4,5,6などの頭蓋顔面欠損が含まれます。エタノール曝露のタイミングと用量がFASDの複雑な病因に寄与しますが、遺伝的寄与がFASDの病因に重要な役割を果たします。^FASDの病因6,7,8,9,10,11,12。これらの要因の組み合わせにより、人間の集団における顔の欠陥の研究は困難で....

Protocol

この手技に用いられたすべてのゼブラフィッシュ幼虫は、ルイビル大学が承認したIACUCの確立プロトコルに従って飼育・繁殖^{されました。}

注:本研究ではゼブラフィッシュ系 bmp7a^ty68a24 および野生型兄弟(いずれもAB系)を用い、成魚は28.5°Cに維持し、14/10時間の明暗サイクルで維持しました。望ましい実験結果に応じた適切な線を使いましょう。逆浸透圧で滅菌された水を使いましょう。生物学的変数としての性別は研究対象の発生段階には当てはまらず、ゼブラフィッシュでは受精(dpf)²⁵後、すべての解析の結果、性別が初めて検出されます。

1. エタノール処理

1. ヘテロ接合体交配から卵を採取し^、胚を形態学的に段階的に段階付けします。
2. 胚を100個ずつのサンプルグループに分け、28.5°Cで望む発生時点に育てます。胚培地(EM)^10,18。....

Results

ゼブラフィッシュのエタノール誘発的な顔形変化を特定するために、私たちは無料で利用可能なソフトウェアアプリケーションを組み合わせて顔骨格の形態学的データを生成・定量化しました。bmp7aヘテロ接合体成体保因魚の胚を生成し、6〜24 hpfのエタノール処理を行いました。これらの交配から得られた幼虫は5 dpfに固定され、顔面軟骨はアルシアンブルーで染色されました。各遺伝子型および処理群の幼虫ごとに内臓頭蓋の画像が撮影されました(図1A-D)。内臓頭蓋骨の軟骨は代表的な画像でラベル付けされています(図1E)。tpsDigs2を使って各画像にランドマークを配置し保存しました(代表画像、図1E')。この「ランドマークラベル付き」画像のデータセットはMorphoJにインポートされました。形状の変動に基づいて個体の分布を可.......

Discussion

FASDは、顎の低形成などの頭蓋顔面障害を含む幅広い発達障害を特徴とします。ゼブラフィッシュは、人間に遺伝的に保存されていること、高い繁殖率、半透明の幼生、外部受精によりFASDの強力なモデルです。ゼブラフィッシュは数十年にわたり頭蓋顔面骨格の形成とエタノールが発生に与える影響を研究するために用いられてきました。6,12,13,15,18,28,29。より最近の研究では、エタノールが顔の発達に与える影響が探求されています。この研究の鍵は顔の形状の適切な分析です。本論文では、FASDにおける顎の形状の有意な形態変.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
tpsUtil, tpsDig2, MorphoJ	https://sbmorphometrics.org		フリーウェアソフトウェア - ダウンロードには管理者権限が必要な場合があります
過去	https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/		フリーウェアソフトウェア - ダウンロードには管理者権限が必要な場合があります
複合ブライトフィールド顕微鏡	オリンポス	BX53