方法論記事

CRISPRシステム用の単一ガイドRNA DNAテンプレートの迅速合成のためのワンステップ重なりPCR法

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DOI：

10.3791/70369

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2026年4月24日

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1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

この記事について

サマリー

4つのプライマーを用いた1段階の重なりPCR法により、 in vitro sgRNA転写のためのDNAテンプレートの迅速かつ低コストの生成が可能となります。最適化されたプライマー比率(50:5:1:50)により、5時間以内に高品質なsgRNAが生成され、in vitro アッセイおよびHEK293T細胞での編集活動による機能的検証が実証されています。

要約

CRISPR–Casシステムはゲノム編集に革命をもたらしました。しかし、従来の単一ガイドRNA(sgRNA)生成方法は、時間のかかるクローニングステップや高価な市販合成キットを伴います。in vitro sgRNA転写のためのDNAテンプレートの迅速かつコスト効率の高い合成のために、最適化された一段階重複PCR戦略が提案されています。T7プロモーター、標的特異的ガイド配列、sgRNAスキャフォールドにまたがる4つの部分的に重なったプライマーを用いて、クローニングなしで全長テンプレートを単一のPCR反応で組み立てます。体系的な実験最適化により、最適なプライマー比率(AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:50:50:50:50)が確立され、非特異的副産物を最小限に抑えつつ全長生成物の収量を最大化することがアガロースゲル電気泳動で確認されました。この手法は黄色 ブドウ球菌 Cas9(saCas9)sgRNAのテンプレート生成に成功裏に拡張され、 Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)を超えたクロスシステム応用性を示しました。sgRNAの直接化学合成は高純度、安定性向上のための化学修飾、オフターゲット効果の低減などの利点を提供しますが、高スループット用途や多数のsgRNAを必要とする大規模スクリーニングには依然として高コストです。 in vitro 切断アッセイにより、この方法で生成されたガイドRNA は従来のプラス ミド基クローニングと同等の編集効率を達成することが示されました。さらに、これらのsgRNAで組み立てられ、電気孔 によって HEK293T細胞に送付されたリボ核タンパク質複合体は、標的遺伝子座で検出可能なインデル形成をもたらし、 in vivoでの機能性を裏付けました。コスト分析によれば、この方法は市販の合成キットと比べてテンプレート準備コストを大幅に削減し、数日から数時間に短縮することで、遺伝子研究に従事する研究室にとってアクセスしやすくスケーラブルなアプローチを提供します。

概要

CRISPR–Casシステムは、細菌や古細菌の適応免疫機構に由来し、多様な生物に対する正確なゲノム編集を可能にすることで遺伝子工学に革命をもたらしました(1,2)。重要な構成要素は単一誘導RNA(sgRNA)であり、これはCasヌクレアーゼを特定のゲノム遺伝子座に誘導するキメラRNAです。そのモジュール式設計により、約20ヌクレオチドからなるプロトスペーサー配列の修飾による再ターゲティングが可能です。SpCas9以外にも、独自の特性を持つ他のCasヌクレアーゼも広く採用されています。黄色ブドウ球菌Cas9(saCas9)はより小型で、アデノ関連ウイルス(AAV)の送達を促進し、それによって送達の選択肢を拡大します4。各システムには特定のガイドRNAアーキテクチャが必要であり、多用途な合成法が非常に望ましい3.

機能的ガイドRNAを生成する従来の方法には、プラスミドベースのクローニング、市販のsgRNA合成キット、またはsgRNA5,6の直接商業合成などがあります。プラスミドベースのクローニングは、制限消化、リゲーション、形質転換、コロニースクリーニングといった複数の労力集約的なステップを要し、通常48時間以上かかります。市販のsgRNAキットは効率的なワークフロー(<5時間)を提供しますが、高スループット用途では依然として高価で、通常1回あたり35〜45ドルかかります。sgRNAの直接化学合成は、高純度、安定性向上のための化学修飾、オフターゲット効果の低減などの利点を提供します7;しかし、高スループット用途や数百個のsgRNAを必要とする大規模スクリーニングでは、通常1件あたり200〜280ドルと非常に高価です。

これに対し、ここで述べる1ステップの重なりPCR法は、標準プライマーを用いてテンプレート合成を5時間以内に完了し、sgRNAあたり約5〜8ドルのコストで、時間と材料コストの両面で大幅に削減されます。さらに、この方法で生成されるsgRNAは、in vitro 切断アッセイによって確認されたように、プラスミドベースのクローニングで得られる編集効率を達成します。これらのアプローチの比較は 図1に示されています。

オーバーラップエクステンションPCR(OE-PCR)は、DNA断片の迅速かつリガーゼに依存しない戦略を提供します8。この手法は重なりプライマーを用いたsgRNAテンプレート合成にも応用されています。4つの部分的に重なったプライマーを用いたワンステップ反応では競合結合が起こります。外側プライマー(AF1およびTracr-R)が増幅境界を定義し、内側プライマー(AF2およびAF3)は両端から中心に向かって秩序正しく伸長させるために希釈する必要があります。この理論的枠組みにもかかわらず、組み立て効率に影響を与える重要なパラメータである最適プライマー比は体系的に調査されていません。さらに、このようなOE-PCR手法が異なるCRISPRシステム全体で広く適用できるかどうかも十分に解明されていません。

これらの制約に対処するため、sgRNAテンプレート合成のための一段階重複PCR法の最適化と検証を目的とした研究が設計されました。最適なプライマー比率は構造化された実験デザインによって確立され、アガロースゲル電気泳動を用いて適切なサイズの生成物が得られる条件を特定しました。最適化後、この手法の汎用性は2つの広く使われているCRISPRシステム(SpCas9およびsaCas9)で評価され、両テンプレートの増幅に成功しました。 in vitro 切断アッセイを用いた機能検証により、この方法で生成されたsgRNAはプラスミドベースのクローニング と 同等の効率を達成することが示されました。

細胞内での機能性をさらに評価するため、SpCas9 sgRNAはCas9タンパク質と複合体化されリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成し、電気穿孔 によって HEK293T細胞に届けられました。内因性遺伝子座でのゲノム編集はT7エンドヌクレアーゼI(T7EI)アッセイを用いて評価され、アガロースゲルの切断パターンは 生体内で検出可能なインデル形成を示しています。これらの結果は、この方法が高品質で機能的なsgRNAテンプレートを確実に生成できることを示しています。以下のプロトコルは、代表例としてSpCas9を用いた詳細な手順を説明し、他のCas ヌクレアーゼへの適応用プライマーテンプレートを提供します。

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プロトコル

市販のHEK293T細胞株(ATCC CRL-3216)の使用は、陳州市第一人民病院南華大学倫理委員会のヒト由来細胞株使用ガイドラインに従って実施されました。使用された試薬、ソフトウェア、機器は 材料表に記載されています。

1. sgRNA標的配列の設計

  1. CRISPRscan、CHOPCHOP、またはBroad Institute CRISPickなどの確立されたオンラインツールを用いてターゲットゲノム領域を特定します3.
  2. https://chopchop.cbu.uib.no/ 3.9のCHOPCHOPウェブサーバーにアクセスしてください。
  3. ターゲット遺伝子情報を入力し、適切なCRISPR/Casシステム(例:CRISPR/Cas9用のEGFR)を選択します(図2A)。
  4. 出力表をレビューし、順位、ターゲット配列、ゲノム位置、鎖、GC含有量(%)、自己補完性、予測オフターゲット部位(MM0、MM1、MM2、MM3)、および効率スコア(図2B)を含みます。
  5. オンターゲット効率が高く、予測オフターゲット活性が低いガイドRNA配列を選択します。
  6. プライマー設計のために最終的なsgRNA標的配列を記録します(例:EGFR標的配列:「CTTAATTCCTTGATAGCGACGG」)(図2B)。

2. 4つの重なり合うプライマーの合成と調製

  1. 4つのオリゴヌクレオチドプライマー(AF1、AF2、AF3、Tracr-R)を設計し、重なり合う領域を以下のように配置します(図3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACACTCACTCATAG(1999年3000年15月11日:19999年1999年3月1日30000年3月
    [ターゲットシーケンス]GTTTTAGAGCTAGAAAAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGTGTCT–3′
    トラッカー-R:5′–AAAAAAAACCCACCACTCGGTGCCAC–3′
    注意:AF1プライマーの[ターゲットシーケンス]を ステップ1.6で得られた配列に置き換えてください。
  2. 標準的な脱塩精製を用いて25 nmolスケールのプライマーを合成します。
  3. 乾燥プライマーをヌクレアーゼフリー水に100μMのストック濃度で再懸濁します。遠心分離機で室温で5000 × g で1分間加熱します。

3. プライマー濃度最適化およびsgRNAテンプレート合成のための一段階重なりPCR法

  1. 表1に従ってAF2およびAF3濃度を変えたプライマー混合物を準備 します。 AF1およびTracr-Rは10μMに維持してください。
  2. 表2に従って0.2mLのヌクレアーゼフリーチューブでPCR反応を準備 します。 高精度DNAポリメラーゼを使用します。
  3. ピペットで5回優しく混ぜます。渦を巻かないでください。遠心分離機で 5000 × g で1分間加熱します。
  4. 表3に記載されたサイクル条件でPCRを実施します。

4. 電気泳動とDNAテンプレートの回収

  1. 2%アガロースゲルを100 mLの1×TAEバッファーに溶かして2%アガロースゲルを準備します。50〜60°Cまで冷却し、5 μLの核酸染色を加えてゲルを鋳造します。
  2. ゲルを室温で30分間固めます。
  3. 10 μL PCR産物を6×ローディングバッファー2 μLと混合してロードします。100 bpのDNAラダーも含めます。
  4. 100Vで30〜40分間電気泳動を行います。
  5. 紫外線照射下でイメージしてください。条件9(AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:50:5:1:50)が単一の~120 bpバンドを生成することを確認してください(図4A)。
  6. 最適化されたプライマー濃度を使用:AF1 10 μM、AF2 1 μM、AF3 0.2 μM、Tracr-R 10 μM。
  7. 無菌メスで標的帯を切除してください。紫外線曝露は≤30秒以内に制限してください。
    注意: ジェルスライスは−20°Cで最大1週間保存するか、すぐに保存してください。

5. DNAテンプレートの精製

  1. メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。10。
  2. 20〜30μLの予備加温(60°C)ヌクレアーゼフリー水でDNAを溶出します。
  3. DNA濃度を測定してください。典型的な収量:15–50 ng/μL;A260/A280:1.8–2.0。
    注意:精製DNAは−20°Cで最大1年間保存してください。

6. sgRNAの in vitro 転写および精製

  1. T7 RNA合成キットを用いて転写反応を組み立てます(表4)。氷の上で準備します。11。
    注意:RNaseフリーの材料を使用し、すべての表面を除染してください。
  2. 37°Cで16時間孵卵します。
  3. 1 μL DNase Iを加え、37°Cで15分間培養します。
  4. RNAクリーンアップキットを使ってsgRNAを精製する12.
  5. 30〜50μLのヌクレアーゼフリー水で溶出します。
  6. sgRNAを定量化してください。期待収率:700–900 ng/μL;A260/A280:1.9–2.1。
    注:sgRNAは−80°Cで最大1年間保存してください。

7. sgRNA活性を検証するための in vitro 切断アッセイ

  1. 標的DNAを準備し、精製する。濃度を60 ng/μLに調整する。
  2. 切断反応を組み立て(表5)、DNAなしで25°Cで30分間プレインキュベート。陰性対照を含めます。
  3. ターゲットDNAを1μL追加します。
  4. 37°Cで2時間培養します。
  5. 反応を止めるために6×ローディングバッファー4μLを加えます。
  6. 製品を2%アガロースゲルで100Vで30〜40分間投与します。
  7. 紫外線の下で視覚化します。切断を確認し(例:617 bp → 414 bp + 203 bp)(図4C)。

8. sgRNA誘導Cas9編集の細胞内検証

  1. Cas9タンパク質とsgRNAを1:2モル比で混合してリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体を準備します。Cas9 10 μL (4 mg/mL)、280 μL sgRNA(60 ng/μL)、200 μL DMEMを混合します。15分間インキュベーションします。
  2. 細胞HEK293T~80%の合流率まで培養します。採取し、サンプルごとに3×10個6 個の細胞に調整します。
  3. RNP複合体と細胞を組み合わせ、室温で10分間培養します。
  4. 2mmの電気穿孔キュベットに移します。115 Vで4 ms、1パルス(575 V/cm)で電気分孔処理を行います。すぐに10 mLの全培地を加え、6ウェルプレートに移します。
  5. 37°Cで5%のCO2 を48時間培養します。
  6. 処理済みおよび対照細胞からゲノムDNAを抽出する。濃度を測定する。
    注意:DNAは−20°Cで最大6ヶ月間保存してください。
  7. PCRによって標的遺伝子座を増幅します(表6 および 表7)。
    注:EGFRの予想製品サイズ:617 bp。
  8. 2%アガロースゲルでPCR産物を検証してください。正しいバンドを精製し、DNAを定量します。
  9. ヘテロデュプレックス形成を行います(表8 および 表9)。
  10. 1 μL T7エンドヌクレアーゼIを加え、37°Cで15分間培養します。85°Cで10分間不活化します。
  11. ローディングバッファーを加え、2%アガロースゲルで走らせます。
  12. 紫外線の下で視覚化してください。インデル形成(617塩基基/→414塩基/塩基+203塩基)を確認します(図4D)。

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結果

ワンステップの重なりPCRプロトコルの成功裏の適用により、アガロースゲル電気泳動で解析した際に期待されるサイズの単一の鋭いDNAバンドが得られます。

特に内側プライマー(AF2およびAF3)が過剰に高いプライマー比率は、期待される生成物よりも大きな帯が現れ、非特異的増幅やプライマー-二量体形成を示し、未完全な組み立て中間体に対応する薄い帯も見られます(図4A、条件1、4、7、10)。これらの最適でない条件はネガティブコントロールとして機能し、最適化条件との比較を可能にします(図4A、条件9)。

最適化されたプライマー比(AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:50:1:50、それぞれ10μM、1μM、0.2μM、10μMの作業濃度に対応)を用いて、組み立てられたsgRNA DNAテンプレートはSpCas9に対して約120bpの独立し...

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ディスカッション

1段階の重複PCR戦略 による sgRNA DNAテンプレートの合成を効率的かつ経済的に行うプロトコルを記述します。この方法はプラスミド構築やクローニングの必要性を排除し、テンプレート準備時間を数日から約5時間に短縮します。このアプローチの重要な側面はプライマー比の体系的最適化であり、50:5:1:50(AF1:AF2:AF3:Tracr-R)と判断され、それぞれ10μM、1μM、0.2μM、10μMの作業濃度に対応します。この比率は非特異的副産物を最小限に抑え、全長産物の収率を最大化し、下流 のin vitro 転写および遺伝子編集アプリケーションを支援します。この方法で生成されたsgRNAの機能的検証は、 in vitro 切断アッセイおよび哺乳類細胞の文脈でHEK293T細胞を用いたことで実証されました。

組み立てプロセスはPCR中の競合プライマー結合に基づいています。テンプレート境界を定義する外側プライマー(AF1およびTracr-R)は増幅を促進するた...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究は湖南省衛生委員会健康研究プロジェクト(助成金番号W20243264)、湖南省自然科学基金(助成金番号2023JJ50368)、湖南省教育局重点研究プロジェクト(助成金番号24A0607)、および郴州第一人民病院の革新的チームプロジェクト(助成金番号CX202103)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 bp DNA LadderTIANGENMD109電気泳動用DNAサイズマーカー
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MPCR増幅試薬
50 bp DNA LadderTIANGENMD108小さな断片用DNAサイズマーカー
6DNA loading bufferTIANGEN1109565電気泳動用サンプルローディングバッファー
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219アガロースゲルからのDNA精製
Agarose I Thermo Scientific 17850アガロースゲル調製
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicsgRNA設計ツール
CentrifugeHENGNUO2-16Rサンプル遠心
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023A細胞培養補足
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682TAEバッファー溶液調製試薬
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/sgRNA設計ツール
CO2 incubatorThermo Scientific51032874哺乳類細胞培養インキュベーション
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/sgRNA設計ツール
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500細胞培養培地
dsDNaseThermo Scientific EN0771転写後のDNAテンプレート除去
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830細胞の電気穿孔
EDTA Na2BioSharpBS108TAEバッファー溶液調製試薬
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8温度制御インキュベーション
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BNアガロースゲル電気泳動
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258ゲル可視化およびイメージング
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5ゲノム編集用Cas9ヌクレアーゼ
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304ゲノムDNAの分離
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040SsgRNAのin vitro転写
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834PCR増幅
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000c核酸定量
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211アガロースゲルにおけるDNA可視化
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578高忠実度のPCR増幅
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptsgRNAテンプレート組立用オリゴヌクレオチド
Tris-baseBioSharpBS083TAEバッファー溶液調製試薬
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01RNA精製

参考文献

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