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方法論記事

冠動脈バイパス移植片患者の冠動脈内動脈摘出組織からの単核分離

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DOI：

10.3791/70382

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2026年4月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology, Gujarat Biotechnology University, 2U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre

この記事について

サマリー

冠動脈内膜摘出術の組織サンプルは、最適化された解離プロトコルを用いて単核を分離するために処理されました。分離された核の完全性は、膜の完全性を評価するトリパンブルー除去染色、核形態を確認するためのDAPIベースの共焦点顕微鏡、核収率と純度を定量化するフローサイトメトリーという3つの補完的なアプローチによって検証されました。

要約

動脈硬化は、動脈壁にプラークが蓄積する慢性的で進行性の炎症状態です。プラーク形成の進行に伴い、特定の病変は不安定になり、ハイリスクプラークと呼ばれるものがあり、心筋梗塞(MI)を引き起こす可能性があります。動脈硬化性プラークは、平滑筋細胞、内皮細胞、免疫細胞、脂肪細胞、壊死細胞から成り立ち、いずれかがプラーク破裂を引き起こす可能性があります。動脈硬化性プラーク内の細胞異質性を研究することは、プラーク不安定性のメカニズムをよりよく理解するために重要です。冠動脈バイパス手術(CABG)を受けた患者から採取されたヒト冠動脈内膜摘出組織から核を分離し検証するための容易に再現可能なプロトコルを提示します。すべての組織は、細胞の完全性を保つため、ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地の湿氷上に保管されています。組織サンプルは細かく刻み、微小乳棒で優しく破壊され、細胞を溶除して核を放出します。分離された核は、トリパンブルー排除法を用いて複合倒立顕微鏡で完全性と収率を評価します。DAPI染色は共焦点顕微鏡による完全な核の可視化を可能にし、フローサイトメトリーは蛍光に基づく定量化を行い、核分離収率を評価し核集団の検証を行います。従来の単細胞解離による分離方法とは異なり、核分離は細胞ストレスを軽減し、ネイティブの転写体環境を維持することで遺伝子発現の変化を防ぎます。この方法で得られる高品質な核前製は、単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)などの後続応用にも適合しています。

概要

動脈硬化性心血管疾患(ASCVD)は世界で最も多くの死因と障害の原因であり、大きな治療法の進歩にもかかわらず、その負担は減っていません1.動脈硬化は動脈壁の慢性炎症性疾患であり、多様な細胞集団間の複雑かつ動的な相互作用によって駆動され、初期の亜臨床疾患から生活を大きく変える心血管(CV)イベントへの静かな進行を共同で促します2。

中大動脈では、マクロファージ内にコレステロール沈着が蓄積することが動脈硬化の特徴です。動脈硬化性プラークは脂肪酸、コレステロール、炎症細胞、カルシウム、フィブリン、平滑筋細胞、内皮細胞、そして内皮下の細胞破片で構成されています。動脈硬化性プラークは低リスクと高リスクの2種類に分類されます。ハイリスクプラークは、プラーク侵食や破裂などのメカニズムを通じて、その後の心血管イベントを引き起こす傾向によって識別されます。

高リスクプラークの特徴には、大きな脂質コア、複数の炎症細胞、少ない平滑筋細胞、薄い繊維状キャップ、微小石灰化、プラーク内出血、腫瘍血管、壊死したコア6が含まれます。高リスクプラークの検出は、冠動脈断層撮影血管造影(CCTA)と光コヒーレンス断層撮影(OCT)といった非侵襲的画像診断法を用いて臨床的に行われます7,8。心血管画像技術の多くの進歩にもかかわらず、心筋梗塞(MI)を引き起こす動脈硬化性プラークの破裂を予測することは依然として困難であり、臨床現場で必ずしも有用とは限りません。

数十年にわたる研究にもかかわらず、高リスクプラークの表現型を特異的に識別できる信頼できる循環バイオマーカーが依然として不足しており、動脈硬化の臨床管理に重大なギャップが残っています。これは、これらのプラークをより基本的な生物学レベルで特徴づける分子戦略の必要性を強調しています 7,10。この文脈で、RNAベースのマーカーはプラーク微小環境内で起こる複雑な転写活性を捉えることができるため、大きな注目を集めています11。最近の単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)の進展は特に強力であり、動脈硬化プラーク内の個々の細胞をプロファイリングし、プラーク脆弱性の基盤となる異なる細胞集団、遺伝子発現パターン、分子経路を明らかにする前例のない解像度を提供しています12,13。これらの進展にもかかわらず、動脈硬化の発生に関与するさまざまな細胞タイプの調節過程、相互作用、機能的重要性についてはほとんど知られていません14。

動脈硬化の負担が重度かつ広がっている場合、外科的再血行術が決定的な治療戦略となります。冠動脈内膜摘出術(CE)は、冠動脈バイパス移植(CABG)手術の外科的補助療法であり、広まる病変した冠動脈から動脈硬化性プラークを機械的に除去し、バイパス移植を可能にし、完全な心筋再血行化を達成する手術です15,16。動脈硬化性プラークや動脈内膜切除標本は、壊死組織、脂質沈着、フィブリン、石灰化が豊富であるため、特に扱いが難しいです。これらの組織を分解して分析すると、フィルターやマイクロ流体システムを詰まらせる大量の破片が発生し、生存可能な単細胞の分離が非常に困難になります17,18。実際、ある頸動脈プラークの研究では、組織処理後の生存細胞は全粒子の1%未満しか占めていないことが判明しました。残りは単なるプレートの破片18でした。

さらにこの課題を複雑にしているのは、動脈硬化性プラークが慢性的な代謝ストレスおよび酸化ストレス状態にあり、細胞がアポトーシスや老化、その他の変性過程を経験することで細胞膜がますます脆くなり、破壊されやすくなっているため、生存可能な単細胞の単離が非常に困難になっていることです(18,19,20.scRNA-seqのサンプル準備に必要な機械的および酵素的消化は、すでに損なわれているこれらの細胞を損傷し、生存率をさらに低下させ、細胞捕捉率の低下につながります。この過程は脆弱または希少な細胞集団を選択的に失われる傾向があり、これによりトランスクリプトミックデータや最終結果に表される細胞タイプに大きなバイアスが生じます。この問題は、石灰化や重度に病変したプラークではさらに顕著になり、組織を分解するために必要な過酷な処理条件が細胞の生存能力にさらなるダメージを与える18,21,22。

対照的に、核はこれらの不利な条件下でも構造的に完全な状態を保っています。これは主に核膜によるもので、核ラミン(ラミンA/CおよびラミンB)によって強化された二重脂質二重層であり、機械的な剛性と、原質膜を容易に破壊する浸透圧的、酵素的、物理的応力に対する抵抗性を提供します。核層は周囲の細胞質が著しく損なわれても核形態を保持します26。これにより、単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)は、動脈硬化組織のプロファイリングにおいて単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)よりも実用的かつ信頼性の高い代替手段となっています。snRNA-seqは、細胞全体ではなく完全な核から転写情報を捉えることで、細胞の生存率の低下や高堆積物含有率による制限を回避し、プラーク微小環境のより正確かつ包括的なトランスクリプトムプロファイリングを可能にします18。

したがって、本研究では冠動脈内膜摘出組織向けに特別に開発された最適化された核分離プロトコルを提示し、非イオン性洗剤ベースの溶解と組織石灰化の程度に基づく経験的調整された溶解時間を取り入れ、構造的およびRNAの完全性を保有し、下流のsnRNA-seq解析に適した高品質な核を一貫して得られるよう努めます。

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プロトコル

本研究は、U.N.メータ心臓病研究所・研究センター人間倫理委員会(EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024)およびグジャラート・バイオテクノロジー大学(GBU_IHEC/2023/006)の承認とガイドラインに従って実施されました。サンプル採取前に全参加者からインフォームド・コンセントが取得されました。冠動脈バイパス手術と冠動脈内膜摘出術を受けている患者が本研究に選ばれました。外科的摘出後、内膜摘出組織は直ちに血清フリーのRPMI培地に置かれ、4°Cで維持され、約12時間以内に冷凍保存容器で検査室へ運ばれました。以下のプロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 材料表 をご参照ください。

1. 原子核の分離

注意:すべての手順は氷上で行い、滅菌素材を使用してください。すべてのバッファーは新鮮に準備してください。

  1. 血痕や血片を除去するために、血清フリーのRPMI培地で組織を1〜2回洗いましょう。滅菌鉗子を使って組織を無菌ペトリ皿に移し、重量を記録します。
  2. 手術用刃(No. 10)を使い、組織を約1 mm3 の小さな細かい塊に刻みます。
  3. 10 mM トリスHCl、pH 7.4、10 mM NaCl、3 mM MgCl2(各成分ごとに1 Mのストック溶液を使用)、0.1%(v/v)のNonidet P-40をヌクレアーゼフリー水に混合して1 mLの溶解バッファーを準備します。成分を次の順番に添加します:まずヌクレアーゼフリー水を、最後にトリスHCl、NaCl、MgCl₂、NP-40を加えて泡立ちを防ぎます。
    注意:溶解バッファーは使用当日に新鮮な状態で準備し、常に氷の上で冷やして保管してください。凍らせないでください。
  4. 5mLのマイクロ遠心分離機チューブに冷却した1 mLの溶解緩衝液を組織に加えます。
  5. 微小乳棒を使って氷の上で組織を溶かし、優しく一定の力を加え、微小乳棒を時計回りと反時計回りに交互に回します。約30分間溶解を続け、サンプルが冷たい状態を保つようにします。
    注意:組織を濁るまで溶けさせてください。1000μLのチップを使ってピペッティングで優しく混ぜます。
  6. 溶液を100μmの孔径ストレーナーで15mLの遠心分離機管に濾過し、破片や組織の塊を除去します。
    注意:ろ過液は、ストレーナーに目に見えるゴミが残っているように見えます。
  7. スイングバケットローターを使って、500 x g の4°Cで5分間遠心分離します。
    注意:チューブの底には見えるペレットが形成されるべきです。
  8. ペレットを乱さずに通常のピペットの先端で上清液を除去します。
  9. 1Xのドゥルベッコリン酸緩衝塩水(DPBS)に1%の牛血清アルブミン(BSA)(10%のストック溶液を使用)、0.2 U/μL RNase阻害剤(20 U/μLのストック溶液使用)を1Xのドゥルベッコリン酸バッファー(DPBS)に混合して核ウォッシュおよび再懸濁バッファーを準備します。成分を次の順に添加します:まずDPBS、次にBSA、最後にRNase阻害剤。
    注意:バッファーは使用当日に新鮮に準備し、常に氷の上で冷やして保管してください。凍らせないでください。
  10. ペレットを核洗浄液と再懸濁バッファーに再懸浮させます。使用前にバッファーを氷で冷やしてください。
  11. 5μLトリパンブルーで染色し、ヘモサイトメーターで計数することで溶解効率と細胞生存率を評価します。
    注:生存可能な細胞がまだ存在する場合は、500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、その後セクション3〜10を繰り返します。
  12. 30μmの孔径ストレーナーを使って溶液を15mLの遠心分離機管に濾過し、ゴミや塊を除去します。
  13. スイングバケットローターを使って、500 x g の4°Cで5分間遠心分離します。
  14. 通常のピペットチップで上清液を除去し、ペレットを1mLの核洗浄液と懸濁バッファーに再懸浮させます。

2. 孤立核の特徴付け

  1. 核の完全性を評価するためのトリパンブルー染色。
    1. 1.5 mLのマイクロ遠心分離管に15 μLの核懸濁液を取ります。
    2. トリパンブルー染料5μL(0.4% w/v)を加え、ピペッティングで優しく混ぜます。
    3. 適切な染色を得るために室温で5分間培養してください。
    4. 染色された混合物10μLをヘモサイトメーターに投与します。
    5. 複合逆立顕微鏡で観察し、形態を観察し、核の数を数えます。
  2. 単核懸浮物のフローサイトメトリー解析
    1. 1mLの分離核懸濁液を取り、スイングバケットローターを使って500 x g の4°Cで5分間遠心分離します。
    2. 通常のピペットチップで上澄液を除去し、ペレットを200μLのFACSバッファー(1X PBSおよび1% BSA)に再懸濁させます。
    3. 再懸濁核200μLを2つのアリコートに分けます。100μLを染色されていない対照として、100μLを染色サンプルとして使用します。
    4. 染色試料に1 μL 4'、6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)(1 mg/mLのストック)を加え、最終濃度10 μg/mLにします。優しく混ぜて、室温の暗い場所で5分間培養した後、フローサイトメトリー分析を行います。
    5. 本研究で使用されるフローサイトメーターでは、405 nmのバイオレットレーザーを使用し、448/45 nmで検出します。まず染色されていない対照サンプルを実行し、総母集団のうち最低10,000件の事象を取得します。
    6. 順方向散乱(FSC)は183V、側散乱(SSC)は300V、V450(DAPIレーザー)は400Vに設定します。FSCの閾値を10,000に設定してください。
      注意:すべての楽器電圧とゲイン設定はサンプル間で一定に保ち、一貫性を保っています。
    7. 単一散乱とダブルレットおよびアグリゲートを区別するために、前方散乱面積(FSC-A)と順方向散乱高(FSC-H)をプロットします。線形関係を示す事象の周りにゲートを描き、単点核のみを保持します。
    8. FSC-Aと側散乱面積(SSC-A)の二変量プロットを作成します。孤立した核は通常、明確なサブポピュレーションを持たない異質な散乱プロファイルを示すため、散乱集団全体を網羅する広範なゲートを適用します。
    9. SSC-Aとバイオレット450 nm面積(V450-A)の2次元密度(擬似色)プロットを作成します。染色されていないコントロールを使って背景蛍光を定義し、正確なゲート配置をガイドします。完全な核に対応する異なるDAPI⁺集団を特定しゲート化します。
      注:単一のフルオロクロム(DAPI)を使用しているため、蛍光補正は不要です。
  3. 共焦点顕微鏡を用いた孤立核のイメージング
    1. 50μLの核懸濁液を取り、染色サンプルに1μL DAPI(1 mg/mL)を加えて最終濃度10 μg/mLにし、優しく混ぜて室温で暗闇で5分間培養した後、共焦点イメージングを行います。
    2. 染色された核懸濁液5μLをきれいなガラススライドに取り付け、カバースリップで覆います。
      注意:核形態を保護するために固定は避けてください。
    3. 逆立共焦点顕微鏡を使って核を可視化します。共焦点顕微鏡のソフトウェアを開き、まず10倍の明るさで観察し、その後40倍の明るさに切り替えます。
    4. スペクトル検出器と対物レンズPLAN APO λD 40X(NA 0.95, RI 1.0)を備えたレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて共焦点画像を取得します。405nmレーザーでDAPIを励起し、429〜474nmの放射を収集します。
    5. 画像パラメータは以下の通りです。
      1. 検出器モード:マルチチャネル(GaAsP)
      2. スキャナー:ガルバノ単方向
      3. スキャンモード:バンド
      4. ライン平均:2倍
      5. 解像度:1024 × 1024ピクセル
      6. 滞留時間:2.0μs
      7. ピンホールサイズ:47.7 μm
      8. レーザー出力:0.1〜9.3%(電界強度による)
      9. 検出器利得:37.8-45.9%
      10. ズーム:1.0X
      11. キャリブレーション:0.43〜0.58 μm/ピクセル
    6. AXカメラでクロストークモードを最小限に抑え、同一の光学構成ですべての画像を取得し、完全フォーカスシステム(PFS)がイメージング中に作動してZ面の安定性を維持します。

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結果

ヒト冠動脈内膜摘出術の組織は、CABG手術を受けた患者から採取されました。組織は計量され、核の分離のために処理され、さらに分離された核はフローサイトメトリーと共焦点顕微鏡で確認されました(図1)。

トリパンブルーによる核分離品質の評価
RPMI培地に保管された組織は計量され、247.8 mgと測定されました。組織は細切にされ、核分離のためにマイクロペストルを用いた溶解バッファー内で均質化されました(図2A-C)。核分離とトリパンブルー染色の結果、生存可能な細胞を持たない核群が明確に観察され、効果的な組織溶解が確認されました。孤立した核は顕微鏡下で密で丸い濃い青色の物体として現れ、核分離に成功したことを示しています。さらに、懸浮液には約4,033個の核/μLが含まれていました(図2D)。対照的に、石灰...

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ディスカッション

ヒト冠動脈内膜摘出組織から核を分離するための最適化されたワークフローは、現在のプロトコルで説明されています。ここで述べた核分離プロトコルは、進行した冠動脈動脈硬化プラークから生存可能で完全な細胞を得るという重大な制約を克服するために特別に設計されました。従来のscRNA-seqアプローチが過酷な酵素分解と機械的解離に依存するのに対し、我々の最適化プロトコルは、非イオン性洗剤含有溶解バッファー(Nonidet P-40)における穏やかな機械的均質化を用いて、構造的完全性を保ちつつ核を選択的に解放します31.このアプローチは冠動脈組織の解析にいくつかの重要な利点を提供します。まず、非イオン性洗剤は細胞膜を効率的に破壊しつつ、核膜をそのまま残し、細胞質成分、脂質滴、細胞外破片から核をきれいに分離し、サンプルを汚染しマイクロ流体捕捉システムを妨げることを可能にします32,33

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、インド医療研究評議会(ICMR)(EM/Dev/SG/34/01106/2024)およびアーメダバードのU.N.メータ心臓病研究所・研究センターの協力によって支援されました。クシ・ジャニは、インド政府の大学助成委員会(UGC)および科学産業研究評議会(CSIR)が共同CSIR-UGCネット資格(NTA参照番号:241620143543)を授与したことを感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 & mu;Mストレーナーミルテニ・バイオテック 130-098-463
30 & mu;Mストレーナーミルテニ・バイオテック 130-098-458
牛血清アルブミンハイメディアTC546-25G
遠心分離機MPWNAhttps://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
複合顕微鏡ニコンNA ニコン Eclipse Ts2 逆立顕微鏡(https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
コンフォーカル顕微鏡 ニコンNAニコン Ti2-E 倒立共焦点顕微鏡(https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
カバースリップハイメディアBG011C
CRYOCHIL ワイドマウス標本バイアルターソンズ883191
ダピシグマD9542-5MG
DPBSギブコ(サーモフィッシャー)10010-023
遠心分離機チューブ(15 mL)ターソンズ546021
フローサイトメーター BDバイオサイエンス663029BD FACSLyric(3L12C 計器 CEIVD)
血球計アクシビオCCB 100
マイクロ遠心分離機チューブ(1.5 mL)ターソンズ500010C
マイクロ遠心分離機チューブ(5 mL)ターソンズ500050
MgCl2シグマM1028-100ML
マイクロペッスルターソンズ160020
NaClシグマS9888-500G
NP-40ハイメディアMB143-100ML
ヌクレアーズフリー水ギブコ(サーモフィッシャー)W4502-1L
RNase阻害剤シグマ333540201
RPMI 1640ギブコ(サーモフィッシャー)11875093
スライド リビエラ72910135
トリスHClシグマT2194-100ML
トリパンブルー シグマ302643-25G

参考文献

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