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方法論記事

肺腺がん細胞株からの腫瘍オルガノイド培養の生成

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DOI:

10.3791/70387

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2026年6月12日

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Lung Inflammation and Injury, Department of Pulmonary Medicine, Zhongshan Hospital, 3National Demonstration Center for Experimental Biology Education, School of Life Sciences, Fudan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、A549細胞株から腫瘍オルガノイドを迅速かつ純粋かつコスト効率よく確立する方法を提示し、予備試験および教育目的に適しています。

要約

ここでは、A549ヒト肺腺癌細胞株から細胞株由来腫瘍オルガノイド(CDTO)を生成するプロトコルについて説明します。プロトコルでは、2D拡張A549細胞をマトリゲルに埋め込み、長期培養のために3D培養培地に保持します。推奨される種子密度は500セル/μLで、安定したオルガノイド形成を支えることが決定されました。その結果得られたCDTOは、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色および免疫蛍光(IF)によって特徴付けられました。オルガノイドは肺腺がんマーカーである甲状腺転写因子1(TTF-1)、接着タンパク質E-カデリン(ECAD)、および細胞骨格タンパク質ケラチン7(KRT7)の高い発現を維持していました。さらに、タイトジャンクションタンパク質Zona Occludens 1(ZO-1)の発現は腫瘍オルガノイドの極性調節異常を示しました。このプロトコルは、技術的にシンプルでコスト効率が高く、純粋な腫瘍性オルガノイドプラットフォームとして肺腺癌の研究を提供します。その簡易さと再現性から、学部の実験室教育にも適しており、限られた実験スケジュールの中で基本的な3D腫瘍オルガノイド培養技術を習得するのに役立ちます。

概要

オルガノイドはin vitroで、 幹細胞に由来する自己組織化された三次元(3D)構造であり、実際の臓器の生物学的複雑さをかなりの程度再現することができます。オルガノイドを構成する細胞は、誘導多能性幹細胞や組織由来細胞から派生する可能性があり、後者には正常な幹細胞/前駆細胞、分化細胞、腫瘍細胞が含まれます。従来の二次元培養システムや動物モデルと比べて、オルガノイドは人体の生理的特徴により近い形で模倣でき、実験上の柔軟性も高まります。その結果、オルガノイド技術は医薬品開発3、個別化医療4、疾患モデリング5に広く応用されています。

多くの研究により、大腸がん6、前立腺がん7、膵臓がん8、胃がん9、肝がん10、胆道がん11、乳がん12、神経内分泌腫瘍など幅広い範囲のオルガノイドモデルが確立されています。しかし、腫瘍オルガノイド研究における大きな課題の一つは純度の維持にあります。例えば、非小細胞肺がんの研究では、確立されたオルガノイドのうち純粋な腫瘍はわずか17%であることが明らかになりました。これは腫瘍サンプルに正常細胞と悪性細胞の混合が含まれており、培養13までに完全に分離が困難だからです。この不純物の問題は、腫瘍細胞以外の細胞の増殖による腫瘍細胞の消失を引き起こし、薬剤感受性試験の読み取りに干渉し、RT-qPCRやウェスタンブロットのような不正確な分子解析を引き起こすことがあります。これは腫瘍細胞のRNAやタンパク質が制御不能な汚染細胞の割合によって希釈される現象です。

この問題に対処するため、研究者たちは腫瘍細胞が特定の成長因子に依存する依存性を低減させることを利用し、正常な細胞成長を抑制しつつ腫瘍細胞の拡大を促進する選択的培養培地の設計を探求しています14。さらに、細胞選別やモノクローナル同定などの戦略も開発され、純粋な腫瘍オルガノイドの構築が進められています。

本プロトコルは、A549ヒト肺腺癌細胞株を用いて細胞株由来腫瘍オルガノイド(CDTO)を生成する方法を説明しており、A549は部分的にがん幹細胞様の特性を示すほか、clonogenis(細胞生成性)、増殖性、腫瘍発生性の強化(vitro)が報告されています。15. 得られたCDTOは、系統特異的バイオマーカーである甲状腺転写因子1(TTF-1)16、癒着タンパク質E-カデリン(ECAD)17、細胞骨格タンパク質ケラチン7(KRT7)16の発現を維持し、腫瘍オルガノイドに特徴的な生理的特徴を示した。このモデルは確立が容易で、明確ながん細胞成分を含むため、腫瘍オルガノイド分野に初めて取り組む研究者や、一次腫瘍オルガノイド培養における腫瘍の同一性喪失に悩む研究者に適しています。潜在的な応用例としては、予備的な薬剤感受性検査18、腫瘍微小環境研究19、3D培養技術の教育訓練などがあります。

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プロトコル

実験室の室温は22〜24°Cで、RTと呼ばれます。スイングバケット遠心分離機の使用が推奨されます。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 一次A549オルガノイドの確立

  1. 調製とA549細胞採取
    1. A549細胞を70%の合流率で入れた6cmの皿を準備します。トリップLEとPBSを37°Cまで予備加熱します。 実験設計および 表1に従って細胞量とマトリジェル体積を計算してください。
      1. 解凍には、少なくとも2つの井戸を氷上に60分間置くために冗長性のあるマトリジェルアリコートが必要でした。ポリスチレンとTC処理済みのプレートを準備し、ドームが半球形に保たれるようにします。
      2. 新たに調製した2D培地(10%胎児用牛血清を含むDulbecco's Modified Eagle's Medium)と3D培地(ヒト肺腺癌オルガノイド培地)を用います。3Dメディアは商業用キットから生成することも、Hans Cleverのラボ20のSachs, N.らの研究によると、
        注:6cmの皿1皿で消化後に約5,000,000個の細胞が得られます。実験設計のために入力セルの数を減らします。ガラス底を使った共焦点イメージング用に設計されたプレートは、Matrigelが適切な3D形状を形成するには適していません。
    2. 使用済みの2D培地を吸引し、1mLのPBSで細胞を一度洗浄して残留血清を除去します。PBSを吸引し、予備温めたTrypLE1mLを加え、37°Cで4分間培養します。
    3. 顕微鏡で細胞を観察してください。細胞質が後退し細胞間の結合を失ったら、同じ量(1mL)の新鮮な2D培地を加えて酵素反応を終結させます。
    4. 優しくピペットで取り除き、培養表面から接着した細胞を再懸浮させます。細胞懸浮液を1.5mLの遠心分離機管に移し、300×gで3分間RTで遠心分離して細胞をペレット状にします。
    5. 上清液を捨て、細胞ペレットを1 mLの2D培地に再懸浮させます。10μLの細胞懸濁液を100μLに希釈し、ヘモサイトメーターで細胞数を数えます。ステップ1.1.1に従って必要な体積を計算し、あらかじめすすぎた先端を含んだ1.5mL遠心分離機チューブに吸引します。
  2. 収穫した細胞をマトリゲルにシーディングする
    1. 氷を準備し、ピペットチップを-20°Cの冷蔵庫で1分間冷却し、可能であれば低保持型の先端を使いましょう。マトリジェルのアリコートに結晶が残らないようにし、先端が溶液に入るときに気泡ができないように注意してください。
    2. 採取した細胞を含むチューブをRTで300 g ×遠心分離し、上清液を廃棄します。チューブを氷の上に置いてください。冷えたピペットの先端を使って、必要な量のマトリゲルをゆっくり吸引し、氷の上でペレットに加えます。ピペットの最初のストップだけを氷の上でゆっくりと再懸濁します。観察が必要な場合は、氷を10秒以上放置しないでください。
    3. 冷めたピペットの先端を使い、混合物を氷の上に保管してください。各井戸の中央に混合物を1アリコートずつ注ぎます。滴出中にピペットをゆっくり引き抜き、気泡の発生を防ぐために最初のストップのみを使いましょう。
      注意:混合物は中央にドーム状の3D構造を形成する必要があります。次の井戸に移る前に混合物を再懸浮させてください。可能であれば、エッジウェルの使用を避け、これらのウェルにPBSを追加してください。
    4. プレートを37°Cで5% CO₂インキュベーターで40分間培養し、ゲル重合を促します。マトリジェルが固まったら、井戸壁に沿って慎重に3D培地を加え、37°Cで培養を続けます。
      注意:ディスペンション中に泡を発生させないようにしてください。気泡が発生した場合は、その部分の混合液は使わないでください。
    5. 培養中は3日ごとに、または色が変化(ピンクから黄色)に変化した際に3D培地を交換してください。各培質変化時のオルガノイド成長を倒立顕微鏡で観察し、形態を写真で記録して構造の発達を監視します。
      注意:オルガノイドは、5000セル/μLで示されるような分解や断片化ではなく、30μmを超える密度が高く絡み合っているべきです(図1D)。

2. オルガノイドの固定、埋め込み、切断

  1. 6日目から9日目にオルガノイド培養を準備します。培養培地を細胞培養皿から取り出します。冷たいPBS1mLでピペットし、オルガノイドを優しく剥離し、接着を防ぐために5%BSAで事前にすすぎた1.5mLチューブに移します。有機化合物が氷上で重力で自然に沈殿し、上澄液を慎重に除去します。
  2. ペレットを再懸浮させるために1mLの冷たいPBSを加えます。オルガノイドが重力で自然に沈殿するのを少なくとも5分間待ち、上清液を慎重に除去します。一部のオルガノイドが沈殿しない場合は、4°Cで200×gで1分間遠心分離機で回収します。このステップは複数回行われ、「スモールウォッシュ」と呼ばれます。
  3. 残留したマトリジェルを取り除くために、小さな洗いを2回行います。残留マトリジェルが残っている場合は、洗濯中に冷たいPBSに10 mM EDTAを最終濃度に加えてください。
    注意:サンプルをフムフードに移してください。オルガノイドを覆うのに十分な4%パラホルマルデヒド(PFA)を加え、冷気フードで1時間固定します。固定剤は捨てて、小さな洗浄を2回行います。IF染色のステップ4.1を進めてください。
  4. オルガノイドがチューブ底部に沈殿した後、上清液を捨て、サンプルを70〜75°Cの金属浴で5分間予熱して、ステップ2.7での急速なアガロース固化を防ぎます。
  5. 1×PBSに3%(w/v)アガロースを準備し、電子レンジの水浴で完全に溶け透明になるまで加熱します。体積の減少やアガロース濃度の変化を防ぐために煮沸は避けてください。
  6. 固定オルガノイドを3%アガロースの30〜50μLに素早く再懸浮させ、均等な分布を確保し、20〜30分間氷上で冷やして固化させ、気泡を発生させないようにします。
  7. アガロース-オルガノイド混合物が固まったら、針で慎重にアガロースブロックをチューブから取り出し、ラベル付きの組織埋め込みカセットに移します。
  8. アガロースブロックを含むカセットを段階化されたエタノール溶液(30%、50%、70%[4°Cで一晩保存可能]、脱水のために80%、90%、95%、100%、100%)に順次浸します。各ステップを20回転の揺れるプラットフォーム上で30分間孵化させます。
  9. 使用前にパラフィンワックスブロックをオーブンで事前に溶かし、65°Cで使用します。 脱水したアガロース埋め込みオルガノイドをキシレンに移し、クリアリングします。残留エタノールを除去するために、それぞれ15〜20分ずつ2回浸けてください。
  10. 組織カセットを順次パラフィン浴1に45分、次にパラフィン浴2にさらに45分移します。
  11. 組織カセットと金属型を埋め込みステーションの溶融パラフィンチャンバーに入れます。カセットからオルガノイドまたは組織サンプルを取り出し、金属型の中央に配置します。型を冷たい板に置いて、サンプルの向きを固定します。
  12. ティッシュカセットを金属型の上に置き、溶けたパラフィンを追加で満たし、冷蔵板の上で少なくとも60分間冷ます。パラフィンブロックが完全に固まったら、金属型を取り出し、パラフィン埋め込みオルガノイドブロックを4°Cで保存し、切断まで保存します。
  13. マイクロトームを用いてパラフィン埋め込みオルガノイドブロックを切開します。各セクションの厚さが均一であることを確認し、その後の染色やイメージングを容易にしてください。
  14. 切断した部分を40°Cで保温した水浴に浮かせ、パラフィンリボンの完全な膨張を可能にします。各セクションがシワのない一層として広がるようにしてください。折りたたまれたり重なったりした部分は捨てます。
  15. 拡大した切片を、スライドを切片の下にわずかに傾けて浸し、垂直に持ち上げて組織を捕捉することで、粘着式顕微鏡スライドに取り付けます。サンプルの識別を保存するために、鉛筆でスライドにラベルを付けてください。

3. ヘマトキシリンおよびイオシン(H&E)染色

  1. 組織やオルガノイド切片を含むスライドを60°Cのオーブンで1〜2時間焼き、適切な接着を確保し残留パラフィンを除去します。
  2. 断片を順に脱泥し、キシレンIに15分、キシレンIIに15分間浸し、その後100%、100%、95%、90%、80%、70%の段階エタノールでそれぞれ5分間再水和します。その後、スライドを二重蒸留水(ddH₂O)で2回、それぞれ5分間すすいでください。
  3. ヘマトキシリンで5分間染色し、流れる水道水で1〜2分すすいで、その後1%酸性アルコールで2秒分分化します。再び水道水で1〜2分間洗い、その後1%アンモニア水で核を5秒漂白し、最後に水道水で1〜2分間すすいでいます。
  4. 切片を70%、80%、90%、95%のグラデッドエタノール系列でそれぞれ3分間脱水し、その後アルコール系エオシン溶液でエオシンで10分間カウンターステインします。
  5. 切片を絶対エタノールで2回、それぞれ5分間洗い流します。
    注意:アルコール系のエオシンの場合は、染色前に最大95%のエタノールを脱水させてください。水溶性のエオシンの場合は、脱水前に染色を行ってください。
  6. セクションを2回、それぞれ5分間キシレンに浸してクリアし、取り付けるまでキシレンに浸しておきます。
  7. キシレンから除去後はすぐに中性樹脂のマウントメディウムでスライドを取り付け、気泡を避けて注意してください。
  8. 搭載スライドをRTで30〜60分間自然乾燥させた後、光学顕微鏡で観察します。
    注意:キシレンクリアリング後すぐに取り付けることで酸化を防ぎ、光学的クリアさを保証します。

4. 全マウント免疫蛍光染色

  1. ステップ2.4から続けてください。ペレットに1mLのブロッキングおよび透過液(5% BSA + 0.3% Triton X-100)を加え、RTで60分間または4°Cで1〜2日間停止を目的に培養します。
  2. 一次抗体と二次抗体は、ブロッキングおよび透過溶液中のメーカー推奨比率に従って希釈します。少量で一度洗浄し、200μLの希釈した一次抗体をペレットに加えます。4°Cで一晩培養します。
  3. 小さな洗浄を3回行い、200μLの希釈した二次抗体をペレットに加えます。RTで60分間孵化します。
  4. 次に、小さな洗いを3回行います。15μLのマウント培地を加えてペレットを再懸垂させ、オルガノイドを含む培地をガラススライドに落とします。ゆっくりとカバースリップをメディウムに貼り、ネイルポリッシュで封をします。カバースリップを手動で圧縮せず、表面張力によって取り付け媒体が広がるのを許さないでください。

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結果

このプロトコルの一般的なプロセスには、2次元A549細胞を指数段階に拡張し(補足図1A)、3次元マトリゲルに移行してオルガノイドを形成する過程が含まれます(図1A)。マトリゲルにカプセル化されると、細胞は増殖し自己組織化し、主にモノクローナルオルガノイドを形成しました(図1B)。その密集した複雑な形態は通路全体で均一でした(補足図1C)。これに比べて、これらの構造物の多くは球形で、文化が進むにつれて大きくなった。一部は最初からプレート底部に付着し、2Dクローンを生み出しました(図1C)。この付着形態は、DMEMを10%FBS補足で培養したオルガノイドなど、高血清条件下でより頻繁に観察されました(補足図1B)。50〜5000細胞/μLのシーディング密度勾配を測定し、コロニー形成効率(CFE)およびオルガノイドサイズへの影響を評価しました(

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ディスカッション

本プロトコルは、技術的簡便さ、再現性、教育利用に最適化されたA549肺腺癌細胞株由来腫瘍オルガノイドの生成方法を説明しています。成功を決定づける3つのパラメータ:初期細胞状態、培地製剤、マトリックス組成です。さらに、培養期間は14日を超えないことが推奨されます。以下に主要なパラメータとトラブルシューティングを示します。

初期セル状態
細胞は遺伝的ドリフトやクローン選択を最小限に抑えるために、低いパスセージ数(<20パセージ)で維持されました。細胞は対数成長段階(70%–80%の合流)で採取され、最適なオルガノイド形成能力を確保しました。細胞計数の過程で、採取された細胞は単一細胞懸濁液であることが確認されました。これは凝集が下流の定量に影響したためです。ただし、一般的にコロニー形成には干渉しませんでした。持続的な塊は40μmのセルストレーナーでろ過されました。

マトリジェル足場
シー...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この活動は、復旦教育優良実践プログラム、国家教材研究所、基礎学科人材育成国家プログラム(第J1210012号)、ならびに教育部の基礎学科優秀学生育成プログラム(第20211021号)の支援を受けています。 図1A はBioRenderで作成されました(Joe, Z. (2026) https://BioRender.com/0qi2gmd)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL Micro Centrifuge tubeBiofilCFT003015
A549 [A-549]human non-small cell lung cancer cellsZQXZbioZQ0003STR: Amelogenin: X,Y; CSF1PO: 10,12; D13S317: 11; D16S539: 11,12; D5S818: 11; D7S820: 8,11; TH01: 8,9.3; TPOX: 8,11; vWA: 14. Mycoplasma was negetive when purchased was tested every 2 weeks. Passage number within 10 passages from the P1 aliquots of the purchased batch was used.
Advanced DMEM/F12Gibco12634010
Anti-E Cadherin antibodyAbcam ab231303
Anti-Fade Mounting MediumYEASEN 36307ES08
Anti-HIF-1 alpha antibodyAbcam ab51608
Biological Safety CabinetNuaire LABGARDNU-540
Biological Tissue Embedding MachineKEDEEKD-BM
BSASigma A1933
Cell-Grade BSASigma A1933-100G
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5702 RSwing bucket; Mild to low speed.
Centrifuge tubeBiofilCFT920150
Citrate Antigen Retrieval Solution (pH 6.0)ZSGB-BIO ZLI-9065
CryostageKEDEEKD-BL
Cytation 5 Cell Imaging Multimode
 Reader		BiotekCytation 5
Cytokeratin 7 (KRT7) Rabbit mAbAbclonal A4357
DMEMGibco11965092
DMSOSolarbio D8371
Donkey SerumSolarbioSL050
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965118
Eclipse Ts2 Inverted MicroscopeNikon Eclipse Ts2
Eosin Staining Solution (Alcohol-Soluble)Servicebio G1001
FBSNobimpexB118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 IncubatorThermo Scientifici60
Hematoxylin Bluing SolutionServicebio G1040
Hematoxylin Differentiation SolutionServicebio G1040
Hematoxylin Staining SolutionServicebio G1004
HemocytometerSolarbioYA0810
Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium (3D medium)PMO Bio HC1001
Immunohistochemistry (IHC) PenZSGB-BIO ZLI-9305Store in 4°C
Laser Confocal Microscope  FV3000OlympusFV3000Usual parameter range: PMT Voltage: 500 ± 200 V; Laser Transmissivity: 5 ± 3%; Offset: 3 %
Manual Rotary MicrotomeLeicaRM2235
Metal BathALLSHENGMK-3000
Microwave OvenGalanz
Nail PolishLete
Neutral Balsam (Mounting Medium for Microscopy)BeyotimeC0173
Organoid-Specific Extracellular Matrix GelPMO Bio BM1001
PBSWISENT 311-010-CL
Peroxidase Blocking SolutionBeyotime P0100A
PipettesEppendorf312300063/312300020/312400083
Pipettes tipsAxygen14-222-692/14-222-723/14-222-869Consider using low retention tips if possible.
Three-Dimensional ShakerSCILOGEXSK-D3309-ProLow speed.
Tissue Flotation Water BathKEDEEKD-P
Triton X-100VWR92046-34-9
Trypan BlueGibco 15250061
TryPLEGibco12605028
TTF1 Recombinant Monoclonal AntibodyHUABIO HA720067

参考文献

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