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方法論記事

組換えヒトSLFN14リボヌクレアーゼの急速生成と質量光度による化学量論解析

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DOI:

10.3791/70393

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2026年2月20日

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1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

この記事について

サマリー

このプロトコルは、組換えヒトSLFN14リボヌクレアーゼの産生および質量光度測定による化学量論解析を記述しています。

要約

リボヌクレアーゼは、RNA切断を触媒し、遺伝子調節を含む多様な生物学的プロセスに寄与する特殊なRNA結合タンパク質のクラスです。それにもかかわらず、多くのヒトリボヌクレアーゼの構造、機能、調節は組換えタンパク質生成の課題により依然として十分に解明されていません。この方法は、ヒトのシュラーフェン14(SLFN14)リボヌクレアーゼの一時的発現、精製、化学量論解析の効率的なアプローチを説明しています。組換えフラッグタグ付きSLFN14はHEK293懸濁セルで発現され、アンチフラッグ親和クロマトグラフィーと低分解能サイズ排除クロマトグラフィーからなる迅速な2段階精製ワークフローで単離されました。質量光度測定は、感度の高い単一分子技術であり、生理的塩条件下ではSLFN14が細胞RNAに結合した安定したホモダイマーを形成し、一方で高塩はホモダイマー配列を保持しつつRNA解離を促進しることが明らかになりました。得られた組換えヒトSLFN14タンパク質は、下流の構造研究や定性的生化学的アッセイに適しています。この組換えヒトタンパク質単離とサンプル特性解析の迅速なアプローチは、生物物理学的および生化学的特性評価を目的とした他の哺乳類リボヌクレアーゼやRNA結合タンパク質の産生にも広く応用可能です。

概要

シュラーフェン14(SLFN14)は、あまり研究されていないリボヌクレアーゼであり哺乳類の宿主制限因子1,2,3です。ヒトSLFN14タンパク質は6個からなるSLFN遺伝子調節因子ファミリーに属し、免疫、抗ウイルス活性、化学感受性、細胞分化に関与しています(4,5,6,7,8)。SLFN遺伝子調節因子の役割に関する機構的洞察は依然として不完全であり、しかし、多くのメンバーは翻訳制御に不可欠なリボヌクレアーゼ活性を保有しています7,9。SLFNリボヌクレアーゼはタンパク質ホモ二二体化時に活性化され、基質切断に熟練した複合RNA結合裂隙を形成します10,11。細胞を偽のRNA切断から守るために、ほとんどのSLFNリボヌクレアーゼは主にモノマーとして存在し、5,7,11,12の各ファミリーメンバーに特異的な分子シグナルによって活性化されるのを待っています。

ヒトSLFN14の組換え生成により、これまで十分に研究されてこなかったこのリボヌクレアーゼの包括的な分子研究が可能となり、その機能と調節に関する新たな知見が得られました 2,13,14。精製組換えSLFN14タンパク質は、in vitro RNA切断アッセイを用いて構造依存的なトランスファーRNA切断活性の特性評価を加速させました2,14。精製されたSLFN14タンパク質のクライオ電子顕微鏡(cryoEM)研究でも、二重RNAが中心裂2,13,14に負荷をかけるSLFN14ホモダイマー配列が明らかになります。SLFN14の高次アセンブリは、分子量を測定するための単一分子技術である質量フォトメトリーによってさらに特徴づけられました。意外にも、この感度の高い技術により、SLFN14は主に塩耐性ホモダイマーを形成する一方で、機能不明の塩感受性ホモテトラマー2,13,14も形成できることが示されました。これらを総合的に見て、精製されたヒトSLFN14タンパク質を得る能力は重要な節目であり、SLFN14を媒介した翻訳制御に関する新たな研究段階を確実に推進する早期の分子知見を可能にしました。

組換えSLFN14リボヌクレアーゼは、従来のタンパク質生産戦略では入手が困難でした。SLFN14の酵素活性を記述した元の報告では、収率の低さ、安定性の低下、溶解度の低さが指摘されていました。ヒトSLFN14タンパク質は長いポリペプチド鎖、顕著な疎水性、リボヌクレアーゼ依存性の細胞毒性を特徴とし、これらが共に従来の細菌発現システム1,13,14の使用を大きく妨げています。しかし、高度な真核生物翻訳およびシャペロン機構が、フルレングスのヒトSLFN14タンパク質を効率的に生成する強力な代替手段を提供しています。バクロウイルス-昆虫発現系および哺乳類発現系の両方が、低温EM研究および生化学的アッセイ2,13,14のために全長ヒトSLFN14タンパク質を得るために用いられています。しかし、場合によっては昆虫由来のSLFN14タンパク質がサンプルの集まりを防ぐために安定化変異を必要としました。バキュロウイルス介在遺伝子送達は、多大な労力と長いリードタイムが研究進行の遅れも関連しています15,16。一方、哺乳類発現宿主から分離された組換えSLFN14タンパク質は、速度の利点を持ち、サンプル最適化におけるタンパク質工学の必要性を回避できます。

この方法は、比較的迅速かつ低負荷で組換えの野生型SLFN14タンパク質を生成し、下流の分子研究に適した方法を提供することを目的としています。哺乳類細胞の利用により、SLFN14タンパク質工学を必要とせずに適切なタンパク質の折りたたみを保存するためのほぼネイティブ環境を提供します。ウイルスベクター戦略とは異なり、化学ベースの遺伝子送達方法は、生産時間を数ヶ月から15日目に短縮します。哺乳類細胞培養の比較的高いコストを相殺するため、この方法はコスト効率の良いポリエチレニミン(PEI)トランスフェクション試薬および懸浮液中培養中のヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞を利用します。サンプル処理中のタンパク質損失を最小限に抑えるため、この手法はSLFN14タンパク質精製のための低サンプル消費戦略や、サンプル品質管理のための化学量論分析も活用しています。この4日間のプロトコルでは、1) HEK293細胞での一時的遺伝子発現、2) スピンカラムを用いた2段階クロマトグラフィーワークフロー、3) 質量フォトメトリーによるタンパク質化学量論の測定方法について、具体的な詳細を提供します。この手法の最終生成物は、二重C末端Myc-Flagタグ(SLFN14Myc-Flag)を持つ野生型ヒトSLFN14タンパク質であり、下流のクライオEM研究や定性的生化学的特性解析に利用可能です。この多様なアプローチは、特に異種発現系で過剰発現が難しい大型および細胞毒性を持つリボヌクレアーゼ遺伝子など、他の研究不足のヒトRNA結合タンパク質の単離および特性評価にも応用可能です。したがって、このプロトコルはヒトプロテオームの包括的な分子特性解析の障壁を下げます。

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プロトコル

HEK293細胞培養を含む実験は、承認された機関のバイオセーフティプロトコルに従い、バイオセーフティレベル2(BSL-2)条件下で実施されるべきです。

1. 哺乳類細胞におけるSLFN14Myc-Flag の一時的発現

  1. 種子哺乳類HEK293懸濁細胞を0.5 x 106 細胞/mLで、予温めた血清フリー培地に、通気付きバッフル1リットルフラスコで最終体積320 mLに投与します。
  2. 細胞は37°C、125rpm、CO28%、湿度75〜80%で24〜32時間培養します。
  3. トリパンブルー染色と細胞計19を用いて、細胞数が1.2-1.8×10 x6 cells/mLで生存率が90%以上であることを確認しましょう。
  4. 40mLの培養液を8本の円錐形チューブにデカントします。
  5. 細胞は400 x gで遠心分離し、20〜25°Cで5分間加熱します。
  6. 育成培地を捨てる。
  7. 各細胞ペレットを、予温された血清フリートランスフェクション培地38mLに優しく再懸浮させ、最終体積は304mLにします。
    注:ステップ1.1で記述された元の培養体積の残りの16 mLは、ステップ1.12で記載されたトランスフェクション混合物から供給されます。
  8. セルを新しいベント付きバッフル1リットルフラスコに移します。
  9. 円錐形チューブ内に、組換えSLFN14Myc-Flag 遺伝子をコードする精製プラスミドDNA320 μgを8 mLの血清フリートランスフェクション培地に加え、20〜25°Cで5分間インキュベートします。
    注:最終体積640μLの場合、プラスミド濃度は通常500 ng/μLです。
  10. ステップ1.9と同時に、0.22μmのフィルターで滅菌されたPEIを8 mLの血清フリートランスフェクション培地に960 μgを加え、20〜25°Cで5分間培養します。
    注:作業在庫は通常、最終体積960μLで1 mg/mLです。
  11. PEI混合物(ステップ1.10参照)を組換えプラスミドDNA溶液にゆっくりと滴下して加え、20〜25°Cで15分間培養します。
  12. ステップ1.8で調製した細胞に、DNA/PEI混合物を16mLをゆっくりと滴下して加えます。
  13. 細胞を37°C、125rpm、CO28%、湿度75〜80%で48時間培養します。
  14. 40mLのトランスフェクト細胞を8本の円錐形チューブにデカントします。
  15. 400 x gで遠心分離し、20-25°Cで5分間、トランスフェクト細胞を採取します。
  16. 上清液をデカントし、8個の細胞ペレットを-80°Cで保存します。

2. 二段階組換えSLFN14Mycフラグ 精製

  1. アンチフラッグ親和クロマトグラフィー。
    各調製剤ごとにステップ1.16の4つの細胞ペレットを使い、アンチフラッグ親和性クロマトグラフィープロトコルを二重に実施します。
    1. 樹脂の準備。
      1. 平衡アンチフラッグアガロース樹脂を20〜25°Cで15分間浸します。
      2. 40μLの50%樹脂スラリーを2mLのマイクロ遠心チューブに移す直前に、ボトルを逆さまにして優しく再懸浮させます。
        注意:粘性スラリーを容易に回収するためにピペットの先端を切り取ってください。
      3. 樹脂を1 mLの高塩洗浄バッファー(50 mM Tris pH 7.4、600 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.5 mM β-ME、0.1% Tween-20)に再懸浮させます。
      4. 4°Cで45分間孵卵します。
      5. 樹脂スラリーを8,000 x gで4°Cで2分間遠心分離します。
      6. 高塩洗浄バッファーは吸引して捨て、樹脂を乱さないように注意してください。
    2. 細胞溶解液の説明。
      1. 各トランスフェククト細胞ペレットに、225 μLの冷却再懸濁バッファー(50 mM Tris pH 7.4、600 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.5 mM β-ME、0.5% Triton-X-100、1 mM PMSF、5 μg/mL Leupeptin、1 mM ベンザミジン、0.7 μg/mL ペプスタチンA、0.25 U/mL Genius ヌクレアーゼ)を再懸浮させ、4つの細胞ペレットにて合計900 μLの量を投与します。
      2. 細胞を氷で事前に冷却した2mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
      3. マイクロ遠心分離機チューブを4°Cで30分間水平にナテーターでキュベートします。
        注意:タンパク質発現レベルが低い場合のトラブルシューティングのために、20μLの総溶解酸を-20°Cで保存してください。
      4. 細胞溶解液を21,300 x gで遠心分離し、4°Cで20分間洗浄します。
    3. タンパク質親和性捕捉と洗浄。
      1. 精製溶解液(ステップ2.1.2.4参照)と平衡化されたアンチフラッグ樹脂(ステップ2.1.1.6参照)を組み合わせます。
      2. 溶解液-樹脂混合物を、ヌータに水平に置いたマイクロ遠心分離機管で4°Cで60分間培養します。
      3. 溶解液-樹脂混合物を8,000 x gで4°Cで2分間遠心分離し、樹脂ペレットを形成します。
      4. 樹脂ペレットを乱さないように注意しながら、約700μLの上清液を廃棄します。
        注意:樹脂結合後、捕捉効率が悪い場合のトラブルシューティングのために、上清液20μLのアリコートを-20°Cで保存してください。
      5. 残った樹脂-上清混合物を再懸浮させ、溶液を空の800μL容量のスピンカラムに移し、空の2 mLマイクロ遠心分離機チューブに挿入します。
      6. スピンカラムを1,000 x gで4°Cで2分間遠心分離し、流れを捨てます。
      7. ステップ2.1.3.5の空のマイクロ遠心分離機チューブを500μLの高塩洗浄バッファーですすいでおり、溶液をスピンカラムに移します。
        注意:この工程はマイクロ遠心分離機管内に残った残留樹脂の回収に役立ちます。
      8. スピンカラムを1,000 x gで4°Cで2分間遠心分離し、流れを捨てます。
      9. スピンカラムに高塩洗浄バッファー500μLを加えます。スピンカラムを1,000 x gで4°Cで2分間遠心分離し、流れを捨てます。この工程を繰り返し、合計4回の高塩量洗浄を行います。
      10. スピンカラムに500 μLの低塩ウォッシュバッファー(50 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.5 mM β-ME、0.1% Tween-20)を加えます。スピンカラムを1,000 x gで4°Cで2分間遠心分離し、流れを捨てます。この工程を繰り返し、合計で2回の低塩水洗いを行います。
      11. スピンカラムに500μLのATPウォッシュバッファー(50 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.5 mM β-ME、0.1% Tween-20、10 mM ATP)を加えます。スピンカラムの底部を塞ぎ、4°Cで5分間培養します。 スピンカラムと遠心分離機を1,000 x gで4°Cで2分間抜き、流れを廃棄します。この工程を繰り返し、合計4回のATP洗浄を行います。
      12. 最終洗浄は、スピンカラムに500μLの低塩洗浄バッファーを加えます。スピンカラムを1,000 x gで4°Cで2分間遠心分離し、流れを捨てます。
    4. 3xFlagペプチドによるタンパク質の洗脱。
      1. スピンカラムの底面を低くくすまないワイプで塗り、余分な液体を取り除き、スピンカラムの底を塞ぎます。
      2. 樹脂の上に55μLの3xFlag洗脱バッファ(50 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.5 mM β-ME、0.1% Tween-20、300 μg/mL 3xFlagペプチド)を加えます。
      3. スピンカラムの開口部をパラフィルムで密封し、カラムを1.7 mLのマイクロ遠心分離機チューブに入れます。
      4. スピンカラムをヌーターターで垂直に4°Cで60分間孵化します。
        注意:スピンカラムを垂直に保つには、マイクロ遠心分離機のチューブラックをゴムバンドで紐テーターに取り付けてください。
      5. パラフィルムとスピンカラムプラグを外してください。溶出された組換えSLFN14Myc-Flag タンパク質を、1,000 x gの液体で4°Cで2分間遠心分離し、クリーンな1.7 mLマイクロ遠心分離機内で採取します。
      6. アンチフラッグ樹脂の溶出液を50 μL、SDS-PAGE解析用に5 μLを保持します。
  2. サイズ排除クロマトグラフィー。
    標準的なSLFN14Myc-Flag タンパク質解析には低塩脱塩バッファー(150 mM NaCl)を用い、APO SLFN14Myc-Flag 特性解析には高塩脱塩バッファー(500 mM NaCl)を用いてサイズ除外クロマトグラフィープロトコルを実施します。
    1. ステップ2.1.4.6の50 μLアンチフラッグ樹脂を2回混合し、合計100 μLサンプルを形成します。
    2. 40 kDa分子量カットオフの0.5 mLスピン脱塩カラムをキャップを緩め、底のクロージャーを外し、カラムを2 mLのマイクロ遠心分離機チューブに挿入して準備します。
    3. 脱塩カラムを700 x gで4°Cで1分間遠心分離し、カラム貯蔵液を除去します。フロースルーは捨てましょう。
    4. スピン脱塩カラムに低塩または高塩脱塩バッファー(20 mM Tris pH 7.4、150/500 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM TCEP)を加えます。スピンカラムを700 x gで4°Cで1〜2分間遠心分離し、流れを捨てます。このステップを3回繰り返してカラムを完全に平衡させます。
    5. 脱塩柱の底を低綿くさぼりで拭き取ってください。
    6. 脱塩カラムを1.7mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
    7. 樹脂を破壊せずにカラムベッドの中央に100μLの混合アンチフラッグ樹脂イリュート(ステップ2.2.1参照)を加えます。
    8. スピン脱塩カラムを700 x gで4°Cで2分間遠心分離して組換えSLFN14Myc-Flag タンパク質を溶出します。
    9. 分子特性解析のために回収された組換えタンパク質を95μL、SDS-PAGE分析用に5μLを保持します。
  3. 精製組換えSLFN14Mycフラグ タンパク質サンプルの特性解析。
    1. ドーデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を実施します。
      1. 2xラエムリサンプルバッファー5μLと、精製プロトコルの異なる段階で採取した5μLのアリコートを組み合わせます。
      2. 95°Cで5分間加熱します。
      3. 広範囲のタンパク質ラダーと10μLのサンプル-レームリバッファー混合物を4-15%のSDS-PAGEで200Vで30分間分離します。
      4. ゲルをクマッシーG-250染色液で軌道シェーカーで30分間染色し、軌道シェーカーで脱イオン水で背景がクリアになるまで染色することでタンパク質バンドを可視化します。
      5. 得られたタンパク質バンドを検査し、ステップ2.2.9で回収されたサンプルがSLFN14Myc-Flag 理論的分子量107.5キロダルトン(kDa)に一致する単一のタンパク質バンドであることを確認します。
    2. UV/vis分光光度法でタンパク質と核酸を定量化します。
      1. マイクロボリューム分光光度計に、タンパク質貯蔵バッファーと一致させる低塩または高塩脱塩バッファーを2μL使用します。
      2. マイクロ体積分光光度計を用いて、回収された組換えSLFN14Myc-Flag タンパク質の2 μLから260 nmおよび280 nmの吸収を測定します(ステップ2.2.9参照)。
      3. 280 nmでの吸収率と消光係数(93330 M-1 cm-1)を用いて、Beer-Lambertの法則20を用いて組換えSLFN14Myc-Flagタンパク質濃度を計算します。
      4. サンプルの吸収率比A260/280を、260nmで記録された吸収度値を280nmで測定した吸収度値を割って計算し、核酸が組換えSLFN14Myc-Flag タンパク質と共精製しているかどうかを判定します。
        注:A260/280比率が0.7を超える場合は、核酸21の存在を示す可能性が高いです。
    3. フルオロメトリーで細胞RNAを定量化する。
      1. 高感度のRNA特異蛍光染料を用いて、ステップ2.2.9で回収された組換えタンパク質1〜3μLを用いてRNA含有量を定量します。

3. SLFN14Myc-Flag 分子質量の質量フォトメトリーによる解析

  1. 質量フォトメーター機器のセットアップ。
    1. 質量フォトメーターの電子機器ボックス背面にあるスイッチを使ってレーザーをオンにします。
    2. アイソレーションデッキをオンにして「アイソレーション」ボタンをクリックして、楽器の振動を最小限に抑えます。
    3. AcquireMPソフトウェアを開きます。
    4. 機器が熱平衡に達するまで1時間待ちます。
  2. カバースライドの準備。
    1. ガラスカバースライドをソフトチップのピンセットで垂直に持って固定します。
    2. ガラスカバースライドの両面をタイプI超純水で洗い流し、その後イソプロピルアルコールで洗い流します。このステップを合計3回繰り返します。
    3. ガラスカバースライドの両側をタイプI超純水で最後に45秒洗い流します。
    4. 清潔なピペットチップを真空ラインに接続して吸引し、ガラスカバースライドの余分な水滴を優しく除去します。
    5. きれいなガラスカバースライドはレンズ用紙で裏打ちされたプラスチック箱に入れて、質量フォトメーターへ運ぶために保管してください。
  3. カバースライドを楽器に取り付けます。
    1. 6ウェルのシリコンガスケットをソフトチップのピンセットで金属アライメントツールに取り付けます。
    2. ステップ3.2.5のクリーンガラスカバースライドをシリコンガスケットの上に置き、ソフトチップのピンセットでシリコンガスケットの周りを軽く押します。
      注意:試料井戸に圧力をかけないでください。
    3. 質量フォトメーターのオキュラスに浸漬油を一滴垂らします。
    4. ガラスカバースライドを裏返してシリコンガスケットが上を向くようにし、ソフトチップピンセットでガラスカバースライドを優しくOculusに当てます。
    5. ガラスカバースライドの左上と右下の角を磁石で固定します。
    6. 横制御モードで、AcquireMPソフトウェアで左上のウェルを選択してレーザーをウェルセンターに合わせます。
  4. 広範囲タンパク質標準を分析する。
    1. 500倍口径のストック1μLを9μL、1xリン酸塩緩衝塩水に希釈して、50倍広範囲のキャブラント溶液(90 kDaから1 MDa)を準備します。
    2. ステップ3.4.1の50倍広範囲キャリブラント溶液2μLを18μLのリン酸塩緩衝塩水溶液に混ぜて、5倍口径の作業用ストックを準備します。
    3. 空の井戸に0.22μmのろ過済み低塩または高塩脱塩バッファー10 μLを加えます。
      注意:このステップでフィルタリングされたバッファと、ステップ2.2.9でSLFN14Myc-Flag サンプルを準備したバッファを一致させることが重要です。
    4. 蓋を閉めて。
    5. 「焦点を探す」で、AcquireMPソフトウェアの「ドロップレット希釈」をクリックすると、サンプル井戸の正しい焦点を特定します。
    6. バッファー液滴に5倍口径の作動ストック10 μLを加え(ステップ3.4.3参照)、ピペットを上下に優しく動かして溶液を混ぜます。
    7. 蓋を閉めて。
    8. 動き、信号、彩度、シャープネスの値が安定かつ最適かどうかを確認するために、計器の設定を確認してください。
      注意:最適値は青色で表示され、外れ値はオレンジ色で表示されます。
    9. AcquireMPソフトウェアで「録画」をクリックして60秒の動画を録画してください。
    10. 結果ファイル(.mpr)を説明的なタイトルとタイムスタンプとともに保存します。
  5. キャリブレーションカーブを作成します。
    1. DiscoverMPソフトウェアを開きます。
    2. 測定欄で「+ open」ボタンをクリックし、ステップ3.4.10のキャリブラント結果ファイルに移動します。
    3. 掲載されているタンパク質標準ファイルをダブルクリックして結果をご覧ください。
    4. プロット構成では、コントラスト境界をそれぞれ0.00000と-0.03000に調整します。
    5. 最初の4つのタンパク質標準ピークに対して、カーソルを各ピークにドラッグして手動でガウス曲線を定義します。
    6. 「作成」をクリックし、「質量キャリブレーション」を選択します。
    7. キャリブラントヘッダーの下に、ステップ3.5.5の各フィッティングされたキャリブラントピークを、それぞれ既知の分子量86、172、258、344 kDaに割り当てます。
    8. キャリブレーション曲線のR2 が1.0近く、最大質量誤差(MME)が2%未満であることを確認しましょう。
    9. 「confirm calibration」をクリックし、キャリブレーション曲線ファイル(.mc)を保存してください。
      注意:質量フォトメーターは1時間ごとに再校正されるべきです。
  6. 低塩分および高塩分条件下で組換えSLFN14Mycフラグ タンパク質を解析します。
    1. 生理的塩条件下での標準サンプル分析には低塩脱塩バッファーを用い、APOタンパク質の特性評価には高塩脱塩バッファーを使用して50 nM組換えSLFN14Myc-Flag タンパク質(ステップ2.2.9参照)を50μL溶液で準備します。
    2. 50 nM組換えSLFN14Myc-Flag タンパク質混合物を21,300 x gで20〜25°Cで10分間遠心分離し、タンパク質集合体や粉塵を除去します。
    3. 横方向管理の際に、AcquireMPソフトウェアの「next well」をクリックしてください。
    4. 0.22μmのろ過済み低塩または高塩脱塩バッファー10 μLを井戸に注入し、蓋を閉じます。
      注意:このステップでフィルタリングしたバッファーと、ステップ3.6.1のSLFN14Myc-Flag サンプル希釈を準備したバッファと一致することが重要です。
    5. 「焦点を見つける」で「ドロップレット希釈」をクリックすると、新しいサンプル井戸の正しい焦点が判定されます。
    6. ステップ3.6.2から50 nM組換えSLFN14Myc-Flag タンパク質溶液10 μLをバッファー液滴に注入し、優しくピペットでサンプルを混合します。
    7. 蓋を閉じて、ステップ3.4.8で説明された最適な計器設定を確認してください。
    8. AcquireMPソフトウェアで「録画」をクリックして60秒の動画を録画してください。
      注:最適な質量分解能は、約1,000〜4,000カウントの60秒の動画から達成されます。
    9. 結果ファイル(.mpr)を説明的なタイトルとタイムスタンプとともに保存します。
  7. 組換えSLFN14Myc-Flag タンパク質の分子量と化学量論を計算します。
    1. DiscoverMPソフトウェア内の測定項目で、「+ open」ボタンをクリックするとステップ3.6.9の結果ファイルを選択します。
    2. キャリブレーションの中で、ステップ3.5.9で作成したキャリブレーションカーブファイルをダブルクリックしてキャリブレーションを適用してください。
    3. 各ピークにカーソルをドラッグすることで、観測された各SLFN14Myc-Flag 種に対してガウス曲線を手動で定義し、分子質量値を計算します。
    4. 各オリゴマー種の平均分子量を、3つの独立した測定値と対応する標準偏差から計算します。
    5. SLFN14Myc-Flagプロトマーの理論質量値の整数計算分子量を評価することで組換えSLFN14Myc-Flagタンパク質の化学量論を決定します。
      注:SLFN14Myc-Flag モノマーの理論質量は107.5 kDa、ダイマーは215 kDa、トリマーは322.5 kDa、テトラマーは430 kDaです。

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結果

全長組換えヒトSLFN14Myc-Flagタンパク質の一時的な遺伝子発現を目的に設計された哺乳類ベクターが図1に示されています。2段階の精製ワークフローは、HEK293細胞からSLFN14Myc-Flagタンパク質を分離する方法を示しています(図2A)。精製されたSLFN14Myc-Flagタンパク質の成功した代表的な変性ゲルが図2Bに示されています。親和性クロマトグラフィーのステップは、SLFN14 C末端フラグタグと抗フラッグ結合樹脂とアンチフラッグ抗体結合樹脂間の選択的かつ高い親和性相互作用に依存し、ほとんどのサンプルクリーンアップを行います。その後のサイズ排除クロマトグラフィーステップでは、SLFN14Myc-Flagタンパク質を溶出するために使われた過剰な3xFlagペプチドをアンチフラッグ親和樹...

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ディスカッション

このタンパク質生産プロトコルの性能と多様性を強調している重要なステップがいくつかあります。組換えタンパク質の収量を最大化するために、異物プラスミドDNAの取り込みが高く、懸濁培養して培地全体の細胞密度を最大化できるHEK293細胞を使用します。PEIトランスフェクション試薬は、他の一般的な試薬と比べて比較的低コストで高いトランスフェクション効率を達成できるため、この大規模なトランスジーン送達プロトコルで使用されています17。トランスフェクトされた細胞は短期間インキュベートされ、組換えタンパク質の過剰発現を可能にしつつ、ヌクレアーゼ固有の細胞毒性効果を制限します。過剰発現した組換え遺伝子が極端な細胞傷害や細胞死を引き起こす場合、トランスフェクション後の潜伏時間を48時間から24時間に短縮することが有益かもしれません。プロテアーゼ阻害剤の存在下での迅速な細胞溶解、溶解液の清算、タンパク質捕獲により組換えタンパク質分解が最小限に抑えられます。しかし、プロテアーゼ感受性タンパク質では...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

ピロン研究室のメンバーはこの原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所の外部研究プログラム、国立一般医科学研究所(NIGMS;R35GM147123 M.C.P.へ)ベイラー医科大学に移籍し、ニューヨーク州立大学バッファロー校に移籍しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-メルカプトエタノール(B-Me)シグマM3148-500ML14.3 M 解 tock
MP 2024 R2を取得レフェイン/データ取得ソフトウェア
アデノシン-5'-三リン酸二ナトリウム塩三水和物(ATP)ケム・インペックス・インターナショナル00015-100G溶液をpH7.0に調整する
アンチフラッグM2親和性ゲルミリポールA2220アンチフラッグアフィニティ樹脂
塩酸ベンザミジン水和物シグマB6506-25Gプロテアーゼ阻害剤
広範囲タンパク質標準(10-250 kDa)バイオ・ラッドP7719Sプレスティンドタンパク質標準
伯爵夫人3インビトロジェンA49862自動セルカウンター
ディスカバーMPv2024 R2レフェイン/データ分析ソフトウェア
ダルベッコのリン酸塩緩衝塩水コーニング21-031-CV1x溶液ストック
DYKDDDDKペプチドサーモフィッシャー・サイエンティフィックA368053xフラッグペプチド
FreeStyle 293-Fセルサーモフィッシャー・サイエンティフィックR79007哺乳類懸浮細胞
ジーニアストMヌクレアーゼDMF提出サンタクルーズsc-391121Bユニバーサルヌクレアーゼ
ハイクローンCDM4HEK293メディアシチバSH3085802血清フリー培養培地
HyClone SFM4Transfx-293 メディアシチバSH3086002一時型トランスフェクション媒体
イマーソル518Fツァイス4Y00-R0DY-1007-3BF3浸漬油
イソプロピルアルコールマクロン・ファイン・ケミカルズ3032-02
Laemmli サンプルバッファバイオ・ラッド16107372倍の溶液ストック
ロイププチンVWRJ580-25MGプロテアーゼ阻害剤
塩化マグネシウム六水和物(MgCl2)フィッシャー・サイエンティフィックM33-500
MassFerence P1 レフェインMP-CON-41033500倍口径ストック
MassGlass UCサンプル準備キットレフェインMP-CON-21022スライドとガスケット
マイクロバイオスピンカラムバイオ・ラッド7326204空のポリプロピレンスピンカラム
ミリQ IQ 7000システムミリポールZIQ7000T0CタイプI超純水
ミニプロテアンTGXのシミフリージェルバイオ・ラッド4568086SDS-PAGE 4-15%
湿度、冷却、CO2を備えたミニトロンインフォラーズ72175インキュベーターシェーカー
MPアライメントキットレフェインMP-CON-21019アライメントツール、ソフトチップピンザー、磁石
ナノフォトメーターインプレンNP80UV-vis分光光度計
ニューテータークレイ・アダムズ・ブランド421105
ペプスタチンAサンタクルーズsc-45036Bプロテアーゼ阻害剤
フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)リサーチプロダクツ・インターナショナルP20270-25.0プロテアーゼ阻害剤
ポリカーボネートシェイクフラスコ デュラン・ウィートン・キンブルWPFBC1000Sベントされたバッフルベースフラスコ
ポリエチレンニミン(PEI)MW 40,000ポリサイエンス24765トランスフェクション試薬
量子ビット4フルオロメーターサーモフィッシャー・サイエンティフィックQ33226
量子ビットRNA高感度アッセイキットサーモフィッシャー・サイエンティフィックQ32852RNA特異的染料を用いた定量化
シンプリブルー セーフステインサーモフィッシャー・サイエンティフィックLC6065クーマッシー G-250
SLFN14発現プラスミドDNAオリゲネRC226257人間タグ付きORFクローン
塩化ナトリウム(NaCl)ミリポール1.37017
トリス、pH 7.4サーモフィッシャー・サイエンティフィックJ60202。K21 Mの緩衝溶液ストック
トリス(2-カルボキシエチル)塩酸ホスフィン(TCEP)ゴールド・バイオテクノロジーTCEP10TCEP
トライトン X-100VWRM143-1L洗剤
トリパンブルー染色サーモフィッシャー・サイエンティフィックT102820.4%溶液在庫
トゥイーン20VWR0777-1L洗剤
トゥーMPレフェインMP-PRO-00001質量フォトメーター
ゼバ40Kデサルチン柱サーモフィッシャー・サイエンティフィックA57759サイズ排除クロマトグラフィー

参考文献

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