肝線維症マウスモデルにおける肝星状細胞形態のマッピング

サマリー

本プロトコルは、肝臓の完全な肝組織における星状細胞の形態を可視化・モデル化するための包括的な画像パイプラインを提供します。このアプローチは、マウス遺伝学を用いた線維芽細胞の蛍光標識、in situ 肝灌流ベースの組織調製、そして光学的透明性を得るための修正iDISCO組織クリアリング法を組み合わせています。

要約

組織内に常在する線維芽細胞は、組織全体の線維化を引き起こす細胞の原動力です。肝臓内では、特有の「星状」形態を持つ常駐性ペリサイト(HSC)が損傷時に線維性筋原線芽細胞を活性化し、肝瘢痕を形成します。数十年にわたる研究でHSC活性化の主要なシグナル伝達経路が解明されてきましたが、画像診断や解析の技術的制約により、それぞれの異なる樹状突起形態の機能的意義は依然として不明です。このプロトコルは、完全な肝組織におけるHSC形態を可視化・モデル化するための包括的な画像パイプラインを提供します。このアプローチは、マウス遺伝学を用いたHSCの蛍光標識、in situ 肝灌流ベースの組織調製、そして数センチメートル厚の組織標本で光学的透明性を得るための改良型idisco組織クリアリング法を組み合わせています。クリアされたサンプルは最適化された共焦点顕微鏡プラットフォームで画像化され、画像データセットは個別のHSCを単一細胞解像度で三次元再構成するためのカスタマイズされた解析ワークフローで処理されます。このパイプラインにより、複雑な肝臓微小環境内のHSC形態の再現可能なマッピングが可能となり、樹状突起や隣接細胞との空間的関係も含まれます。肝臓以外にも、このワークフローは肺、腎臓、腸、心臓など他の臓器の線維芽細胞にも適応でき、これらの器官では常駐間葉系細胞が疾患において同様の線維形成的役割を示します。したがって、提案された枠組みは線維芽細胞の構造と機能の関係および治療的脆弱性を探る比較臓器間研究のための方法論的基盤を確立します。

概要

線維症、すなわち組織の病理的瘢痕は、ほぼすべての慢性臓器疾患の最後の共通経路であり、先進国で死亡の約40%を占め^{ています。}肝臓では、線維化はウイルス性肝炎、アルコール使用、あるいは現在米国成人の30〜40%に影響を及ぼす代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)などの慢性的な疾患から発生します。肝臓への慢性的な損傷とそれに伴う進行性線維症は、肝硬変、肝不全、肝細胞癌などの末期肝疾患のリスクを大幅に高めます^。3、4、5。

肝星状細胞(HSC)は肝の恒常性と線維形成に中心的な役割を果たします。健康な肝臓では、HSCは静止状態のビタミンA貯蔵状態にあり、肝細胞および肝全体の恒常性に寄与^します。これはHSC枯渇研究によって明確に示されており、健康な肝臓のほぼすべてのHSCを除去すると肝臓質量が減少し、^肝再生が著しく制限されます^7,8。損傷後、HSCは増殖し損傷部位に移動し、過剰な細胞外マトリックス(ECM)を生成して線維化瘢痕を形成します。線維化性肝臓の活性化されたHSCは、がん関連線維芽細胞の原因でもあり、肝細胞癌(9,10,11,12)において腫瘍促進の役割を果たす。静止型HSCは、小さな細胞体から長距離投射が伸びる独特のニューロン様形態を持っています。HSCは線維症¹³で活性化されると平らでシート状の筋線維芽細胞状に変化します。数十年にわたる研究でHSCのECM産生を制御するシグナル伝達経路は解明されてきましたが、その独特な神経形態の機能的意義、調節方法、HSCニッチ内での相互作用を促進する可能性、そしてHSCの線維原性や疾患に寄与するかどうかは依然として不明です(^14,15)。

HSCの形態を可視化する現在の方法は、in vitro 培養細胞または in vivo 組織切片の二次元(2D)画像に限られており、細胞体の長さにわたり細胞体の長さに及ぶ投影でHSCの形態全体を捉えることは稀です。さらに、最も一般的に使われるHSCマーカーであるデスミンは、免疫蛍光染色においてHSCの独特なニューロン様形態を完全に捉えることができません。なぜならデスミンは細胞骨格タンパク質であり、^HSC16内の中間フィラメントのみを標識するためです。これらの方法論的課題は、これまでのところ、HSCの形態やそれらの細胞相互作用を自然な文脈で三次元(3D)的に単一細胞解像度で完全に捉える能力を妨げていました。その結果、HSCの形態が機能状態や隣接する細胞タイプとの相互作用とどのように関連しているかという根本的な問題は未解決のままです。

本記事では、保存状態の完全な肝組織におけるHSC形態を可視化・モデル化するための革新的かつ包括的な画像診断および解析パイプラインを提示します。この手法は、(1) 遺伝レポーターマウスモデルを用いたHSCの蛍光標識、(2) 組織構造と細胞関係を保つためのin situ肝灌流・固定最適化、(3) 光学的透明性を達成するための修正iDISCOベースの組織クリアリング^{プロトコル、(}4) 深部組織画像キャプチャのための高解像度共焦点顕微鏡、(5) 3D画像再構築および定量のためのカスタマイズされた計算ワークフロー個々のHSCの解析。プロトコルは組織の大きさや時間的コミットメントに一定の制約を課しており、これらを考慮しなければなりません。このプロトコルは、HSCの複雑な3D構造を捉え、隣接する血管細胞、免疫細胞、実質細胞との空間的関係をマッピングするための堅牢かつ再現性の高いフレームワークを提供します。ここで紹介された肝臓の戦略とパイプラインは、他の臓^{器にも容易}に適応^{可能です。}

プロトコル

本研究で使用されたすべてのマウス実験は、マウントサイナイ大学アイカーン医科大学の動物ケア・利用委員会によって承認されています。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. tdTomato(TdT)標識されたHSCを持つマウスの生成

1. Tg(lox-stop-lox-TdTomato)×Tg(Lrat:Cre)の繁殖者(ジャクソン研究所株#007914²⁰ およびMutant Mouse Resource & Research Centers(MMRRC)株#069595^21-JAXを設置します。
   注意:3週間後には猫砂が出ることを想定してください。繁殖にはLratCreのメスを使用してください。雄の生殖細胞内でCreの発現が確認されています。
2. 尾とF1遺伝子型の幼苗を採取してTg(Lrat:Cre)を識別する。肝星状細胞でTdTomato蛍光色素を選択的に発現するTg(LSL-TdT)マウス。

2. 現場 での肝灌流および固定

1. 手術前のセットアップ
   1. マウス麻酔用のケタミン/キシラジン混合液を、ケタミン2mL、キシラジン1mL、水7mLを混ぜて調合します。
      注意:ケタミンは規制薬物であり、実験室での使用には適切な許可と規制が必要です。
   2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)の灌流溶液を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に準備します。
   3. ペリスタルティックポンプを設置するには、1本のPBSをチューブ内に流し、流量を2 mL/minに設定します。
      注意:チューブ内に気泡がないか必ず確認してください。
2. マウスの体重を測って、注射すべきケタミン/キシラジンの量を決めてください。
3. ケタミンとキシラジンの混合物をマウスの腹腔内に注射します。
   注意:マウスの重さ20gごとに200μLの混合物を注入してください。
4. ネズミを蓋付きの容器に入れ、完全に麻酔されるまで約20分待つ。
   注意:反射がないかマウスのつま先をつまんで確認してください。灌流開始時にマウスがまだ生きていることを確認してください。
5. マウスをガラス容器から仰向け状態で手術用プラットフォームへ移します。
   注意:PFAは有毒で揮発性があります。したがって、化学フード内で灌流を行うこと。PFAフロースルーは機関のバイオセーフティガイドラインに従って適切に収集・廃棄してください。
6. マウスの足のひらを鉗子でつまみ、ネズミに反射や痙攣の動きがないか確認します。
7. 手のひら4本を針で刺してネズミの腹部を広げます。
8. 腹部に70%エタノールをスプレーして毛を濡らします。
9. 鉗子を使って腹部の中央の皮膚を持ち上げ、後ろ脚と合わせてから両方の層の皮膚を切り始め、腹部を露出させます。
10. PBS湿式綿棒を使って腸や他の臓器を横に動かし、左葉を持ち上げます。
11. 左葉と尾状葉の間に付着している膜を慎重に切断します。
12. 左葉の上部の基部を縫合糸で結びます。
13. 縫合結び目の下の左葉を切り、左葉を組織サンプルの採取と処理のために別に保管します。これは実験的ニーズに応じて(例えば液体窒素への直接スナップ凍結、光学切削温度(OCT)化合物への埋め込み、ホルマリン固定など)。
14. PBS湿った綿棒を使って肝臓を動かし、門脈を露出させます。
15. カテーテル針を門脈の長さのほぼ中間あたりに慎重に挿入します。
    注意:カテーテル挿入を助けるため、マウスの体を体の下にピンセットを置いて持ち上げ、表面が平らになるようにしてください。挿入前にカテーテルの針をできるだけ平行に整列させてください。
16. カテーテルの針を抜いてください。
    注意:挿入成功を示すために、カテーテルを通る血液の逆流を確認してください。
17. 灌流ポンプを2 mL/minの流量で開始し、チューブとカテーテルを接続し、肝臓に1xPBSを20 mL灌流します。
    注意:カテーテルが完全に血液で満たされ、チューブが灌流バッファーで満たされていることを確認してから接続し、気泡がシステム内に入らないようにしてください。
18. 肝臓の上にある肺動脈を止血鉗で固定し、1倍のPBSが心臓を通過するのを防ぎます。
19. 下大静脈を切って圧力の蓄積を解放します。
20. ポンプの速度を5 mL/minに調整してください。
    注意:灌流を終えるまで約15分の間隔を空けてください。
21. ポンプを止めて貯水槽を4%PFAに変えます。
    注意:ポンプを止めてリザーバーにまだ液体がある状態でチューブ内に気泡を入らないように注意してください。
22. 肝臓に4%PFAを25mL灌流してください。
23. 灌流が完了したら、連結組織を切断して周囲の臓器から肝臓を取り出します。
24. 肝臓を50mLの円錐形チューブに入れ、4%PFAを25mL充填します。
25. チューブを室温で1.5回転のベンチロッキングプラットフォームに水平に置き、1時間かけて溶液の動きを確保します。
26. レバーを1xPBSで3回、室温で1.5rpmのベンチロッキングプラットフォームで30分間洗います。
27. 肝臓は20mL 1x PBS、0.02% NaN₃ 、4°Cで保存します。
    注意:この段階で肝臓は少なくとも1年間長期保存してください。

3. iDISCO+ベースの組織クリアリング

注:iDISCO+プロトコルの元の説明は¹⁷でアクセス可能です

1日目:サンプル脱水

1. 肝臓サンプルを約0.5〜^{1 cmの}大きさの小片に切り分けます。
   注意:画像処理時に検出しやすくするために、異なるサンプルを異なる形にカットしてください。
2. 20%(ボル/ボリューム)、40%、60%、80%のメタノール希釈を水に分けて、別々のガラス瓶で準備します。
3. 肝臓サンプルをスクリュートップ付きのガラスバイアル(例:4〜7 mL)に入れます。
   注意:1つの7 mLガラスバイアルに最大6個の肝臓サンプルを置いてください。
4. 試料を_H2O系列のメタノール希釈液(20%(ボルト/ボリューム)、40%、60%、80%、80%を、室温でホイールローター上で8回転でそれぞれ1時間乾燥させ、遠心分離は行いません。
5. 試料をホイールローター上で100%メタノールで8回転で洗浄し、室温で1時間遠心分離せずに洗浄します。
6. サンプルを4°Cで30分から1時間冷やします。
7. ガラス瓶に66%(vol/vol)のDCM希釈メタノールを準備します。
   注意:毎回新しい希釈を準備してください。DCMはポリスチレンなどのプラスチックを溶かす可能性があるため、ガラス製の円筒を使って溶液を準備してください。
8. 66%DCM/メタノール溶液に、ホイールローテータ上で8rpm室温で一晩インキュベートし、遠心分離は行われません。
   注意:溶液を加えた後にサンプルが浮かんで上に浮かぶ注意が必要です。

2日目:サンプル漂白

9. 試料を100%メタノールでホイールローター上で8回転/分で2回洗浄し、室温でそれぞれ1時間遠心分離はしません。
10. サンプルを4°Cで30分から1時間冷やします。
11. 試料を冷やした5% H₂O₂ のメタノール(30% H₂O₂ から5 volumeのメタノール)で漂白し、遠心分離せずにホイールローター上で8回転、遠心分離せずに4°Cで一晩漂白します。
    注意:毎回新しい解決策を用意してください。

3〜5日目:サンプル透過化

12. メタノール/H₂Oシリーズで再水和:80%、60%、40%、20%、室温で8回転のホイールローター上で1時間、遠心分離なしに1時間PBSを1回投与します。
13. 試料をPTx.2(表1)で2回、室温のホイールローター上で8回転で1時間ずつ洗浄し、遠心分離は行いません。
14. サンプルを透過化溶液(表1)で37°Cで2日間培養します。

5日目から17日目:免疫標識

15. サンプルをブロッキング溶液(表1)で37°Cで2日間ブロックします。
    注意:ドンキー血清の不安定性のため、毎回新しいブロッキング溶液を用意してください。残ったブロッキング液は4^{°Cで最大1ヶ月保存します。}
16. PTwH(表1)で希釈した一次抗体で、5% DMSOおよび3% Donkey Serumを37°Cでホイールローテーター上で5回転で培養し、遠心分離は4日間行いません。
    注意:まず1:500の一次抗体希釈から始めてください。
17. 試料をPTwHで4〜5回、室温のホイールローター上で8回転で1時間ずつ洗浄し、遠心分離はせずに行います。
    注意:オプションとして、サンプルは一晩洗うために放置してください。
18. サンプルを二次抗体と、PTwHで希釈したヨウ化プロピジウムを3%ドンキー血清で37°Cのホイールローター上で5回転で培養し、遠心分離は4日間行わずに行われます。
    注意:まず1:500の二次抗体希釈から始めてください。5 mg/mLのプロピジウムヨウ化物ストック溶液から1:250のヨウ化プロピジウム希釈液を使用します。
19. 試料をPTwHで4〜5回、室温のホイールローター上で8回転で1時間ずつ洗浄し、遠心分離はせずに行います。
20. サンプル洗浄液をPTwHで一晩、室温のホイールローターで8回転で遠心分離せずに放置します。

18日目:クリアリング

21. 試料を_H2O系列のメタノール希釈液で脱水し、20%(ボリューム/ボリューム)、40%、60%、80%を室温でホイールローター上で8回転/分、それぞれ1時間ずつ乾燥させ、遠心分離は行いません。
22. 試料を100%メタノールを1時間、室温のホイールローターで8回転で1時間洗浄し、遠心分離はせずに行います。
23. 試料を66%(vol/vol)のDCM希釈メタノール中で、室温でホイールローター上で8回転/分の速度で3時間キュベートし、遠心分離は行いません。
24. 試料を100% DCMで2回、室温のホイールローターで8rpmで15分間洗浄し、遠心分離はせずに行います。
25. 画像診断前に、サンプルを室温で一晩DVEで培養します。
26. サンプルは染色信号に影響を与えることなく、最大1年間長期間DBEで保管してください。

4. 共焦点顕微鏡イメージング

1. クリアしたサンプルを、#1.5のガラス底を持つ35mmのガラス底皿に入れます。
2. 皿にエチルシナ酸塩を入れてサンプルを完全に浸します。
3. アンテナを共焦点に置き、最も明るい信号を出す最適な平面を特定するためにピントを調整します。
4. 最も明るい平面でタイル画像を取得し、サンプルの広い範囲を1024×1024フォーマット、速度600でキャプチャします。
   注意:タイル画像には、撮影時間とファイルサイズを減らすために、低い対物レンズ(10倍または20倍)を使いましょう。
5. タイル画像を基に、より高解像度のZスキャンを取得するために関心のある領域を選択します。
6. 透明化した組織を通して、顕微鏡の最高解像度で組織全体を覆うZスキャンを1024×1024のフォーマットと速度600で撮影します。
   注意:油浸漬ではHSCの解像度を最大化するために40倍の対物レンズを使いましょう。
7. 画像ファイルをLIF形式で保存し、FijiまたはImarisViewer 11.0.0を使ってファイルを閲覧できます。

5. 3D再構築のための画像解析および個々のHSCの定量的解析

1. ImarisFileConverter 10.2.0を使って画像ファイルをIMS形式に変換できます。
2. Imaris 10.2.0のSurface Modelを使って画像内の物体を検出してください。
3. 作成ウィザードを使って、選んだ注目の3D領域を解析し、画像全体に適用してください。
   注意:これを活用して分析プロセスを加速させてください。
4. ソースチャンネル、絶対強度を選択し、スムースボタンのチェックを外して画像全体の強度閾値を定義します。
5. 画像内のすべての物体をキャプチャするように閾値を修正します。
6. ボクセルの数を使ってデブリオブジェクトをフィルタリングします。
7. ウィザードを終了し、統計ボタンを押すとすべての統計的測定値が表示されます。

結果

マウス肝臓の灌流と固定が成功した場合は、肝臓が均一な淡いベージュイエローの色をとることで表され、血液の効率的な除去と固定剤の浸透を反映しています(図1A,B)。不適切な灌流は血塊の濃赤色または茶色の領域を生み出し、光学的明瞭さを低下させ、これらのサンプル領域で高い背景信号を引き起こします(図1C)。

組織クリアリング中、組織サンプルは灌流から二次抗体培養まで淡いベージュ色の外観を保ちます。組織サンプルは二次抗体培養後、前回よりも白い色に変化します。試料をDBEでインキュベーションすることで完全な光学的透明性が得られます(図2)。組織は透明で、硬くガラスのような質感を持つため、高解像度の深部組織画像撮影のために扱いやすいです。

TdTomato標識HS...

ディスカッション

このプロトコルは、完全な肝組織におけるHSC形態の三次元可視化および定量解析へとつながる再現可能かつ適応可能なサンプル準備パイプラインを説明しています。遺伝子蛍光細胞標識、 in situ 肝臓灌流法、改良されたiDISCO+クリアリング法の統合により、肝微小環境の空間構造を保持しつつ、単一細胞分解能で大量の組織体積のイメージングが可能になります。

この方法の成功における重要なステップは効率的な肝臓灌流です。不完全な灌流は血液や脂質を閉じ込め、透明化が悪くなり自己蛍光の増加を引き起こすことがあります23,24,25。カテーテルの挿入が成功すると、血液の逆流が可能になります(図1A)。逆流がない場合は、灌流中に肝臓に気泡が入り、血管を塞ぎ肝臓への灌流を防ぐ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗RFP抗体、ラビット、事前吸着	ロックランド	600-401-379
4チャンバー35mmガラス底皿、20mmマイクロウェル、#1.5カバーガラス	セルヴィス	D35C4201.5N
AnaSed注射(キシラジン注射)	アコーン社	NDC 593990110-20	20 mg/mL
円錐形遠心分離機チューブ:50ml	ファルコン	352098
綿棒	メドライン	MDS202000
カーブドロッキング 止血鉗	フィッシャー・サイエンティフィック	16-100-117
Cy3結合型AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG(H+L)	ジャクソン免疫研究	712-165-153
繊細な操作用シザーズ 4.75インチ カーブドシャープ/ブラント	ロボズ外科機器	728501
ジベンジルエーテル(DBE)、98%	シグマ・オルドリッチ	108014
ジクロロメタン(DCM)およびnbsp;≥99.8%	シグマ・オルドリッチ	270997
ジメチルスルホキシド(DMSO)、99.9%	シグマ・オルドリッチ	D8418
ドンキー抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 647	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A31573
ドンキー血清	EMDミリポア	S30
エチルシナメート、99%	シグマ・オルドリッチ	112372
超細微解剖用のハサミ;24mmブレード	フィッシャー・サイエンティフィック	NC9232515
F4/80 モノクローナル抗体ラット	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	14-4801-82
フィジー	NIH
鉗子	フィッシャー・サイエンティフィック	NC9214139
グリシン	バイオ・ラッド	1610718
ヘパリンナトリウム塩	ケム・インペックス	29984
ハイバイド混合オーブン	トライアド・サイエンティフィック	マキシ14
過酸化水素、30%	シグマ・オルドリッチ	31642
Imaris 10.2.0ソフトウェア	オックスフォード・インストゥルメンツ
ImarisFileConverter 10.2.0ソフトウェア	オックスフォード・インストゥルメンツ
ImarisViewer 11.0.0	オックスフォード・インストゥルメンツ
IVカテーテル	エクセル・インターナショナル社	EXE 26751
ケタミン、塩酸塩注入	デクラ	B8U4	100 mg/mL
LAS X 4.4.0.24861ソフトウェア	ライカ
ライカ ステラリス 8 コンフォーカル顕微鏡	ライカ
メタノール、HPLCグレード	フィッシャー	A452-2
多目的回転子	サイエンティフィック・インダストリーズ社	モデル151
針(27G x 1/2インチ)	BD	305109
パラホルマデヒルド、粉末、95%	シグマ・オルドリッチ	158127
蠕動ポンプ	ギルソン	モデル・ミニパルズ3
ペリスタルティックポンプチューブ、MasterFlex	サーモ・サイエンティフィック	96400-16	3.1mm 内径 x 7.6m L/s 過酸化水素硬化シリコーン精密ポンプチューブ、サイズ L/S 16、1/8インチ ホースバーブ
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	シチバ	SH30256.01	無菌、pH 7.0 - 7.2、カルシウム、マグネシウムなし
ヨウ化プロピジウム、94.0%(HPLC)	シグマ・オルドリッチ	P4170
レイザーブレード	アメリカン・ライン	66-0362
ロッキングプラットフォーム	VWR	モデル200
アジ化ナトリウム、99.5%	シグマ・オルドリッチ	S2002
縫合	エティコン	J109T
注射器(1 mL)	BD	309628
トライトンX-100	シグマ	T9284
トゥイーン-20	サーモ・サイエンティフィック	J20605-AP
バイアルはねじ込み式のトップで、ソリッドキャップとアルミライナー、組み立て済み	シグマ・オルドリッチ	27470-U	7mL、琥珀色のガラスバイアル、過量投与および時間;H 17 mm & times;60mm、15-425用のねじ