Aβ1-42マウスモデルにおけるトリプトリドが海馬ゲフィリン、コリビスチン、オートファジーに与える効果の評価

サマリー

本プロトコルは、Aβ1-42誘導型アルツハイマー病様マウスモデルの集約およびトリプトリドが海馬の抑制性シナプス関連タンパク質、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達、オートファジー関連マーカーに対する効果の評価を記述します。

要約

アルツハイマー病はシナプス機能障害と関連していますが、候補介入後にAβ誘発性病理が阻害性シナプス関連タンパク質やオートファジー関連シグナル伝達にどのように影響するかを評価する標準化された手順は限られています。本プロトコルは、Aβ1-42誘発性アルツハイマー病様マウスモデルの確立と、トリプトリドが海馬ゲフィリン、コリビスチン、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達、オートファジー関連マーカーに与える影響を評価するワークフローを記述しています。成体のC57BL/6Jマウスは、集合誘導条件下で調製されたAβ1-42の両側脳室内注射を受け、その後、PI3K阻害剤LY294002の有無にかかわらず毎日腹膜内トリトリド投与を行います。空間学習と記憶はモリス水迷路テストを用いて評価されます。海馬神経損傷およびAβ沈着はヘマトキシリンおよびエオシン染色およびAβ免疫組織化学で評価され、海馬溶解液はウェスタンブロッティングで解析され、ゲフィリン、リン酸化ゲフィリン、コリビスチン、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達タンパク質、LC3-II/I、p62を定量化します。主な手技的考慮事項には、標準化されたAβ1-42調製、正確な立体誘導注入、一貫した行動検査条件、盲検対象領域選択、標準化された画像および密度測定解析が含まれます。このワークフローを用いると、Aβ1-42投与により空間学習および記憶の欠損、海馬神経障害、Aβ沈着、ゲフィリンおよびコリビスチンの発現減少、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達の変化、LC3-II/Iおよびp62の蓄積増加が生じました。トリプトリドはこれらの行動的、組織学的、分子的変化を部分的に逆転させ、LY294002その効果を弱めました。このプロトコルは、Aβ誘発性の海馬分子変異や候補介入の評価に用いられますが、このモデルはヒトアルツハイマー病の慢性的かつ多因子的な進行を再現しないことを認識しています。

概要

アルツハイマー病(AD)は、認知機能の低下、記憶障害、行動障害を特徴とする進行性の神経変性疾患であり、高齢者の認知症の主な原因の一つです。アミロイドβ(Aβ)沈着、タウ病理、シナプス機能障害、神経炎症、タンパク質恒常性の障害などがADの病因に広く関与しているとされていますが、Aβ関連毒性と抑制性シナプスタンパク質障害の分子メカニズムは完全には解明されていません。1,2,3,4 .抑制性シナプス機能障害は、神経回路における興奮と抑制のバランスを乱し、ネットワークの不安定さや認知障害に寄与する可能性があります。しかし、Aβ誘発性AD様病理条件下で抑制性シナプス関連スキャフォールディングタンパク質を調節する細胞内シグナル伝達イベントについては、さらなる説明^{が必要です。}

ゲフィリンは主要なシナプス後スキャフォールディングタンパク質であり、シナプ^ス後部位6においてグリシン受容体やγアミノ酪酸タイプA受容体を含む抑制性神経伝達物質受容体を固定・安定化させます。コリビスチンはARHGEF9でコードされるグアニンヌクレオチド交換因子であり、ゲフィリンと相互作用し、阻害性シナプス成分のクラスタリングおよび膜局在を促進します⁷。したがって、ゲフィリンとコリビスチンの機能的相互作用は、抑制性シナプスの組織化、維持、可塑性に不可欠です。このタンパク質複合体の破壊は抑制神経伝達を損ない、認知障害の一因となる可能性があります。特に、ゲフィリンの安定性とシナプスクラスタリングはリン酸化依存的なメカニズムによって調節可能です。Aβオリゴマー関連シグナル伝達は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β(GSK-3β)などのキナーゼに影響を与えることが報告されており、これらはセリン270でのゲフィリン酸化を促進し、その結果としてゲフィリンのクラスタリングや分解に影響を与える可能性があります。これらの発見は、キナーゼ媒介によるゲフィリンの調節が、Aβ関連病変と抑制性シナプ^{ス機能障害}との重要な分子関連を示す可能性を示唆しています^8,9。

PI3K/Akt経路は、神経細胞の生存、シナプス可塑性、タンパク質恒常性、オートファジー調節に関与する重要な細胞内シグナル伝達経路です。AKT活性は抑制的なリン酸化を通じてGSK-3βを抑制し、神経機能やシナプス安定性に関わる下流基質を調節します。PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達の調節異常は、AD関連神経障害に関与し、シナプス障害および異常なタンパク質分解の両方に寄与する可能性があります(^10,11)。同時に、オートファジーは損傷した細胞小器官や誤った折りたたみタンパク質を除去する重要な細胞内分解経路です。オートファジー-リソソーム機能障害は、AD¹²におけるAβ蓄積、タウ病理、神経障害と密接に関連しています。しかし、LC3-II/Iの変化だけでは、オートファゴソーム形成の増加と自己吸収分解の障害を区別することはできません。したがって、オートファジーに関連するフラックス変化をより正確に評価するためには、P62のような追加のマーカーが必要です。これらの観察結果は、同じ実験枠組み内でPI3K/Akt活性、GSK-3β介現ゲフィリン調節、オートファジー関連マーカーを検証する必要性を支持しています。

トリプトリドはトリプトリジウム・ウィルフォーディから単離された生物活性ジテルペンのトリエポキシドで、抗炎症作用、免疫調節作用、神経保護効果が報告されています¹³。過去の研究では、トリプトリドが認知機能を向上させ、抑制性シナプス関連タンパク質をAD様モデルで保存できることが示唆されています。しかしながら、トリプトリド処理、PI3K/Akt経路活性化、GSK-3β介在ゲフィリン酸化、コリビスチン発現、オートファジー関連タンパク質の変化との機構的関係は完全には定義されていません。トリプトリドがAβ1-42誘導型AD様マウスモデルにおいて、PI3K/Akt/GSK-3β関連機構を通じて海馬のゲフィリンおよびコリビスチンの発現を調節するかどうかは不明である^14,15。

APP/PS1や5xFADマウスなどの慢性トランスジェニックADモデルやタウオパシーモデルと比較して、Aβ1-42の脳内注入は、Aβに関連する海馬損傷や認知障害を誘導するための比較的迅速かつ技術的にアクセスしやすいアプローチを提供します。このプロトコルは、実験目的が短期的なAβ誘発性神経毒性、海馬分子変化、および定義されたシグナル伝達経路に対する介入関連効果を評価することである場合に適しています。しかし、このモデルはヒトADの慢性アミロイド産生、タウ病理、血管変異、神経免疫複雑性、加齢依存性の進行を再現しません。したがって、このプロトコルで得られた結果はAβ誘発性AD様病理として解釈され、理想的には慢性トランスジェニックモデル、タウ関連モデル、またはヒト由来の神経系で検証されるべきです。Aβ病理、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達、抑制性シナプス関連タンパク質、オートファジー関連異常がAD様病理と関連しているという既存の証拠があるにもかかわらず、行動検査、海馬組織学的評価、Aβ免疫組織化学、阻害性シナプス関連タンパク質の解析、キナーゼシグナル伝達評価、オートファジー関連マーカーの検出を単一のAβ1-42誘導介入モデル内に統合したプロトコルはごくわずかです。この方法論的なギャップは、候補化合物が細胞内シナプス関連タンパク質の変化を定義された細胞内シグナル伝達経路を通じて調節するかどうかの再現性評価を制限しています。

本プロトコルの目的は、トリトリドを用いてPI3K阻害剤LY294002の有無にかかわらず、Aβ1-42誘導AD様マウスモデルにおいて、海馬のゲフィリンおよびコリビスチン発現および関連する調節機構を評価する再現可能なワークフローを提供することです。本研究の原初的な貢献は、立体走行的Aβ1-42投与、シグナル伝達経路の薬理学的調節、Morris水迷路検査、組織学的および免疫組織化学的評価、阻害性シナプス関連タンパク質、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達、オートファジー関連マーカーのウェスタンブロット解析の統合にあります。仮説として、Aβ1-42誘発性AD様病理はPI3K/Aktシグナル伝達の障害、GSK-3β関連ゲフィリン酸化の変化、海馬ゲフィリンおよびコリビスチン発現の減少、オートファジー関連タンパク質の異常蓄積と関連している一方で、トリプトリド治療はこれらの行動的および分子異常を部分的に逆転させると考えられていました。

プロトコル

すべての動物処置は湖北医科大学医療倫理委員会の承認を受けており、動物のケアおよび使用に関する機関のガイドラインに従って実施されました(番号:SYXK2019-0031.)。動物、Aβ1-42、トリプトリド、LY294002、パラホルムアルデヒド、キシレン、エタノール、化学発光試薬を含むすべての処置は、実験用コート、手袋、保護用眼鏡など、適切な個人用防護具を着用して行うべきです。動物の死骸、脳組織、Aβ汚染消費品、パラホルマルデヒド廃棄物、キシレン廃棄物、ECL汚染物質は別々に収集され、機関のバイオセーフティおよび化学廃棄物処理規則に従って処分されるべきです。画像解析はImageJを用いて行われました。免疫組織化学的解析では、画像を8ビットグレースケールに変換するか、DAB陽性染色を分離するためにカラーデコンボリューションをかけました。同じ実験内のすべての画像に同じ閾値が適用されました。正染色面積、総関心領域、統合密度を測定しました。ウエスタンブロッティングでは、背景除去後にゲル解析ツールを用いてバンド強度を測定しました。標的タンパク質レベルはβアクチンに正規化され、リン酸化タンパク質は対応する総タンパク質レベルに正規化されました。

本研究で使用される試薬および機器は、製品名、製造元、カタログ番号またはモデル番号、ジェネリック記述を含む 材料表に記載されています。

動物と実験的グループ分け
湖北医科大学動物実験センターから、生後10〜12週、体重22〜28gの成体C57BL/6Jマウス48匹(オス24匹、メス24匹)を購入しました。マウスは22±2°Cの特定の病原体なし環境で飼育され、オートクレーブ水と標準的な齧歯類の食事を自由に利用しました。1週間の順応後、マウスはランダムに4つのグループに割り当てられました:対照群、Aβ1-42誘発性AD様モデル群、トリプトリド処理群、そして1群あたり12匹のLY294002プラストリトリド共治療群です。オスとメスのマウスは、できるだけ均等にグループ間でバランスが取られました。

Aβ1-42ペプチドは無菌生理食塩水に溶解され、最終濃度は10 μg/μLにされました。凝集誘導条件下でAβ1-42を調製するため、溶液は37°Cで7日間循環水浴で培養され、使用前に優しく混合され、注入中は氷で保管されました。この調製条件は、既に発表されたAβ42凝集手法から応用されたものです。本研究では、正確に注入されたAβ1-42バッチの凝集状態は、チオフラビンT蛍光、SDS-PAGE/ウェスタンブロッティング、または透過式電子顕微鏡法によって独立して特徴付けられていませんでした。したがって、本プロトコルにおける「集約Aβ1-42」とは、凝集誘導培養条件下で調製されたAβ1-42を指します。

モデル確立のために、マウスには10% ペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射し、0.04 mL/体重10 gの用量で麻酔しました。足の引き込みや角膜反射の欠如により、十分な麻酔が確認された。各マウスは立体誘導装置に固定され、頭皮はイオドフォール(75%エタノール)で剃られ消毒されました。頭蓋骨を露出させるために中央線切開を行い、立体顕微鏡でブレグマを特定しました。頭蓋骨はブレグマとラムダが同じ水平面上に配置されるように調整されました。

両側側心室注射はブレグマに対する以下の座標で行われました:前後方、−0.50 mm;内側は±1.00 mm;背腹側は頭蓋骨表面から−3.00 mmの位置にあります。合計2μLの集合Aβ1-42溶液をマイクロシリンジを用いて各側心室にゆっくり(2μL/分)注入しました。注射は組織損傷と逆流を減らすために一定の低速で行われました。注射後、針は約5分間そのままにしてからゆっくりと抜かれました。対照マウスは同じ座標で同じ手術手順で同量の無菌生理食塩水を受けました。注射後、頭皮の切開部は縫合糸や創傷クリップで閉じられ、マウスは意識を取り戻すまで温められた回復ケージに入れられました。術後の回復、体重、創傷治癒、グルーミング行動、運動活動、痛みや苦痛の兆候を毎日モニタリングしました。

モデルが安定していると判断された後、立体走位注射から2週間後に薬物介入を開始しました。トリプトリドは4%プロピレングリコールを含む生理食塩水に溶解し、30日間連続して1日1回腹腔内投与されました。トリプトリド治療群は1日0.2 mg/kgでトリプトリドを投与し、LY294002とトリトリド共治療群は30日間連続で0.3 mg/kgのトリプリドLY294002と共に0.3 mg/kgを1日投与しました。対照群とAβ1-42誘導型AD様モデル群は、同じ注入スケジュール¹⁶で等量の車両溶液を受けました。

モリス水迷路テスト
空間学習と記憶は、最終投薬後24時間後にモリス水迷路を用いて評価されました。水の迷路は、22°C±1°Cの水で満たされた円形のプールで構成されていました。 プールの周囲に視覚的な手がかりを配置し、実験中は変わらなかったままにしました。位置航行段階では、隠れたプラットフォームが目標象限に固定されました。毎日テストの前に、マウスは約30分間テストルームに慣れさせました。

この場所ナビゲーションテストは6日間連続で実施されました。各試練では、ネズミはスタート区画の一つからプールの壁に向かって優しく水に置かれ、最大60秒間隠されたプラットフォームを探すことを許されました。マウスが60秒以内にプラットフォームを見つけた場合、15秒の間プラットフォームに留まることが許されました。もしマウスが60秒以内にプラットフォームを見つけられなかった場合、プラットフォームに誘導され、空間記憶の定着を促進するために20秒間そこに留まることを許されました。各マウスは1日に4回の試行を行い、脱出遅延、泳ぐ距離、泳速は自動ビデオ追跡システムで記録されました。

7日目には、プローブ試験のためにプラットフォームが撤去されました。ネズミは元のプラットフォームの向かい側の象限から水中に放り込まれ、60秒自由に泳ぐことを許されました。プラットフォームの通過回数と目標区画内で過ごす時間の割合が記録されました。各試験の後、マウスは乾燥させられ、低体温症を防ぐために温まったケージに戻されました^17,18。

組織採取
行動試験の結果、マウスは0.04 mL/体重10 gの腹腔内注射で10%ペントバルビタールナトリウムを深く麻酔しました。各グループから8匹のマウスが無作為に選ばれ、海馬タンパク質抽出が行われました。彼らの脳は氷の上で素早く取り出され、両側の海馬組織は氷のように冷たい表面で解剖されました。海馬サンプルは事前に標識されたクライオビアルに入れられ、液体窒素でスナップ冷凍され、タンパク質抽出まで−80°Cで保存されました。

各グループの残りの4匹のマウスは組織学的および免疫組織化学的解析に使用されました。深麻酔下で、マウスはリン酸緩衝生理食塩水で心腔内灌流され、肝臓が白くなるまで続け、その後4%のパラホルマルデヒドを投与しました。脳は慎重に摘出され、4°Cの4%パラホルマルデヒドに24時間固定された。固定後、脳組織は病理実験プラットフォームに送られ、そこでパラフィン埋め込みとその後の切片が行われました。パラホルムアルデヒドは化学煙幕で取り扱われ、パラホルムアルデヒド含有廃棄物は機関の化学廃棄物処理要件に従って別途回収されました。

ヘマトキシリンとエオシン染色
パラフィンを埋め込んだ脳組織は、海馬を含む4μmの冠状切片に切り分けられました。セクションは60°Cで1時間焼き、各10分間キシレンで2回脱硫され、その後、エタノール溶液(100%、95%、85%、75%)で再水和され、その後蒸留水(各工程5分)で再水和されました。水分補給後、切片はヘマトキシリンで10分間染色し、流れる水道水で洗い流し、必要に応じて酸性アルコールで短時間(2秒)分化し、流れる水道水で青く染めました。切片はエオシンで5分間カウンターステインされ、エタノールで脱水され、キシレンでそれぞれ5分間2回透明化され、中性樹脂でマウントされました。

海馬の形態は光学顕微鏡で観察されました。画像は全グループで同じ海馬サブリージョンから20×倍率および画像パラメータを用いて取得されました。神経損傷は、^{グループ割り当てを}盲検した研究者によって画像解析ソフトウェアを用いて神経密度、核の核ピクーシス、無秩序な配列を評価しました。

Aβ免疫組織化学
Aβ免疫組織化学では、パラフィン切片を脱硫化し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色のために再水和しました。抗原回収は、pH8.0のEDTA抗原回出バッファー内で、電子レンジで高出力で3分間2回加熱することで行われました。区画は室温まで冷やし、PBSで3回それぞれ5分間洗濯しました。内因性過酸化物酵素活性は、室温で3%過酸化水素で15分間阻害し、その後PBS洗浄を3回、各5分間行いました。非特異的結合は5%の正常ヤギ血清で室温で30分間遮断しました。切片は4°Cで一晩、PBSで1:200希釈されたAβに対する一次抗体を用いてインキュベートされました。インキュベーション後、切片をPBSで3回5分間洗浄し、その後HRP結合二次抗体で室温で60分間インキュベートしました。PBSで洗浄した後、DAB基板を適用し、顕微鏡で色の現像を監視しました。茶色陽性染色が確認されると、反応は蒸留水で止められました。切片はヘマトキシリンでカウンターステインされ、エタノールで脱水され、キシレンでクリアされ、中性樹脂でマウントされました。画像は全グループで同じ海馬サブリージョンから、同じ顕微鏡設定を20×倍率で撮影しました。Aβ免疫染色は画像解析ソフトウェアを用いて定量化されました。陽性染色閾値はすべての画像で一貫しており、Aβの沈着は陽性染色面積を各顕微鏡フィールドの細胞数で割った値で計算されました。

海馬タンパク質抽出とウェスタンブロット解析
凍結された海馬組織は氷上に保管され、プロテアーゼおよびリン酸化阻害剤を含む氷冷のRIPA溶解バッファーで均質化されました。ホモジネートは氷上で30分間培養され、十分な溶解を確保するために断続的に渦巻きました。その後、溶液を12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、上清液を採取してタンパク質分析を行いました。タンパク質濃度は、製造元の指示に従ってBCAタンパク質アッセイキットを用いて測定されました。簡単に言えば、BSA標準物質とタンパク質サンプルを二重に準備し、BCA作動試薬と混合して37°Cで30分間培養し、マイクロプレートリーダーで562nmで測定しました。タンパク質濃度は標準曲線に従って計算され、すべてのサンプルは電気泳動²⁰前に最終濃度を同じに調整しました。

各海馬サンプルから20μgの総タンパク質を12%のSDS-PAGで分離し、PVDF膜に移しました。電気泳動は積層時に80V、分離時に120Vで行われました。タンパク質は100Vで4°Cで90分間湿式移送し、メタノール中に活性化されたPVDF膜に移されました。 移植後、膜は室温で1時間にわたり5%BSAで封じられました。その後、膜は4°Cで一晩、Gephyrin(1:1000希釈)、リン酸化ゲフィリン(1:500希釈)、Collybistin(1:1000希釈)、PI3K(1:1000希釈)、Akt(1:1000希釈)、リン酸化Akt(1:1000希釈)、GSK-3β(1:1000希釈)、リン酸化GSK-3β(1:1000希釈)、LC3(1:1000希釈)、p62(1:1000希釈)、およびβアクチン(1:5000希釈)に対する一次抗体を投与しました。TBSTで洗浄した後、膜はHRP結合二次抗体で室温(1:5000希釈)1時間インキュベートされました。タンパク質バンドはECL化学発光基質を用いて可視化され、化学発光イメージングシステムで捕捉されました。バンド強度は画像解析ソフトウェアを用いて定量化しました。総タンパク質発現レベルはβアクチンに正規化されました。補足資料には高解像度の未トリミングの西部ブロット画像が含まれていました。

統計データ
統計解析は統計解析およびグラフ生成ソフトウェアを用いて実施されました。データは図の凡例に示されているように、平均±標準差(SD)で表現されました。グループ割り当てを盲目にした研究者が行動検査と画像定量化を実施しました。モリス水迷路訓練フェーズにおける脱出潜伏期間は、グループとトレーニング日を要素とした二方向反復測定ANOVAを用いて分析しました。プローブ試験データ、組織学的定量化、免疫組織化学的定量化、ウェスタンブロット密度測定を一方向ANOVA検定を用いて解析しました。統計的有意は p < 0.05と定義されました。標準的な有意性表記は以下の通りで使われました:*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。正確なサンプルサイズは対応する図の凡例で報告されています。オスとメスのマウスは実験群間で均等に分布していました。しかし、研究が性別特異的効果を検出するために設計・評価されていなかったため、性別層別統計解析は実施されませんでした。この制限はディスカッションセクションで認識されています。

結果

Aβ1-42誘導型AD様マウスにおける学習および記憶の障害とトリプトリド処理後の部分的な改善

Aβ1-42誘導型AD様マウスモデルを構築するため、集約したAβ1-42をC57BL/6Jマウスの両側側心室に立体的に注入しました。モデル確立後、マウスにはビクター、トリプトリド、またはPI3K阻害剤LY294002とトリプトリドの併用で処理されました。空間学習と記憶はモリス水の迷路を用いて評価されました。

6日間の場所ナビゲーションフェーズでは、すべてのグループで脱出遅延が徐々に減少し、マウスは繰り返し訓練によって空間学習課題を獲得したことを示しました(図1A)。しかし、Aβ1-42誘導のAD様マウスは、特に訓練後の日に対照群マウスよりも一貫して長い脱出遅延を示し、空間学習の障害を示唆しました。トリプトリド治療はAβ1-42誘導型AD様モデル群と比べて逃避潜伏を短縮したが、共同治療ではこの改善LY294002弱まった。これらの発見は、トリプトリドがAβ1-42誘発性の空間学習障害を部分的に改善し、この効果はPI3K阻害によって減弱されたことを示しています。

代表的な水泳トラックもこれらの行動変化をさらに支持しました(図1B)。対照マウスはプラットフォーム周辺により直接的で標的指向的な探索パターンを示したのに対し、Aβ1-42誘導のAD様マウスは散在し非効率な泳道を示しました。トリプトリド処理マウスは探索行動が改善し、軌道は標的部位の周囲により集中しました。対照的に、LY294002とトリプトリドを併用したマウスは、トリプトリド単独で処理したマウスよりも検索効率が劣りました。プラットフォーム除去後に実施されたプローブ試験では、Aβ1-42誘導のAD様マウスは対照マウスよりも元のプラットフォーム位置を通過する回数が少なく、空間記憶保持の障害を示しました(図1C)。トリプトリド処理はプラットフォーム交差数を増加させ、LY294002共処理はこの影響を減少させました。同様に、Aβ1-42誘導性AD様マウスでは、対照マウスに比べてターゲット象限に滞在する時間の割合が減少し、トリプリド処理後に増加し、LY294002共治療後は再び減少しました(図1D)。

これらの行動結果を総合すると、両側の脳室内注入によるAβ1-42の凝集がマウスに空間学習および記憶障害を誘発することを示しています。トリプトリドはこれらの行動障害を部分的に逆転させた一方で、LY294002トリプトリドの保護効果を弱め、PI3K/Aktシグナル伝達がこのモデルで観察される行動効果に寄与している可能性を示唆しています。

Aβ1-42注射は海馬神経障害とAβ沈着を引き起こし、これらはトリプトリドによって減弱されました

Aβ1-42によるAD様病理学的変化の確立とトリプトリドの海馬損傷への影響を評価するため、各グループの脳切片に対してヘマトキシリンおよびエオシン染色およびAβ免疫組織化学が実施されました。

HE染色により、対照群のニューロンは密に規則的に配列され、比較的明確な細胞形態と核構造を持つことが示されました(図2A)。対照的に、Aβ1-42誘発性AD様マウスは、細胞配列の乱れ、神経密度の低下、核凝縮の増加を特徴とする明らかな海馬神経損傷を示しました。トリプトリド治療は、Aβ1-42誘導モデル群と比較して、海馬神経の形態を部分的に改善し、細胞配列がより保存され、核核ピクノシスの目立つ傾向が減少しました。しかし、LY294002との共同治療ではトリプトリドの保護効果が弱まり、トリプトリド治療群と比べて神経の乱れや損傷がより顕著に現れました。

その後、Aβ免疫組織化学検査を行い、海馬におけるAβの沈着を評価する(図2B)。対照群ではAβ陽性染色が最小限に見られた一方、Aβ1-42誘発型AD様モデル群では茶色Aβ陽性シグナルが著しく増加しました。トリプトリド処理はモデル群と比較してAβ陽性染色を減少させ、トリプトリドがこのモデルでAβ沈着を減衰させたことを示しました。対照的に、LY294002とトリプリドを併用したマウスでは、トリプリド単独で治療したマウスに比べてAβ陽性染色が増加しました。定量分析によりこれらの組織学的観察結果がさらに裏付けられました。Aβ1-42誘導型AD様モデル群では、各顕微鏡視野内の細胞数に正規化されたAβ陽性シグナル領域が対照群より増加し、トリプトリド処理後に減少、LY294002共治療後は部分的に再び増加しました(図2B)。

これらの結果は、Aβ1-42注射が海馬神経障害とAβ蓄積を誘発し、トリトリドはこれらの病理的変化を部分的に緩和したことを示しています。共治療後の逆LY294002は、PI3K/Aktシグナル伝達がトリプトリドの保護効果に寄与している可能性を示唆しています。

トリプトリドは海馬のゲフィリンおよびコリビスチンの発現を回復させ、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達を調節しました

行動的および組織学的変化が抑制性シナプス関連タンパク質およびその上流調節シグナル伝達の変化を伴うかどうかを明らかにするため、各グループの海馬溶解液をウェスタンブロッティングで解析しました。対照群と比較して、Aβ1-42誘導のAD様マウスは海馬ゲフィリン発現が著しく減少した一方で、リン酸化ゲフィリンレベルは増加しました(図3A)。トリプトリド治療により、総ゲフィリン発現が部分的に回復し、リン酸化ゲフィリンのレベルが低下しました。対照的に、LY294002共治療はトリプトリドの効果を弱め、トリプトリド群と比較してゲフィリン発現が減少し、リン酸化ゲフィリンが増加することが示されました。これらの結果は、Aβ1-42による病理が海馬ゲフィリンの存在比の減少だけでなく、ゲフィリン酸化の強化とも関連していることを示唆し、トリプトリドはこれらの変化を部分的に逆転させました。

コリビスチンは総ゲフィリンと類似した発現パターンを示しました。Aβ1-42誘導型AD様マウスは対照マウスと比較して海馬コリビスチン発現が減少した一方、トリプトリド処理はコリビスチン発現を回復させました。LY294002共治療によりこの効果は部分的に逆転しました(図3B)。これらの発見は、トリプトリドが海馬における抑制性シナプス関連スキャフォールディングタンパク質の発現を保持し、この効果がPI3K阻害によって弱まったことを示しています。その後、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達経路を調べ、ゲフィリン酸化の基礎となる分子変化をさらに明らかにしました。Aβ1-42誘導型AD様モデル群では、PI3K発現およびp-Akt Akt 比率が対照群に比べて低下し、PI3K/Aktシグナル伝達活性の障害を示しました(図3B)。モデル群ではp-GSK-3β/GSK-3β比も低下しました。阻害部位でのGSK-3βのリン酸化はGSK-3β活性の抑制を反映するため、この減少はAβ1-42誘導型AD様海馬におけるGSK-3β活性の比較的増加を示唆しています。トリプトリド治療はPI3Kの発現を増加させ、p-Akt Rat比を回復させ、p-GSK-3β/GSK-3β比を上昇させました。これらの効果はLY294002共治療によって弱まりました。

これらの結果は、Aβ1-42誘発性AD様病理が海馬のゲフィリンおよびコリビスチン発現の減少、ゲフィリン酸化の増加、そしてGSK-3βのPI3K/Akt介有の阻害性リン酸化の障害と関連していることを示唆しています。トリプトリドはこれらの分子変化を部分的に逆転させた一方で、LY294002はトリプトリドの効果を弱め、このモデルにおけるPI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達が海馬ゲフィリンおよびコリビスチンの調節に関与することを支持しました。

トリプトリドは、Aβ1-42誘導型AD様マウスの海馬におけるオートファジー関連タンパク質異常を減弱しました

Aβ1-42誘発性AD様病理およびトリプトリド処理がオートファジー関連タンパク質の変化と関連しているかどうかを調べるため、海馬溶離液におけるLC3およびp62発現をウェスタンブロッティングで調査しました。対照群と比較して、Aβ1-42誘導型AD様マウスはLC3-II/I比が増加し、オートファゴソームに関連するLC3-IIの蓄積増加を示しました。同時に、モデル群でもp62発現が上昇し、海馬にオートファジー関連基質が蓄積していることが示唆されました。トリプトリド処理は、Aβ1-42誘導型AD様モデル群と比較して、LC3-II/I比率およびp62発現の両方を低下させました。これらの結果は、トリプトリドがAβ1-42によって誘導されるオートファジー関連タンパク質の異常な蓄積を弱めたことを示しています。対照的に、共治療LY294002トリトリド単独と比べてLC3-II/I比率およびp62発現を増加させ、PI3K阻害がトリプトリドのオートファジー関連タンパク質変化への効果を弱めることを示唆しています(図4)。

全体として、対照群は行動、組織学的、分子プロファイルの基礎を提供した一方、Aβ1-42誘発されたAD様モデル群は、脳室内Aβ1-42投与が認知障害、海馬神経障害、Aβ沈着、抑制性シナプス関連タンパク質の減少、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達の変化、オートファジー関連タンパク質の蓄積を引き起こすことを確認しました。Aβ1-42誘導モデル群とトリプトリド処理群の比較では、トリプリドがこれらの異常を部分的に逆転させることが示されました。トリプトリド処理群とトリプトリド共治療群LY294002の比較では、PI3K阻害がトリプトリドの効果を弱めることがさらに示されました。これらの結果は、トリプトリドがAβ1-42誘導型AD様モデルにおいて、PI3K/Akt/GSK-3β関連機構を通じて海馬のゲフィリン、コリビスチン、オートファジー関連タンパク質の変化を調節するという仮説を支持しています。

データの利用可能性:

本研究の発見を再現するために必要なすべての生データは、 補足ファイル1 および 補足ファイル2として提供されています。これには、元のウェスタンブロットおよびゲル画像、トリミングされていないブロットデータ、統計解析に用いられた生の数値値、生成されたグラフが含まれます。 (補足ファイル1 および 補足ファイル2) これらのファイルは 図1–4に報告された定量的結果を裏付ける生データを提供します。

図1:トリプトリドはAβ1-42誘導型AD様マウスの空間学習および記憶障害を部分的に改善しました。 (A) モリス水の迷路の6日間の位置ナビゲーションフェーズ中の脱出遅延。(B) プローブ試験中の代表的な泳ぎの軌跡。(C) プラットフォーム撤去後の元のプラットフォーム位置上を越える渡線数。(D) プローブ試験中にターゲット象限で過ごした時間の割合。データは平均標準差±提示されています。脱出遅延は双方向反復測定ANOVAで解析し、プローブ試験データは一方向ANOVA検定で解析されました。対照群、AD、Aβ1-42誘導型AD様モデル群、TP、トリプトリド処理群;LY、LY294002とトリプトリドの共同治療群。n = グループあたり6人。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:Aβ1-42誘発性AD様マウスにおけるトリプトリド減弱した海馬神経損傷およびAβ沈着。 (A) 各グループの海馬切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色画像。スケールバー=50μm。(B) 海馬におけるAβ陽性沈着の代表的なAβ免疫組織化学染色画像および定量解析。スケールバー=50μm。データは平均±標準差(SD)として提示されています。統計解析は一方向ANOVA検定を用いて行われました。対照群、AD、Aβ1-42誘導型AD様モデル群、TP、トリプトリド処理群;LY、LY294002とトリプトリドの共同治療群。n = グループあたり3個。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:トリプトリドはAβ1-42誘導型AD様マウスにおいて、海馬のゲフィリンおよびコリビスチン発現を回復させ、PI3K/Akt/GSK-3β関連シグナル伝達を調節した。 (A) 各群の海馬溶解液における代表的なウェスタンブロット画像および総ゲフィリンおよびリン酸化ゲフィリン発現の定量解析。(B) 海馬溶離液におけるコリビスチン、PI3K、Akt、リン酸化Akt、GSK-3β、リン酸化GSK-3βの代表的なウェスタンブロット画像および定量解析。コリビスチンとPI3Kはβアクチンに正規化されました。リン酸化Aktおよびリン酸化GSK-3βは、それぞれp-Akt Akt およびp-GSK-3β/GSK-3β比として定量化されました。データは平均±標準差(SD)として提示されています。統計解析は一方向ANOVA検定を用いて行われました。対照群、AD、Aβ1-42誘導型AD様モデル群、TP、トリプトリド処理群;LY、LY294002とトリプトリドの共同治療群。n = グループあたり3個。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:トリプトリドはAβ1-42誘導型AD様マウスの海馬におけるオートファジー関連タンパク質異常を減衰させた。 各群の海馬溶解液におけるLC3-I/IIおよびp62発現の代表的なウェスタンブロット画像および定量解析。LC3-II/I比はLC3-IIバンド強度をLC3-Iバンド強度で割り、p62発現をβアクチンに正規化した。データは平均±標準差(SD)として提示されています。統計解析は一方向ANOVA検定を用いて行われました。対照群、AD、Aβ1-42誘導型AD様モデル群、TP、トリプトリド処理群;LY、LY294002とトリプトリドの共同治療群。n = グループあたり3個。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足ファイル1:未トリミングの西部ブロット画像。 定量に用いられるバンドが示され、利用可能な場合は分子量マーカーも示されています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル2:本記事の統計解析に使用される生の数値。 このファイルには、 図1–4の定量グラフ生成に使用された生の数値データセットが含まれており、モリス水迷路の行動測定、Aβ免疫組織化学の定量化、ウェスタンブロット密度測定値が含まれます。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

本研究の中心的なメカニズム提案は、Aβ1-42誘導の病理がPI3K/Aktシグナル伝達を抑制し、GSK-3βの抑制性リン酸化を減少させ、ゲフィリン酸化を促進し、海馬のゲフィリンおよびコリビスチンの発現を減少させ、オートファジー関連タンパク質の蓄積に寄与する一方で、トリプトリドはPI3K/Akt/GSK-3β関連経路を通じてこれらの変化を部分的に打ち消すというものです。本研究は、Aβ1-42誘発性AD様病理に空間学習・記憶の障害、海馬神経障害、Aβ沈着の増加、ゲフィリンおよびコリビスチン発現の低下、ゲフィリン酸化の強化、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達の変化、オートファジー関連タンパク質の蓄積を伴うことが示されています。トリプトリドはこれらの行動的、組織学的、分子的異常を部分的に逆転させ、LY294002その効果を弱めました。これらの発見は、トリプトリドが少なくとも部分的に、PI3K/Akt/GSK-3β-媒介によるゲフィリンリン酸化およびオートファジー関連タンパク質の変化を制御することで、海馬阻害性シナプス関連タンパク質を保護するというモデルを支持しています。Aβ1-42の脳内内室内注射モデルは、主にAβ誘発性の神経毒性およびAD様病態を反映しており、ヒトAD²¹の完全な慢性的多因子進行を反映しているわけではありません。

ゲフィリンとコリビスチンは抑制性シナプス組織の中心的成分です。ゲフィリンはシナプス後部位に抑制性神経伝達物質受容体を固定し、コリビスチンはゲフィリンのクラスタリングと膜の局在を促進します。これらのタンパク質の発現低下は、阻害性シナプスの安定性を乱し、海馬^{ネットワーク機能の}障害に寄与する可能性があります。本研究では、Aβ1-42が海馬のゲフィリンおよびコリビスチンの発現を低減させ、トリプトリドは両タンパク質を回復させました。リン酸化ゲフィリンの増加は、Ser270でのリン酸化がゲフィリンの分散、クラスタリングの減少、タンパク質の不安定化と関連していることから、ゲフィリン喪失のもっともらしいメカニズムを提供します。GSK-3βのPI3K発現、Aktリン酸化、阻害性リン酸化の並行減少は、Aβ1-42がPI3K/Aktシグナル伝達を弱め、GSK-3β活性を高める可能性があることを示唆しており、これはゲフィリン酸化の強化と一致しています。逆に、トリプトリドはAktリン酸化を回復し、GSK-3βの抑制性リン酸化を増加させ、ゲフィリン酸化を減少させましたが、LY294002はこれらの効果を弱めました。これらの結果は、トリプトリドがゲフィリン酸化のPI3K/Akt/GSK-3β関連調節を通じてゲフィリンおよびコリビスチンの発現を維持できる可能性を示唆しています。しかし、全海馬溶解液を用いたため、これらの結果はシナプス局在の直接的な証拠ではなく、海馬タンパク質の存在量とリン酸化の変化を反映しています(^22,23)。

オートファジー関連の異常も、このモデルで観察される分子変化に寄与する可能性があります。オートファジーは神経のプロテオスタシスに重要ですが、ADにおけるオートファジーの劣化が障害すると、オートファゴソームや病理的タンパク質基質の蓄積を引き起こすことがあります^24,25。本研究では、Aβ1-42がLC3-II/I比率およびp62発現の両方を増加させ、オートファゴソーム関連のLC3-IIおよびオートファジー関連基質の蓄積を示唆しました。トリプトリドは両方のマーカーを還元しましたが、LY294002はこの効果を部分的に逆転させ、トリプトリドはPI3K/Akt依存的な機構を通じてオートファジー関連のタンパク質蓄積を緩和する可能性があることを示唆しています。ゲフィリン、コリビスチン、PI3K/Akt/GSK-3βシグナル伝達の変化とともに、これらの発見はトリプトリドの神経保護効果の理解を抗炎症作用や一般的な神経保護作用を超えて拡大し、トリプリドが抑制性シナプス関連スキャフォールディングタンパク質、キナーゼシグナル伝達、Aβ関連AD様病理におけるプロテオスタシス関連経路にも影響を及ぼす可能性を示唆しています²⁶。

このプロトコルの成功と再現性を決定するいくつかの重要なステップがあります。まず、Aβ1-42の凝集状態は注射前に慎重に制御・検証されるべきです。なぜなら、ペプチド製剤は病理学的結果に大きな影響を与える可能性があるからです。次に、外側心室への正確な立体定位注射が不可欠です。逆流、誤った針の位置、過剰な注射速度は変動するAβ曝露や行動・組織学的結果の不一致を引き起こすことがあります。第三に、モーリス水迷路のテストでは、安定した視覚的手がかり、一定の水温、泳ぐ速度のモニタリングが必要で、運動障害を交絡因子として除外します。第四に、組織学的および免疫組織化学的定量は、あらかじめ定義された関心海馬領域と盲検解析を用いて行うべきです。最後に、ウェスタンブロットの結果は、均等なタンパク質負荷、適切なゲル濃度、効率的な転送、そしてクロップされていないブロット画像を用いたバンド特異性の確認に依存します。

いくつかの制限を考慮する必要があります。第一に、Aβ1-42注射モデルはヒトADの慢性進行、tau病理、血管変化、神経免疫の複雑さを再現しません。第二に、オスとメスのマウスはグループ間で均等に分布していましたが、性別層^{別解析に関して}は十分度が認められていません。第三に、全海馬溶解液では、ゲフィリンとコリビスチンの変化が抑制シナプスで特異的に起こるかどうかを決定できません。第四に、提案されたPI3K/Akt/GSK-3β–ゲフィリンのメカニズムは、GSK-3β活性およびゲフィリンSer270リン酸化が直接操作されなかったため、相連的なままでいる。最後に、LC3-II/Iおよびp62は静的なウェスタンブロット読み取りであり、動的オートファジックフラックスを完全に定義することはできません。今後の研究では、シナプトソーム分画、抑制性シナプス後マーカーとの免疫蛍光共局在、GSK-3βの機能増減アプローチ、Gephyrin Ser270変異構造物、リソソーム阻害剤を用いたフラックスアッセイを用いるべきです。慢性トランスジェニックADモデル、タウ関連モデル、ヒト由来神経系での検証も必要であり、この経路^がAD病理に広く関連しているかどうかを判断する必要があります。さらに制限として、立体注射に用いられる正確なAβ1-42の凝集状態が、チオフラビンT蛍光、SDS-PAGE/ウェスタンブロッティング、透過式電子顕微鏡で独立して検証されなかったことです。このペプチドはAβ1-42の凝集を促進するために一般的に用いられる37°Cの長時間培養法で調製されましたが、バッチごとの凝集状態の変動は病理学的転帰に影響を与える可能性があります。今後の研究では、このワークフローを慢性トランスジェニックADモデル、tau関連モデル、ヒト由来神経系で検証することが期待されます。追加の実験には、Aβ1-42の凝集状態の直接検証、造影剤や解剖学的検証を用いた立体誘導注射精度評価、シナプトソームの分画、抑制性シナプス後マーカーを用いた免疫蛍光共局在、GSK-3βの機能獲得・喪失アプローチ、Gephyrin Ser270変異体実験、リソソーム阻害剤を用いたオートファジックフラックスアッセイなどが含まれます。トリプトリドの用量反応および安全性の研究も、トランスレーショナル応用を検討する前に必要です

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗Gephyrin抗体	12681	Peoteintech	Gephyrinの合計を検出するためのウェスタンブロッティング一次抗体。
リン酸化Gephyrin抗体	147011	Synaptic Systems	リン酸化Gephyrinを検出するためのウェスタンブロッティング一次抗体。
Collybistin抗体	ab316963	abcam	Collybistinを検出するためのウェスタンブロッティング一次抗体。
PI3K抗体	27921	Peoteintech	PI3Kを検出するためのウェスタンブロッティング一次抗体。
Akt抗体	9272	Cell Signaling Technology	総Aktを検出するためのウェスタンブロッティング一次抗体。
リン酸化Akt抗体	4060	Cell Signaling Technology	リン酸化Aktを検出するためのウェスタンブロッティング一次抗体。
GSK-3β抗体	12456	Cell Signaling Technology	総GSK-3βを検出するためのウェスタンブロッティング一次抗体。
リン酸化GSK-3β抗体	5558	Cell Signaling Technology	リン酸化GSK-3βを検出するためのウェスタンブロッティング一次抗体。
βアクチン抗体	66009	Peoteintech	ウェスタンブロッティングの正規化用のローディングコントロール抗体。
LC3抗体	11972	Cell Signaling Technology	LC3-IとLC3-IIを検出するためのウェスタンブロッティング一次抗体。
p62抗体	5114	Cell Signaling Technology	p62/SQSTM1を検出するためのウェスタンブロッティング一次抗体。
Aβ1-42抗体	ab150155	abcam	Aβ1-42を検出するための一次抗体。
HRP結合二次抗体（抗マウスIgG）	7076S	Cell Signaling Technology	ウェスタンブロッティングにおけるマウス一次抗体用の二次抗体。
HRP結合二次抗体（抗ウサギIgG）	7074S	Cell Signaling Technology	ウェスタンブロッティングにおけるウサギ一次抗体用の二次抗体。
Aβ抗体	GT622,	Invitrogen,	Aβ免疫組織化学用の一次抗体。
Aβ1-42	9001	上海都馬技術有限公司	集合を誘発する注射液の調製に使用するアミロイド-βペプチド。
triptolide	BD9097	上海必得製薬有限公司.	腹腔投与された試験化合物。
LY294002	ab120243	abcam	共同処理グループに使用されるPI3K阻害剤。
パラホルムアルデヒド	P0099	Beyotime	経心臓灌流と組織の固定後の固定液。
キシレン	108298	Merck	脱パラフィン化と組織透明化試薬。
エタノール	100983	Merck	パラフィン切片の再水和および脱水試薬。
プロピレングリコール	294004	Merck	薬液調製の車両成分。
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤	P1045	Beyotime	タンパク質とリン酸化状態を保存するために使用される溶解バッファー添加物。
RIPA溶解バッファー	P0013	Beyotime	海馬組織からの総タンパク質抽出用溶解バッファー。
EDTA抗原回収バッファー	ab93680	abcam	免疫組織化学用の熱媒介抗原回収バッファー。
ペントバルビタールナトリウム	P3761	Sigma	手術および組織採取に使用する麻酔薬。
ヤギ血清	ZLI-9056	ZSGB-BIO	免疫組織化学用ブロッキング試薬。
PVDF膜	ISEQ00010	Merck Millipore	ウェスタンブロッティング転写に使用する膜。
モリス水迷路	VX80	上海新軟信息技術有限公司	空間学習および記憶評価用の行動装置およびビデオ追跡システム。
ケミルミネッセンスイメージングシステム	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	ケミルミネッセンスウェスタンブロッティング信号取得用のイメージングシステム。
ステレオタキシー装置	/	Stoelting Technology Co., Ltd	ステレオタキシー脳室内注射に使用する装置。
BCAタンパク質アッセイキット	P0006	Beyotime	総タンパク質濃度測定用の比色アッセイキット。
マイクロプレートリーダー	Synergy2	Biotek	BCAアッセイ測定に使用する吸光度リーダー。
ImageJ	version 9.0.1	米国国立衛生研究所	組織学、免疫組織化学、およびウェスタンブロッティング密度計測用の画像解析ソフトウェア。
GraphPad Prism	version 8.5	GraphPad Software	統計分析およびグラフ生成ソフトウェア。