本プロトコルは、社会的状態操作(社会的孤立および社会的再会)中に自由に行動するマウスの視床下部神経細胞をミニスコーでin vivo でカルシウムイメージングすることを詳述しています。この手法により、社会的欲求と社会的飽和を表す視床下部活動を単一ニューロン分解能でイメージングでき、社会的恒常性の機構的研究が可能になります。
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この記事について
サマリー
要約
脊椎動物の社会的行動は視床下部回路を通じて厳しく制御されています。最近、社会的欲求を恒常性的に符号化する分子的に定義された視床下部ニューロンタイプが特定されました。ここでは、自由に行動するマウスを対象にヘッドマウント型ミニチュア顕微鏡(miniscope)を用いて視床下部内側視前核(MPN)における in vivo カルシウムイメージングを行うためのステップバイステッププロトコルを説明します。この手法により、社会的隔離および再統合中のニューロン集団動態の縦断的記録が可能となり、単一ニューロン分解能における社会的欲求と社会的満腹感のメカニズム的研究が可能になります。具体的には、成体マウスに遺伝的にコードされたカルシウム指標を発現させるアデノ関連ウイルス(AAV)の立体誘導注射を受け、その後勾配指数(GRIN)レンズとミニスコープベースプレートを埋め込みます。回復後、マウスはミニスコープ画像装置に慣れ、計画的な社会的隔離と再会を受け、その間神経活動が画像化されます。カルシウム信号は動物の行動と同期させられ、さらなる解析が行われます。このプロトコルは、マウスの視床下部における社会行動中のミニスコープによる生 体内 カルシウム画像の包括的な指導を提供します。他の深部脳領域やさまざまな行動文脈での画像診断にも容易に適応可能です。このアプローチは細胞レベルの神経活動と社会的行動を橋渡しし、自由に動く動物の複雑な行動の神経基盤の理解を深めています。
概要
社会的絆を維持する能力は動物の生存に不可欠です 1,2,3。長期間の社会的孤立は不安、認知障害、代謝の変化を引き起こしますが、再会は社会的関与と社会的ニーズを回復させます 4,5,6。短期間の社会的隔離後の社会的行動の回復は、恒常性メカニズム7の存在を示唆しており、これは飢餓8,9や渇きの調節に類似している(10,11,12)。しかし、社会的恒常性を媒介する神経基盤は依然として十分に解明されていません。
最近の研究により、視床下部神経集団はそれぞれ社会的欲求と社会的満腹感をコードしていることが明らかになりました。生体内カルシウムイメージングにより、内側視前核(MPN)にある遺伝的に定義されたグルタミン作動性ニューロン群が分離時に活性化する一方(MPN分離ニューロン)、別のGABA作動性ニューロン集団が再結合時に活性化することが示されています(MPN再統合ニューロン)。MPN分離ニューロンのオプトジェネティック活性化は社会的孤立状態を模倣し、MPNリユニオンニューロンのオプトジェネティック活性化は社会的リバウンドを減衰させることで、社会的欲求の調節における両者の相反する役割を示唆しています。これらの集団は相互に相互作用し、脳全体の神経回路と接続して、社会的ニーズを動的に調節するフィードバックループを形成します。
ここでは、社会的孤立や再会など動物学的に重要な社会行動中に自由に動くマウスの、単一ニューロン分解能で深部脳カルシウム動態を記録できるようにすることを目的とした詳細なプロトコルを提示します。このイメージング技術と動物行動学的に重要な社会パラダイムの組み合わせは、異なる社会状態の神経表象を調査する前例のない機会を提供します。この適応された手法の開発の根拠は、社会的欲求と満腹感がMPNのような深部脳構造で動的にどのように表現されているかを可視化する必要性に由来します。ミニスコープの使用は以前にも14、15、16で記述されていますが、特に隔離と再会の間の移行を伴う制限のない社会的交流における使用は、光学的安定性を維持し、動きのアーティファクトを最小限に抑え、自然な行動表現を確保するために特定の技術的・行動的適応を必要とします。
ファイバーフォトメトリーと比較して、ミニスコープベースのアプローチは細胞の解像度を提供し、同じ領域内で異なる機能ニューロンタイプを識別することを可能にします。自由に相互作用する動物の長期記録を可能にし、社会的に駆動される神経動態の研究に不可欠です。これまでの一光子顕微鏡を用いた研究は、空間的または感覚的課題中の皮質または背側海馬に焦点を当ててきました 14,15,16。本プロトコルは、複雑な社会行動中のより深い皮質下領域にこれらの進歩を拡張し、自然な条件下での感情状態回路の研究のテンプレートを提供します。
このプロトコルは、GRINレンズの埋め込みと遺伝子コードされたカルシウム指標を用い、最大~5mmの脳領域に最適化されています。主な考慮事項には、手術の精度、レンズの配置、行動パラダイム設計、関連するデータ分析が含まれます。この方法は他の深部脳領域や行動文脈にも応用可能です。このプロトコルは、手術準備、ウイルス投与、レンズ移植、行動設計、ミニスコープ装着、画像診断、データ解析など、すべての重要な段階を案内します(図1A-E)。このアクセスしやすく詳細なワークフローが、幅広い自然主義的行動にわたる深部脳神経集団の研究を可能にすると期待しています。
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プロトコル
すべての処置はウェストレイク大学の動物倫理委員会により承認され、動物プロトコル#25-076-LD-9が適用されました。すべての実験はウェストレイク大学の動物実験室のガイドラインに従って実施されました。このプロトコルで使用されるすべての機器および材料は 、材料表に記載されています。
1. ウイルス注射手術
- マウスを2〜3%のイソフルランを使った麻酔誘導チャンバーに入れます。
注:麻酔の成功は、つまみ反射がなくなり、安定した深呼吸ができることで確認されます。 - 2〜3分後、または正しき反射が失われたら、動物を素早く立体誘導器に移します。鼻を麻酔鼻錐で固定し、手術中は1〜1.5%のイソフルランで麻酔を維持します(図1B)。酸素流量は通常0.8〜1.2 L/minに設定されています。
注意:動物の呼吸数やその他の生理的症状を監視してください。動物の呼吸数が増加し、ひげやその他の覚醒の兆候が見られた場合は、イソフルラン濃度を2〜3%に増やしてください。 - 立体走行器具の切歯バーを通してマウスの切歯を固定します。ヘッドを固定するためにノーズクランプを締めてください。
- 外耳道に2本のイヤーバーを慎重に挿入し、しっかりと固定できるまで続けます(図1B)。
注意:(1) 首の組織を圧迫する不適切な位置は呼吸困難や不安定な固定を引き起こす可能性があります。(2) 動物が固定中に呼吸困難や抵抗の兆候を示した場合は、直ちに耳バーを外して位置を変えてください。これは気道圧迫の可能性を示すためです。(3) 両方の耳棒が同じ高さであることを確実にします。これはその後の頭蓋骨の正確な水平化に不可欠です。 - マウスの両目に眼科軟膏を塗って、目の乾燥を防ぎます。
- 脱毛クリームを使って頭毛を除去しましょう。残留クリームや髪を落とすために、75%エタノールのウェットワイプでしっかりと拭き取ってください。
- 露出した皮膚を75%エタノールワイプとベタジンで消毒してください。細い外科用ハサミを使って頭皮の正中矢状面切開を行います。皮膚を引き戻して、目標の脳領域の上に頭蓋骨を完全に露出させます。綿棒で頭蓋骨表面を優しく掃除し、骨膜を取り除きます。
注意:歯科セメントの強固なアンカーを提供し、インプラントの長期的な安定性を確保するためには、頭蓋骨の十分な範囲を露出させることが必要です。 - 立体ピペットを立体ピペットに取り付けて頭蓋骨表面測定を行います。立体顕微鏡下で、ピペットの先端を矢状縫合と冠状縫合の交差点(ブレグマ)に位置し、原点として設定します(X = 0, Y = 0, Z = 0, 図1C)。
- ピペットの先端をブレグマから±2 mmの横方位置に移動させ、頭蓋骨の高さを調整して、これら2点の高さ差が±0.03 mm以内に収まるまで調整します。
- 次にピペットを矢状縫合線とラムドーイド縫合線の交差点(ラムダ)に移動させ、前後傾きを調整してブレグマとラムダの高さ差が±0.03 mm以内に収まるまで調整します(図1C)。
注:(1)事前に頭蓋骨の目視評価と調整を行うことで、微細なレベリング作業が大幅に効率化される可能性があります。(2) レベリング前に頭蓋骨の表面を圧縮空気で乾燥させることで、頭蓋縫合線の視認性が向上します。 - 0.8mmのドリルヘッドを持つ手持ちドリルを使って、ターゲットの脳領域に開頭切開を行います(例:C57BL6/Jマウスの場合)。座標は前後方(AP)0 mm、内側外側(ML)0.3 mm、背側-腹側(DV)-4.8 mmで、MPN領域を対象としています。FVB/NJマウスの場合、開頭切開はAP+0.4mm〜0.5mm、ML0.3mm、DV−4.8mmで行われます(図1C)。
注:出血がある場合は、一時的にイソフルラン濃度を2〜2.5%に増やしてください。滅菌用の綿先端や止血スポンジを使って血液を吸収し、すぐに滅菌生理食塩水を塗布してください。止血後はイソフルランを維持レベル(1〜1.5%)に戻し、余分な液体を除去します。 - 開頭術後、標的脳領域にカルシウム指示薬を発現するウイルスの立体注射を行います。
- 注射前に、神経細胞内で遺伝的にコードされたカルシウム指示薬を発現し、カルシウム信号を用いて神経活動のイメージングを可能にするアデノ関連ウイルスであるAAV-hSyn-jGCaMP7fを希釈し、最終的な滴答量は約5 × 10¹²個のウイルスゲノム/ミリリットルに到達します。
- まずガラスピペットにミネラルオイルを入れ、その後ウイルス溶液を入れて気泡が出ないようにします。ピペットを頭蓋骨表面のターゲット座標に位置させ、ゆっくりと目標の深さまで下げます。
- ウイルスを片側にゆっくりとした一定速度(例:30 nL/min)で、総体積400 nL7で注入し、MPN領域の十分なニューロンの感染を確保します。この量は、脳領域の特定の大きさやCre-loxPシステムなどのさらなる制約が存在するかどうかに応じて調整可能です。
- 注射完了後は、ウイルス拡散を十分に促進し、注射経路に沿った逆流を最小限に抑えるためにピペットを10〜15分間そのままにし、その後ゆっくりと引き抜きます。
注:(1)適切かつ一貫したタイターを持つウイルスアリコートは、動物間での成功的かつ一貫した発現に不可欠です。過剰なタイターは神経毒性を引き起こす可能性があり、不足すると発現が弱くなり、画像検査における信号対雑音比の低下が生じます。(2) 注射速度の遅さとピペット抽出までの十分な待ち時間は、組織損傷を最小限に抑え、ウイルス逆流を防ぎ、標的部位での正確かつ堅牢なウイルス発現を確保するために重要です。 - ウイルス注射後、頭蓋骨の上の皮膚を吸収性の縫合糸で縫合します。
- 手術直後、鎮痛のためにカルプロフェン(5 mg/kg)を皮下注射し、その後3日間は継続経過観察と必要に応じて追加投与を行います。
- ウイルス注射手術後、マウスは少なくとも2〜3週間個別に飼育し、十分な動物の回復とウイルス発現を促します。
注意:GRINレンズの移植(セクション2)は、ウイルス注射当日に実施することも、ウイルス注射後2〜3週間後に行うことができます。このプロトコルでは、GRINレンズ移植時にウイルスの発現を評価する2段階法について説明します。
2. GRINレンズの埋め込み
- 開頭手術を再開するには手順1.1-1.10を繰り返します。ステップ2.8では、歯科用セメントをよりよく掴むためにメスで頭蓋骨表面を引っかきます。新しい開頭手術では、滑らかな着床を可能にするために、直径はGRINレンズよりやや大きめ(通常~1mm)にします。掘削後は骨の破片を丁寧に除去してください。
- GRINレンズ移植時の組織圧迫を軽減するために、ガラスピペットを目標脳領域に挿入し、ピペットをゆっくりと内側側に動かして切開を行います。このマイクロカットは長さ~1mmで、GRINレンズの埋め込みスペースを作ります(図2A)。
注:このステップはプロトコル全体の成功にとって非常に重要です。 - GRINレンズを埋め込む前に、75%エタノールで消毒し、その後無菌生理食塩水で洗浄し、レンズティッシュで優しく拭き取ります。
- GRINレンズをレンズホルダーで持ち、ミニスコープをレンズの上部に取り付けます。
- アセンブリ全体をブレグマに位置させ、すべての座標をゼロにします(すなわち、X = 0、Y = 0、Z = 0)。次に、開頭切開の上の目標X-Y座標に位置合わせます。
- 頭蓋骨表面を滅菌生理食塩水で湿らせます。GRINレンズを約100μm/分の速度で非常にゆっくりと脳組織に下げ、標的に到達します(図2B)。
注意:(1) ウイルス注射後2〜3週間後にGRINレンズの埋め込みを行う場合、挿入中にミニスコープを起動してリアルタイムの蛍光変化を観察してください。レンズがターゲット領域に近づくにつれて、視野内の蛍光信号全体がより明るくなり、この変化は画像ソフトウェアを使って信号ヒストグラムからリアルタイムで直接読み取り可能です(図2C、D)。(2) 着床時の出血を避けるよう注意してください。血栓は信号の質を著しく低下させます。(3) 出血が避けられず重度の場合は、GRINレンズを取り外し、洗浄し、出血が止まった後に再移植してください。 - レンズ移植後は、残留液体を吸収して頭蓋骨表面を十分に乾燥させ、圧縮空気で吹きかけます。
- GRINレンズのベースを頭蓋骨に固定するためにデンタルセメントを慎重に塗布し、露出した頭蓋骨を覆う完全なヘッドキャップを作ります(図2B)。セメントが周囲の筋肉組織に触れないように注意してください。その後、レンズホルダーを慎重に緩め、ホルダーとミニスコープを一緒に外します。
注意:(1) 冷えたスラブにデンタルセメントを混ぜて、固化を遅らせ、作業時間を延ばすこと。(2) ミニスコープ接続時にマウスを保持するためにレンズの後ろにヘッドバーを追加することが推奨されます。(3) レンズホルダーやミニスコープにセメントを塗布しないよう十分注意してください。 - 二成分シリコーン接着剤は、その2つの液体を混ぜて準備します。GRINレンズの上部に塗布し、回収期間中にホコリや傷から保護するシールを形成します。
- GRINレンズの埋め込み後は、回復中にケージメイトによるレンズの損傷を防ぐために、マウスを個別に飼育してください。
3. ベースプレートの取り付け
- GRINレンズ移植から2〜3週間後にベースプレートの装着が行われます。上記のように、立体誘導器でマウスを麻酔し固定します。
- GRINレンズの上部からシリコンシールを外し、レンズティッシュで優しくレンズ表面をきれいにします。
- ベースプレートをミニスコープに取り付けてください。顕微鏡ベースプレート全体をホルダーを介して立体型マニピュレーターアームに取り付けます。
- ミニスコープをデータ取得ボックスに接続し、ライブイメージングをオンにしてください。
- ミニスコープ対物レンズと埋め込み型GRINレンズを、マニピュレーターを細かく調整して、ミニスコープとGRINレンズ間の光学的同軸位置を正確に合わせます。
- ミニスコープ対物レンズをGRINレンズの上表面と平行に位置させ、GRINレンズ全体の縁がイメージングウィンドウに完璧な円形で含まれ、レンズの中心がイメージングウィンドウの中心にあることを確認してください。
- ミニスコープを最適な作業距離まで下げて、ターゲット焦点面のニューロンの鮮明な画像を取得します。
- 歯科用セメントを使ってベースプレートを既存のセメントキャップに橋渡し、カプセル化します(図2B)。
注:(1)重要なステップとして、最終固定の前にミニスコープを経験的にわずかに持ち上げること(約50〜100μm)し、固化時のセメント収縮による焦点面のずれを補正します。(2) ベースプレート取り付け後に取り外しるべきミニスコープの部品に歯科用セメントが接触しないように非常に注意してください。 - デンタルセメントが完全に固まったら、ホルダーを緩め、顕微鏡をベースプレートから慎重に外し、すぐにベースプレートにキャップをねじ込んで光学インターフェースを保護します。
- ベースプレート設置後、個別に3〜5日間は飼育し、その後少なくとも1週間はケージメイトと再会させてから社会的状態操作(例:社会的隔離)を行います。
4. 慣性化とイメージングパラメータの設定
- 埋め込みマウスを一時的なヘッドレストに慣れさせ、ミニスコープの取り付けや画像診断装置に2〜3回慣れさせてから正式な画像診断セッションに臨みます。
- ミニスコープをベースプレートに取り付けるには、埋め込みマウスの頭部を拘束し、ベースプレートキャップを外し、マグネットインターフェースを通じてミニスコープをベースプレートにドッキングします。次に、ミニスコープを固定するためにサイドネジを締めます。カルシウム画像診断を10分間行い、その間動物は記録アリーナやケージ内で自由に動いています。
- このパイロット画像診断では、優しいタッチや新しいマウスなどの刺激を導入してください。データを分析し(詳細は第6節参照)、単一ニューロン信号を抽出できるかどうかを確認しましょう。慣れ化中は、ミニスコープの焦点面を作業距離に沿って調整し、観察されるニューロン数と画像の鮮明さを最大化することで最適なイメージング設定を決定します。
- 照明出力を最大値の~10%に、センサー利得を最大値の~10〜20%に設定して、飽和せずにクリアな信号を得ます。1280×800の空間解像度で20Hzのサンプリングレートで画像を表示。これらの設定は各動物ごとに保存し、次の画像診断セッションでも再利用してください。
5. ミニスコープカルシウムイメージングのための社会行動アッセイ
- 社会再結合アッセイ(図3A)
- 画像検査の1日前から1日、3日、または5日間、ミニスコープで埋め込んだマウスを隔離してください。ベースライン、再結合、再分離時にカルシウム画像検査を行います。
- ベースライン:マウスをミニスコープに接続し、10分間マウスを隔離して記録します。
- 再会:元カジェメイトを録音室に加え、10分間録音する。
- 再分離:10分間再結合後にカジメートを除去し、再分離中にさらに10分間画像を撮影します。
- 社会的隔離アッセイ(図3B)
- ミニスコープで埋め込んだマウスを6時間隔離し、毎時15分間カルシウム信号を記録します。
- かつてのカジェメイトを記録チャンバーに追加し、画像撮影の最後に10分間記録することで、社会的再結合によって有意に調節されるニューロンを特定します(詳細は第6節および第7節参照)。
注:(1)この特定の画像診断スケジュールは、信号の光漂白を最小限に抑え、社会的隔離から最初の6時間の神経活動を監視できるようにするために用いられています。(2) ミニスコープは全過程で接続されています。(3) このアプローチにより、同じニューロンアンサンブルを画像診断セッション全体にわたって追跡することが可能になります。(4) 画像検査時に食品とハイドロゲルが提供されます。
6. データ前処理
- 生の画像動画をデータ処理ソフトウェアにインポートします。
- 必要に応じて元の映像を空間的・時間的にダウンサンプリングし、データ解析の計算負荷を軽減します。
注:この解析では、生の画像データを1280×800空間分解能、20Hzで取得します。空間的に4倍ダウンサンプリングし、時間的に2倍ダウンサンプリングします。 - 高周波ノイズと低周波の背景ドリフトを低減するために、グローバル平均減算を用いた空間バンドパスフィルタを適用します。
- データ処理ソフトウェアのモーション補正アルゴリズムを使って、モーションアーティファクトを修正します。モーションコレクトされた映画を視覚的に検査し、安定したニューロン体質と残留運動アーティファクトが最小限であることを確認しましょう。
- 「細胞の識別」ボタンをクリックし、リストから「CNMFe」を選択すると、CNMF-E17 (Restricted Non-negative Matrix Factorization for microEndoscopic data)アルゴリズムで個々のニューロンのカルシウム活性痕跡を抽出できます。
- データ処理ソフトウェアの 定規 ボタンをクリックし、代表的なニューロンからソーマ直径(ピクセル単位)を測定します。「平均セル直径(ピクセル数)」ボックスに平均サイズを入力します。その後、「 Apply」 ボタンをクリックしてCNMF-Eを実行してください。
- 細胞検出が不十分、過剰な非細胞成分が現れる、または過剰な分断が発生した場合、CNMF-E初期化設定を調整します。
- 抽出されたすべての成分を検査し、細胞の形態や生物学的に妥当なカルシウム動態に基づいて受け入れ・拒否してください。不規則でトゲトゲした形状の部品は除外します。ノイズや動きによるアーティファクトが支配的な痕跡を除外します。
注:(1) 図2E および 2F は、明確な形態を持つ2つの認められたニューロンと典型的なカルシウム過渡期を示しています。(2) 図2G および 2H は、明確なベースライン変動を持ち、典型的なカルシウム過渡期を欠く2つの拒絶ニューロンを示しています。 - 社会状態変調ニューロンの下流同定のために、受理されたニューロンの蛍光痕跡をデータ処理ソフトウェアからエクスポートします(第7節)。
7. 社会状態調節ニューロンの特定
- MATLABやPythonを使って、前処理データをさらに分析してください。
- 受け入れられたニューロンのカルシウム活動痕跡を行動タイムスタンプに合わせます。
- 行動動画から社会的再会の時間点を見つけてください。各ニューロンごとに、活動を300秒の再会前社会的隔離期間と300秒の社会的再会期間に分けます。
- 各ニューロンについて、分離期間と再結合期間中のカルシウム活性分布を定量化します。
- 受信者動作特性(ROC)解析18 を実施し、神経活動が孤立状態と再結合状態を識別できる能力を評価し、ROC曲線下の面積を計算するAUC値を算出します。
- 置換検定を用いて統計的有意性を評価します。各ニューロンに対して、カルシウム活性値は1秒の時間ビン内で1,000回円滑に行動状態をシャッフルし、AUC値の帰無分布を生成します。観察されたAUC値がシャッフルされた帰無分布の95パーセンタイルを超えるニューロンは、社会状態によって有意に調節されていると考えられます。
- 調節方向に基づいて有意に変調されたニューロンを分類します。再統合によって阻害されたニューロンを分離ニューロンとし、再統合によって活性化されるニューロンを再統合ニューロン(図4)と分類します。
8. 実験後の検証
- マウスを灌流し、標準組織学検査を行いGRINレンズの追跡とウイルス発現を確認します( 図2Iの組織学画像例参照)。
- 4%のPFAを使ってマウスの頭部全体とインプラントを固定し、その後GRINレンズを外してレンズの跡をクリアに確認します。
注意:正しいターゲットをつけた動物のデータのみを含みます。
9. トラブルシューティングと実践的なヒント
- ミニスコープの後ろにデンタルセメント付きのヘッドバーを固定し、ミニスコープの取り付けや取り外しを容易にしてください。
注意:ヘッドバーは長すぎず、社会的な行動の妨げになるようにやや傾けた角度に配置してもよい。 - 手術後の回復期間中、埋め込みマウスを個別に少なくとも1週間飼育してください。これによりマウスが回復する十分な時間が確保され、他のマウスによるインプラントの損傷を防ぎます。
- 完全に回復したら、埋め込みマウスを以前のカゲメイトと再結合させます。カバーキャップを定期的に点検し、締め直してください。予備のカバーキャップを用意し、動物のメンテナンス中に失くしたら交換しましょう。
- GCaMPウイルスを注入してから3〜4週間後にカルシウムシグナルを確認してください。信号が弱すぎたり不明瞭だったりする場合、回復期間を長くすることで信号の品質が向上することもあります。
- GRINレンズ側かミニスコープ側のレンズ表面には注意してください。レンズは清潔で傷がつかないように保ちましょう。使わないときはレンズを覆いましょう。
- 画像撮影前に、信号ケーブルの長さを動物が撮影アリーナの角に届く長さと、円滑な社会的交流ができる長さに調整してください。
- 必要に応じて、他のネズミからの噛みつきを防ぐために、ケーブルを丈夫な素材で保護してください。信号ケーブルを定期的にチェックし、激しい社会的交流でねじれていないか確認してください。
- 連続した画像撮影から同じニューロンアンサンブルを特定するために(例: 図3B)、生の画像映像を連結してカルシウム痕跡を抽出することができました。
- 例えば、挙動動画やカルシウム信号などの複数の信号を同期させるために、共通のTTL入力や同期した懐中電灯が異なる記録ファイルの整合に使われることが多いです。
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結果
ニューロン集団の同定
GCaMPウイルスを発現し、C57BL/6JマウスのMPNにGRINレンズを埋め込みました。手術後、マウスは個別に回復し、少なくとも1週間はケージメイトと再会しました。その後、マウスはカルシウム画像撮影の3日前に単独で飼育されました。画像検査では、まず10分間の隔離ベースラインが記録され、その後元ケージメイトとの10分間の社会的再会が行われました。社会的再会前後に記録されたカルシウム活動(各期間ごとに300秒)がROC分析に用いられました(詳細は第7節参照)。
MPN領域における2つの異なる神経集団が、社会的隔離と再会の間に独自の活動パターンを持つことが確認されました。MPN分離 ニューロンは社会的孤立時に持続的な活動を示し、再統合時には急速な抑制を示しますが、MPN再結合 ニューロンは逆のパターンを示します(図4)。ここに、MPN分離
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ディスカッション
本プロトコルは、 in vivo のミニスコープカルシウムイメージングと社会的行動パラダイムを組み合わせた統合的アプローチを詳述し、視床下部ニューロンの活動プロファイルを評価することを目的としています。これにより、自然な社会的相互作用中に深部脳構造から長期の細胞分解能カルシウムイメージングが可能になります。以下のセクションでは、このアプローチの重要なステップ、方法論的意義、限界、そして将来の可能性について論じます。
このプロトコルの成功は、綿密かつ相互に関連した一連の外科的および実験的手技にかかっています。まず、立体性ウイルス注入の精度が極めて重要です。ウイルスのタイター、注射速度、注射後の停留時間を最適化し、効率的かつ標的を絞ったウイルス発現を実現し、組織損傷やウイルス逆流を最小限に抑える必要があります。そのため、GRINレンズの埋め込みは手術全体の成功にとって大きな技術的課題となります。ガラスピペットによる組織の事前切断、非常にゆっくりとしたレンズの移植、そして厳格な出血管理は、組織圧迫を減ら...
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開示事項
著者らは競合する金銭的利益や利益相反を主張していない。原稿編集にはChatGPTが使用され、すべての著者による慎重かつ詳細な校正が行われました。
謝辞
ミニスコープ実験の初期訓練を支援してくださったキャサリン・デュラック教授と、手術の実施に協力してくださったヤン・サン氏に感謝いたします。この研究は、ウェストレイク大学のスタートアップ資金、NOMIS財団、ハーバード大学タンヤン自閉症研究センター、ジェーン・コフィン・チャイルズ医療研究賞(D.L.)、チャールズ・A・キング・トラスト博士研究員フェローシップによる支援を受けました。リウラボの全メンバーの皆様、原稿へのご意見に感謝申し上げます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pA | タイツール | S0587-9 | ウイルスベクター、手術 |
| 吸収性止血性ゼラチンスポンジ | 福康セン | FKS-A | 手術 |
| ベタジン溶液(10%ヨウ素化ポビドン)500mL | ハイノート | Q13702855HNW002 | 手術 |
| 行動ビデオ用のカメラ | 大衡 | MER2-160-227-U3C | 行動 |
| カープロフェン | MCE | HY-B1227 | 手術 |
| デジタル立体タキシック計器 | 後輪駆動 | 68803 | 手術 |
| エタノール(75%) | シノファーム化学試薬株式会社 | 801769610 | 手術 |
| 眼軟膏 | FODU | H37022025 | 手術 |
| インスコピックスデータ処理ソフトウェア(IDPS) | インスコピックス | 1000-006551 | データ分析 |
| イソフルラン | 後輪駆動 | R510-22-10 | 手術 |
| クイックシル接着剤パック2個入り | ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ | クイックシル | 手術 |
| マイクロドリル | 後輪駆動 | 78001 | 手術 |
| MP-1000マイクロピペットプーラー | 後輪駆動 | MP-1000 | 手術 |
| 多機能動物麻酔ソリューション | 後輪駆動 | 太極町 | 手術 |
| ナノリットルマイクロインジェクションポンプ | 後輪駆動 | R-480 | 手術 |
| nVista 3.0 ミニスコープ | インスコピックス | 1000-004323 | イメージング |
| 眼科用鉗子 | 後輪駆動 | F12006-10 | 手術 |
| 作動ハサミ | 後輪駆動 | S14001-15 | 手術 |
| ProView インプラントキット | インスコピックス | 1000-004238 | 手術と画像診断 |
| 樹脂セメント(スーパーボンド) | サン・メディカル | スーパーボンドC&B | 手術 |
| ベースプレートカバー5枚セット | インスコピックス | 1050-004639 | イメージング |
| ベースプレート5枚セット | インスコピックス | 1050-004638 | イメージング |
| GRINレンズ5個セット、直径0.6mm、長さ7.3mm | インスコピックス | 1050-004626 | 手術と画像診断 |
| ステレオタクシス顕微鏡 | マージダー | MSD205A | 手術 |
| 無菌生理食塩水 | キドゥケリン | R1B25071902 | 手術 |
参考文献
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