方法論記事

Astyanax mexicanusの表層魚および洞窟魚の個体群における脳と腸の解剖

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DOI：

10.3791/70412

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2026年2月24日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, UPR- Medical Sciences Campus, 2Molecular Sciences Research Center

この記事について

サマリー

ここでは、 Astyanax mexicanus の表面および洞窟適応型形態の脳および腸全体成分を解剖・抽出するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、トランスクリプトミクス、メタボロミクス、腸内細菌叢解析などの後継用途にも適応可能です。

要約

硬骨魚は、発生学から遺伝学、神経科学に至るまで幅広い研究課題に答えるために用いられており、近年では腸-脳軸、さらにはより広い文脈では腸-脳-肝軸の複雑さを理解するためにも利用されています。メキシコのテトラ( Astyanax mexicanus)は、形態学的・生理学的に異なる形態型、例えば川に生息する表層魚や洞窟適応型の盲目洞窟魚などが存在するため、比較進化および発生進化の枠組みでますます利用されています。洞窟生息地への適応は、実験室でも見られる形態的形質、行動形質、腸内細菌多様性の変化と関連しています。これにより、マイクロバイオーム、代謝活動、神経適応、複雑な行動出力の相互作用について問いを投げかける可能性が生まれました。これらの相互作用は、クリアされた脳を用いた全脳マッピング研究や腸内細菌叢のシーケンスによって、表面および洞窟適応表現型に関連する細菌の多様性を検出することで対処可能となっています。しかし、これらの研究の多くは、無傷で慎重に解剖され保存された臓器や組織全体を保存することで、後処理の応用に活用できる恩恵を受けます。このプロトコルは、脳と腸の解剖のための段階的な方法を説明しており、表面魚類と洞窟魚の形態型の両方に対して脳と腹部臓器全体を摘出・分離します。

概要

脊椎動物の魚を含む動物モデルは、比較的単純でアクセスしやすいシステムで生物学的現象や複雑な病理をモデル化する重要なツールです。例えば、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は最も広く使われている硬骨魚のモデルの一つであり、その発生、遺伝学、生理学、行動を研究するために多くの手法が適用されており、生物医学や神経行動学に大きな影響を与えています。1,2,3,4,5,6,7,8 .現在ゼブラフィッシュを使用する大きな利点は、機能喪失変異株の器官や組織の組織学および病理を研究するための複数の方法が利用可能であり、段階的な解剖プロトコルが3,9,10として存在することです。

しかし、過去数十年で進化生物学の分野、例えば11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21、老化の生物学的メカニズムなど、他の種類の質問を投げかけるのに適したテレオスト魚モデルが増えています2,22、毒物学23,24、その他25,26。その例として、メキシコテトラ(Astyanax mexicanus)が挙げられます。これはメキシコ北東部原産の硬骨魚で、川面に生息する表層魚の祖先集団と、30以上の盲目の洞窟洞窟魚の個体群が存在します(図1)12。

洞窟魚は、眼の喪失12,27、色素沈着の喪失28、感覚系の拡張17,29,30、脂肪蓄積の増加12,31など、一連の形態的特徴を適応させ、過酷な洞窟環境でも生き延びることを可能にしました。これらの魚はまた、睡眠の減少19,20、不安の減少32、群れの減少の33、攻撃性の減少(13,18,19,20,29,34,35,36,37)などの行動特性も適応しました、彼らの祖先の表層魚と比べて。これらの特徴の適応は、遺伝的多様性と環境的圧力(35、36、28、川や洞窟間の生息地の違いを含む)の組み合わせによると考えられます。遺伝的変異が形態学的および行動的形質適応に与える影響について問うためのますます有用なモデル 16,18,19,20,35,38,39 および最近では腸内細菌叢の多様性への影響 14,15脳、腸、肝臓などの臓器の収集を必要とする問題には、コミュニティ全体で利用可能な標準化された大体解剖学の解剖プロトコルが必要です。A. mexicanusにおける全脳解剖や臓器解剖は以前にも行われてきましたが、これらの解剖を時間効率よく行う方法を理解できる包括的なワンストップ方法が欠如しており、これは代謝学40、メタゲノミクス41のサンプル採取を必要とする多くのプロジェクトにおいて重要です。 または全臓器画像16,38。このモデルで臓器にアクセスした後処理を行う際のトラブルシューティングの壁を取り除き、コミュニティのユーザーがスムーズに研究に集中できるようにすることです。

本プロトコルでは、 Astyanax mexicanus種の成魚表層魚およびパチョン洞窟魚の脳および消化管解剖のための段階的な解明方法を示します。この手法は、腸内マイクロバイオーム、組織代謝学、ライトシート顕微鏡による全脳イメージングのための脳クリアリングなど、さまざまな下流プロトコルに適応可能です。この技術は同じ試料に同時に適用することも可能です。

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プロトコル

このプロトコルは、IACUC承認のプロトコル2024-0004およびプエルトリコ大学の分子科学センターおよび医科キャンパスでA790125に従って実施されています。

1. 解剖前セットアップ

  1. シルガード・ペトリ(SP)皿で解剖する場合は、定着までに数日かかることを考慮して、事前に準備を整えておくことが重要です。
  2. SP皿を作るには、シルガード184とエラストマー184を10:1の比率で使います。使い捨てカップに200gのSylgard 184ベースと20gのエラストマーを混ぜます。ペトリ皿に約3分の1から1/2の深さまで注ぎます。泡を取るために皿を軽く叩き、蓋を外します。食器はしっかりと満たし、平らな場所に置いてください。少なくとも1週間42分は硬化させてください。
    注意:16s rRNAシーケンスやメタゲノミクスのサンプル採取を行う場合は、SPディッシュの使用を控えてください。代わりに、滅菌済みの使い捨てペトリプレートを使用し、層流フードの下で無菌技術を用いてください。無菌技術を採用する場合は、70%エタノール(殺菌剤)で層流フードを清掃し、理想的には殺菌性紫外線Cランプに15分間曝露することが推奨されます。これは、消毒済みでオートクレーブされた素材や工具をラミナーフローフード内に設置する前に行うべきです。
  3. 解剖顕微鏡を設置し、両側にペーパータオルを敷いてください。片側は廃棄物の保管(例:余剰臓器組織)用に、もう片側は滅菌済みの解剖器具を置くために指定してください。解剖の合間に工具をきれいにするために小さなペーパータオルを切って掃除してください。
  4. PBSを1個準備し、冷たい氷のスラリーに入れて保管し、必要に応じて視界を良くするために場所や標本を清めるために手元に置いておく。プロトコルによっては、1PBSを使わない選択をしてください。
    注意:例えば、メタゲノムシーケンシング43のサンプル採取時には使用しないことが推奨されます。この種のアプローチで1PBSを使用する場合、汚染の可能性をスクリーニングするためにシーケンスのために1PBSサンプルを採取することが推奨されます。
  5. SP(または使い捨ての滅菌済みペトリ皿)を顕微鏡の下に置き、解剖キットや氷上での組織採取用のマイクロ遠心分離管など、すべての道具を手元に用意してください。
  6. 近くの氷バケツにPBSとラベル付きのマイクロ遠心分離機チューブを置きます。プラスチック製のスポイトを手に1PBS分のものを用意してください。
  7. 近くに魚の安楽死ステーションを設置してください。氷水浴を準備します。プラスチック製のグレート付きの水槽にアイススラリーを入れ、魚のシステム用水(自宅の水槽)で満たします。
    注:MS-222も使用可能ですが、下流プロトコル(サンプル後処理の必要性)によって異なります。

2. 成魚の表層魚および洞窟魚の脳解剖

  1. 魚を氷のスラリーで安楽死させてください。動きがないようにし、魚が底に沈み、オペラルの動きがなければいい。時間はサイズによって変わります。大きな魚はオペラルの動きを止めるのに時間がかかります。
    注:幼魚は閉鎖の動き(安楽死)を停止するまでに約2〜5分かかりますが、成魚や大型魚は約10〜15分かかることがあります。形態型に基づく違いは存在します。洞窟魚の個体群によっては、表層魚よりも麻酔や安楽死に時間がかかる場合があります。飼育および実験プロトコルでは、形態や集団間で反応が異なる可能性があるため、麻酔および安楽死の手技の検証が集団全体で推奨されています11。
  2. 魚をSP(フード内の使い捨て滅菌ペトリ皿)に移し、スポイトで氷冷の1xPBSで入浴します(図1)。
  3. エラの約2mm後方でメスで切断し、頭部を体から切り離します(図2)。これにより中脳の一部が保護され、解剖後に脳を操作しても損傷を与えません。遺体をペーパータオルで廃棄物エリアに運び、バイオハザードバッグに入れてバイオハザード廃棄物容器に入れて処分します。
  4. 細かい鉗子や止血鉗で魚の頭部の後方をしっかり掴みます。マイクロハサミで口の縁を頭の後ろとえらに切ります(図3)。
  5. 反対側でも同じことを繰り返します。下顎を取り外し、次に2組目の細かい鉗子または超細かい鉗子で裏側をしっかり洗浄してください。
    注意:えらの内側の輪郭に沿って進めてください。
  6. この時点で、止血器で魚の頭をしっかり掴むか、Tピンで魚をSP(使う場合は)で口の先端を慎重に固定してください。
  7. 両目を超細かい鉗子やハサミで切り離してください。先端を目の縁に差し込み、そっと目を引っ張るか切り取る(図4)。
    注意:ケイブフィッシュ(目の皮膚をこすり落とす部分)には適用されません。
  8. 頭頂部に矢状状線を引っかき、目の間を前後に走らせて頭を左右に分けます。その後、マイクロハサミで線を浅く切ります(図5)。
  9. 細かい鉗子で、頭部の両側を慎重に引き抜き始めます。脳が結合組織の下に埋まっている部分を壊さないよう特に注意してください。脳が見えるようになったら、超細い鉗子の先端で脳を頭蓋から切り離します(図6)。
    1. 鉗子で脳を押しつぶすのは避けてください。代わりに、その残留物が残っている場合は後脳や脊髄に当てて持って、その残存物を保ちましょう。
    2. 脳がまだ頭の片側にある場合は、超細かい鉗子を使って、脳の先端を優しく脳の後ろに差し込み、そっと持ち上げて慎重に脳を床の頭蓋骨から外してください。常に引っ張るのは避けてください。壊れるかもしれません。
  10. 脳を摘出したら、超細かい鉗子で優しく洗浄し、脂肪や周囲の組織を取り除きます。マイクロ遠心分離機管または適切な保管場所に入れて、下流プロトコルを行ってください。この時点で、脳全体を保存するか、脳のサブ領域(例:端脳、視蓋、嗅球)を収集します(図7)。
  11. テレネファロン分離:テレネファロンを抽出するために、超細かい鉗子でテレンセファロンと視頂蓋の間の基部をつまみ、テレネフロンを脳の他の部分から分離します。適切な保管管に移してください。
  12. メタゲノミクスに使用する場合は、液体窒素でサンプルを急凍し、-80°Cで保存します。 マイクロ遠心分離機のチューブを液体窒素に5秒浸して行う。

図1
図1: Astyanax mexicanus の形態型。 (A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚。スケールバー:10 mm この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:頭部の剥離。 (A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚 この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:切り離された魚の頭部から顎を取り除く様子。 (A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚 この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:外れた魚の頭部から目を取り除く様子。 洞窟魚では、組織を薄めるためにその部位をこすり取ることができます。(A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚 この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:魚頭の上部を切り抜ける矢状状体。 (A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚。スケールバー:5 mm このフィギュアの拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6
図6:頭部の外側部分の分離と脳の頭蓋腔内での露出。(A) 表層魚類。(B)パチョン洞窟魚。(C,D)頭蓋骨床からの脳の摘出。スケールバー:5 mm このフィギュアの拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7
図7: A. mexicanus の地域部脳解剖学。 (A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚。スケールバー:5 mm このフィギュアの拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. 成魚の表層魚および洞窟魚の腸解剖

  1. 上記の安楽死の方法に従います。
  2. 魚を綿ずくりのないワイプで軽く拭き、きれいなSP(スポイト)に置き、スポイトで氷のように冷たい1PBS(または下流の水)で組織を湿らせます。
  3. 魚をSPに固定してください(使っている場合は)Tピンで。
    1. SP(睡眠止め)を使わない場合は、切開時に口の前方を強く掴む止血鉗で十分です。ピンは眼窩の前方に差し込み(洞窟魚でも同様)、ピンがSPに届くようにします。
    2. 尾からプレートに後方でピンを固定します。作業中は魚がじっとしていることを確認してください。
      注意:脳解剖と同じ標本で消化管解剖を行う場合は、解剖を開始して魚をプレート表面に固定する前に、迅速にメスで首を切断してください。蓋の後ろに前方斜めに切開し、頭頂部を保ち腸を避けます。理想的には、頭と体を分けて、経験豊富な2人の解剖者がそれぞれ作業を担当し、時間効率を保つべきです。前方ピンは切断後、体の最上部前方に位置し、後方のピンは同じ位置に残ります(図8)。
  4. 解剖マイクロハサミを使い、肛門ひれ/肛門から鰓の硬い被覆(オカルクルム)にかけて腹側正中線に沿って、魚の裏側曲線に沿って半円形の線で皮膚と下部の筋肉を切断します(図9)。
  5. マイクロハサミと細かい鉗子で蓋蓋と胸鰭を除去します。
    注意:このステップは皮膚の除去を効率化するのに役立ちますが、解剖が遅くなる場合があり、必要に応じて省略されることもあります。
  6. 臀ひれから皮膚と下の筋肉を上方から切り、必要に応じて腹側切開を延長しながらエラに向かって前方に切ります(図10)。これが最終的に窓を生み出します。
  7. 細かい鉗子を使って切開部を開き、体腔を露出させます。細かい鉗子で皮膚を掴み、優しく持ち上げて除去します(図11)。
  8. 腸の前後の付着部を切り取り、内臓をすべて慎重に取り出します。消化管系を体から取り出し、SP(または使い捨ての滅菌済みペトリ皿)のきれいな場所に置きます(図12 および 図13)。
  9. まず、超細かい鉗子で肝臓を腹部の他の臓器から分離します。肝臓を分離する場合は、マイクロ遠心分離機管に入れるか、下流のプロトコルや必要に応じて適切な保存方法を用いてください。腸を慎重に伸ばし、胃と中腸・後腸の部分を特定します(図14)。
  10. 胃を中腸・後腸から切り離します。
  11. 細かい鉗子で中腸と後方の端を握り、優しく伸ばして全長まで伸ばします。
  12. 組織をマイクロ遠心分離機チューブに採取し、適切に保管してください。
  13. メタゲノミクスに使用する場合は、液体窒素でサンプルを急凍し、-80°Cで保存します。 これはマイクロ遠心分離機チューブを液体窒素に5秒浸すことで行われます。

図8
図8:消化管解離のためのピン配置。(A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚 この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

図9
図9:解剖前の裏側切断。 (A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚 この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

図10
図10:オペルクルムの除去と窓の形成。 (A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚 この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

図11
図11:表層の外側皮膚と筋肉の除去。 (A) 表層魚類。(B)パチョン洞窟魚 この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

図12
図12:筋肉と皮膚を除去した後の成魚の体腔内の 臓 器。 (A) 腹部が露出し、卵を取り出して臓器を露出させたメスの表層魚。(b) 腹部と臓器が露出したオスの表層魚。(c) 腹腔が露出し、卵を取り出して臓器を露出させたメスのパチョン洞窟魚。(D) 腹部と臓器を持つオスのパチョン洞窟魚。黒い矢印は消化管束がある領域を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図13
図13:魚の体腔から取り出された消化管束。 (A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚。スケールバー:10 mm この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

図14
図14:表層魚および洞窟魚の孤立した消化管器官。 (A) 表層魚。(B)パチョン洞窟魚。スケールバー:10 mm この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

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結果

このプロトコルに従い、脳および腸の内容物を抽出し、腸、端脳、視蓋の長さを測定して表層魚類とパチョン洞窟魚の形態型を比較しました(図15)。統計比較には独立標本ウェルチのt検定を用い、n=6匹の表層魚とn=6匹のパチョン洞窟魚を標本サイズで使用しました。表層魚はパチョン洞窟魚よりも視頂蓋の大きさが著しく大きく、これは以前に発表された脳登録プロトコル16.38と一致し、表層魚の方が体長も大きい(表層魚=2.53 ±± 0.30 mm;パチョン洞窟魚 = 1.82 ±± 0.25 mm;t = −4.44、p = 0.00137;コーエンズ d = 2.56)、また表層魚の幅も大きい(表層魚 = 4.29 ±± 0.49 mm;パチョン洞窟魚 3.17 ±± 0.42 mm;t = −4.24、p = 0.00179;コーエンのd = 2.45...

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ディスカッション

進化から生物医学神経科学、微生物学に至るまで、A. mexicanusが研究モデルとしてますます重要になっている中で、標準化された臓器解剖および採取方法の導入が求められています。単独構造は以前に研究・記録されており、視視頂蓋16,38、成体の心臓11、その他11,44などが挙げられますが、この種の表層魚類や洞窟魚の効率的に解剖された臓器から再現可能な結果を再現させる体系的なガイドラインは欠けています。これらのガイドラインは、臓器採取の標準化されたプロトコルを提供し、メキシコテトラの両形態型の解剖学に関するワンストップリソースを提供することで、これらのモデルに取り組む研究コミュニティ全体に利益をもたらすでしょう。これらの理由から、私たちはA. mexicanus

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開示事項

利益相反はありません。すべての手技はIACUC承認のプロトコル2024-0004に準拠しています。

謝辞

この研究はNIH助成金5R16EY037336-02、RCMI助成金U54 MD007600、NIH助成金1P20GM156713-01(COBREプエルトリコ微生物叢科学センター)によって資金提供されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.0リッターゼブラフィッシュ繁殖タンクテクニプラストhttps://shop.tecniplastusa.com/products/1-0-liter-zebrafish-breeding-tank安楽死用のアイススラリーを準備するために。タンクは氷で半分満たされ、その上に穴あきの内部タンクが置かれます。その後、水を上まで満たします。
4LポリウレタンアイスパンUSAサイエンティフィック項目 #2328-7242
バイオハザード廃棄物袋フィッシャーブランド14-828-244
Calbiochem OmniPur PBS 10x液体濃縮液、分子生物学グレード、滅菌ミリポーアシグマ65074L
解剖顕微鏡 オリンパスSZ51オリンパス OLSZ51NPS-LED/R
組織鉗子の解離フィッシャーブランド08-953G
解剖ピン、100パックホームサイエンスツールhttps://www.homesciencetools.com/product/dissection-pins-100-pack/?srsltid=AfmBOoofk8r6_hd4nx_7bjjP2
GzkNBlnOJ3vUKor5
rFCJvVxPN9xRlpc
鉗子、デリケート、エクストラファインシャープチップ モペックAB132
鉗子、ティッシュ、繊細な超細い先端モペックAB047
止血鉗、12.5cm、まっすぐワールド・プレシジョン・インスツルメンツhttps://wpiinc.com/products/var-15920-halsted-mosquito-hemostatic-forceps
ジュエラーズのピンセット、デュモンNo.5ミリポーアシグマhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f6521
キムワイプズ EX-Lキンバリー・クラーク34155
液体窒素提供:機関
ノイズマイクロハサミ、12cmワールド・プレシジョン・インスツルメンツ500228
ペーパータオル提供:機関
クリア蓋付きペトリ皿、95mm、15mm、丸型フィッシャーブランドFB0875714G
スカルペルブレード、#22、10パックホームサイエンスツールhttps://www.homesciencetools.com/product/scalpel-blades-22-10-pack/
メスのハンドル#4サーテックスhttps://surtex-instruments.com/product/scalpel-handle-no-4/
ハサミ、虹彩解剖モペックAA146
ハサミ、スーパーファインマイクロモペックAA152
標準的な使い捨てトランスファーピペットサーモ・サイエンティフィック13-711-9D
無菌エッペンドルフマイクロ遠心分離機1.5およびマイクロ;Lチューブエッペンドルフ05-402-25
シルガルド 184電子顕微鏡科学24236-10
サーモフラスクラボライン・インスツルメンツ社2119
ウルトラファインシザーズNEWMED計器NM-DI-206023
電気泳動に適した水、PCRシグマ・オルドリッチW4502-1L

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